Türkçe       English

<< Geri Yazdır
Doi No: 10.5578/mb.4302
Vajinal Candida glabrata İzolatlarının Mikrosatellit Gösterge Analizi ile Genotiplendirilmesi ve DNA Dizi Analizi ile Antifungal Direnç ile İlişkili Mutasyonların Belirlenmesi

Vajinal Candida glabrata İzolatlarının Mikrosatellit Gösterge Analizi ile Genotiplendirilmesi ve
DNA Dizi Analizi ile Antifungal Direnç ile İlişkili Mutasyonların Belirlenmesi*

Genotyping of Vaginal Candida glabrata Isolates Using Microsatellite Marker Analysis and
DNA Sequencing to Identify Mutations Associated with Antifungal Resistance

Aylin DÖĞEN1, Hüseyin DURUKAN2, Ahmet Barış GÜZEL3, Zehra ÖKSÜZ1, Engin KAPLAN4, Mehmet Sami SERİN1,
Ayşe SERİN5, Gürol EMEKDAŞ6, Gönül ASLAN6, Seda TEZCAN6, Ayşe KALKANCI7, Macit İLKİT8

1 Mersin Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Mersin.

1 Mersin University Faculty of Pharmacy, Department of Pharmaceutical Microbiology, Mersin, Turkey.

2 Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı, Mersin.

2 Mersin University Faculty of Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Mersin, Turkey.

3 Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi, Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı, Adana.

3 Cukurova University Faculty of Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Adana, Turkey.

4 Mersin Üniversitesi İleri Teknoloji Eğitim Araştırma ve Uygulama Merkezi, Mersin.

4 Mersin University, Advanced Technology Research and Practice Center, Mersin, Turkey.

5 Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi, Adli Tıp Anabilim Dalı, Adana.

5 Cukurova University Faculty of Medicine, Department of Forensic Medicine, Adana, Turkey.

6 Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Mersin.

6 Mersin University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Mersin, Turkey.

7 Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

7 Gazi University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

8 Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Adana.

8 Cukurova University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Adana, Turkey.

* Bu çalışma, Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Proje Birimi tarafından [BAP ECZ F TEB (AD) 2010-5A] desteklenmiştir.

ÖZET

Vulvovajinal kandidoz, vajinitlerin en sık ikinci sebebi olup (%17-39), hemen daima ilk sırada yer alan (%22-50) bakteri vajinitini izlemektedir. Tanı genellikle klinik olarak, mikolojik doğrulama testleri yapılmaksızın konulduğundan ve ampirik tedavi uygulandığından vulvovajinal kandidozun gerçek insidansı bilinmemektedir. Vulvovajinal kandidozda olguların %70-90'ında etken Candida albicans'dır, ancak son yıllarda albicans dışı Candida türlerinde, özellikle de C.glabrata enfeksiyonlarında artış dikkati çekmektedir. Azol ilaç tedavisine azalmış duyarlılığı nedeniyle C.glabrata enfeksiyonlarının klinik önemi artmış olup epidemiyoloji ve popülasyonuna ilişkin bilgiler sınırlıdır. Bu çalışmada, Çukurova Bölgesinde vajinal örneklerden izole edilen C.glabrata izolatlarının mikrosatellit göstergeler ile genotiplendirilmesi, antifungal duyarlılık profilinin araştırılması ve fenotipik azol direncine neden olabilen moleküler mekanizmaların belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, akut (n= 11) ve rekürren (n= 14) vulvovajinal kandidoz tanılı olgular ile vajinit bulgusu olmayan kontrol grubundan (n= 9) izole edilen 34 vajinal C.glabrata suşu ve referans C.glabrata CBS 138 (ATCC 2001) suşu olmak üