Türkçe       English

<< Geri Yazdır
Doi No: 10.5578/mb.67019

Akut Bakteriyel Menenjit Tanısı ve Neisseria meningitidis Serogruplandırmasında
Gerçek Zamanlı Multipleks Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Optimizasyonu

Optimization of Real-Time Multiplex Polymerase Chain Reaction for the Diagnosis of
Acute Bacterial Meningitis and Neisseria meningitidis Serogrouping

Dilek GÜLDEMİR1, Meral TURAN2, Zekiye BAKKALOĞLU1, Selin NAR ÖTGÜN2, Rıza DURMAZ3


1 Halk Sağlığı Genel Müdürlüğü, Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarları Daire Başkanlığı, Ulusal Moleküler Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarı, Ankara.

1 General Directorate of Public Health Turkey, Department of Microbiology Reference Laboratories, National Molecular Microbiology Reference Laboratory, Ankara, Turkey.

2 Halk Sağlığı Genel Müdürlüğü, Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarları Daire Başkanlığı, Ulusal Solunum Yolu Patojenleri Referans Laboratuvarı, Ankara.

2 General Directorate of Public Health Turkey, Department of Microbiology Reference Laboratories, National Respiratory Pathogens Reference Laboratory, Ankara, Turkey.

3 Yıldırım Beyazıt Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

3 Yıldırım Beyazıt University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

ÖZ

Akut bakteriyel menenjitlerin %80-85'inden Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis ve Haemophilus influenzae tip B sorumlu olup, ülkemizde bu etkenlere bağlı bakteriyel menenjitlerin bildirimi zorunludur. Son yıllarda ülkemizdeki hastalık kontrol programları özellikle bu üç etkene yönelmiştir. Menenjite yol açan etkeni belirlemek korunma/kontrol önlemleri, tedavi rejimi, hastalığın şiddeti ve seyri hakkında öngörüde bulunabilmek açısından önem taşımaktadır. Meningokoksik menenjitin hızlı tanısı özellikle hayati öneme sahiptir. Ayrıca, toplumdaki N.meningitidis serogruplarının belirlenmesi, uygulanacak olan aşı tipi ve kombinasyonuna karar verilmesi açısından da önem arz etmektedir. Bu çalışma,  klinik örneklerde hızlı, güvenilir bir şekilde enfeksiyon etkenini belirlemek ve serogrup tayini yapmak üzere gerçek zamanlı multipleks polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-multipleks PCR) yöntemini optimize etmek amacıyla yapılmıştır. Bu çalışmada N.meningitidis, H.influenzae ve S.pneumoniae'nın birlikte (NHS miks) araştırılmasına ve N.meningitidis'in serogruplandırılmasına (BCY miks ve AWX miks) yönelik üç Rt-multipleks PCR testi laboratuvarımızda optimize ve standardize edilmiştir. Rt-multipleks PCR yönteminin duyarlılığı, standart bakteri suşları ve simülasyon çalışmalarıyla araştırılmıştır. Temmuz 2012-Mayıs 2014 tarihleri arasında "Ulusal Moleküler Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarı (UMMRL)"na gönderilen akut bakteriyel menenjit şüpheli 41'i beyin omurilik sıvısı (BOS) olmak üzere 43 hastaya ait örnek (BOS, serum ve klinik izolat) ve altı adet nazofarengeal sürüntü izolatı bu çalışmaya dahil edilmiştir. Tüm örnekler Rt-multipleks PCR testleriyle incelenmiştir. İzolatlar hem konvansiyonel hem de Rt-multipleks PCR yöntemiyle çalışılmıştır. Oksidaz, katalaz testi, Gram boyama, API-NH ve spesifik antiserumlarla aglütinasyon testleri Ulusal Solunum Yolu Patojenleri Referans Laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. Optimize ve standardize edilen Rt-multipleks PCR yönteminin bakteri saptama limitinin 102 cfu/ml olduğu tespit edilmiştir. Bu dilüsyondaki "threshold cycle (TC)" değerinin yaklaşık 35 olduğu hesaplanmıştır. BOS örneklerinden 14'ünde NHS miks ile N.meningitidis saptanmış ancak, bunlardan 10 tanesi BCY miks ve AWX miks ile tiplendirilebilmiştir. Serogruplaması yapılan 10 klinik örneğin 8 (%80)'i serogrup B, 1  (%10)'i serogrup A, 1 (%10)'i serogrup W135X olarak belirlenmiştir. Rt-multipleks PCR testleri ile izolatların tümünün (altı nazofarengeal izolat ve bir klinik izolat) N.meningitidis serogrup B olduğu saptanmış ve konvansiyonel yöntemlerle de doğrulanmıştır. TC değeri > 35 olan BOS örnekleri tiplendirilememiştir. Rt-multipleks PCR yönteminin NHS'ye bağlı akut bakteriyel menenjitin doğrudan klinik örnekten yapılacak tanısında ve N.meningitidis'in  serogruplandırılmasında hızlı ve güvenilir bir test olduğu belirlenmiştir. Hızlı tanı hastalığın tedavisi ve kontrolü açısından, etkenin serogruplandırılması ise korunma/kontrol ve aşı politikaları açısından önem arz etmektedir.

Anahtar sözcükler: Gerçek zamanlı multipleks polimeraz zincir reaksiyonu; akut bakteriyel menenjit; Neisseria meningitidis serogrup tayini.

ABSTRACT

Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis and Haemophilus influenzae type B are responsible for about 80-85% of acute bacterial meningitis cases among adults and in our country it is mandatory to report bacterial meningitis cases caused by these agents. In recent years, disease control programs have focused especially on these three pathogens in our country. It is very important to know the causative agent of meningitis for prevention/control measures, choice of treatment regimen, and prediction of the severity and the course of the disease. Rapid diagnosis of meningococcal meningitis is especially vital. In addition, the identification of N.meningitidis serogroups in the community is also important  for  the decision of the type and combination of vaccine to be administered. The aim of this study  was to optimize the real-time multiplex polymerase chain reaction (Rt-multiplex PCR) for the diagnosis of the disease and serogrouping of N.meningitidis in clinical samples in a direct, quick and reliable way. In this study, three Rt-multiplex PCR assays were optimized and standardized for the detection of N.meningitidis, H.influenzae and S.pneumoniae (NHS mix) and for the serogrouping of N.meningitidis (BCY mix and AWX mix) in our laboratory. Sensitivity of the Rt-multiplex PCR method was  detected by reference strains and simulation studies. Forty three samples (41 cerebrospinal fluid (CSF), 1 serum and 1 clinical isolate) with the suspicion of acute bacterial meningitis and six nasopharyngeal isolates sent to National Reference Laboratory for Molecular Microbiology between July 2012-May 2014 were included in the present study. All samples were examined with the Rt-multiplex PCR methods. Clinical isolates were studied by both conventional and Rt-multiplex PCR methods. Oxidase, catalase test, Gram stain, API-NH and agglutination tests with specific antisera were performed in the National Respiratory Pathogens Reference Laboratory. The detection limit of the method, which was optimized and standardized in our laboratory was determined as 102 cfu/ml. The CT (threshold cycle) value in this dilution was  detected approximately as 35. N.meningitidis was detected in 14 of the 41 CSF samples by the NHS mix. However, only 10 of the positive samples could be typed with BCY mix and AWX mix. Eight (80%) of them were serogroup B,  one of each was (10%) serogroup A and serogroup W135, respectively. All the isolates (six nasopharyngeal and one clinical specimen) were identified as N.meningitidis serogroup B by Rt-multiplex PCR and the isolates were also confirmed by conventional methods. The CSF specimens with CT value > 35 could not be typed. We  concluded that the Rt-multiplex PCR method is a rapid and reliable test for the direct diagnosis of acute bacterial meningitis due to NHS and  serogrouping of N.meningitidis. Rapid diagnosis plays an important role for the treatment and control of the disease, and serogrouping of the agent plays an important role in terms of prevention/control and vaccination policies.

Keywords: Real-time multiplex polymerase chain reaction; acute bacterial meningitis, Neisseria meningitidis serogrouping.

Geliş Tarihi (Received): 31.01.2018 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 22.03.2018

İletişim (Correspondence):

Uzm. Dr. Dilek Güldemir,

Türkiye Halk Sağlığı Genel Müdürlüğü,

Ulusal Moleküler Mikrobiyoloji Referans Merkez Laboratuvarı,

Ankara. Adnan Saygun Cad. No: 55 E Blok, 1. kat,

Sıhhiye 06100 Ankara,Türkiye.

Tel (Phone): +90 505 261 74 79,

E-posta (E-mail): dilekg06@yahoo.com.tr

[ Tam metin ][ PDF ]
<< Geri Yazdır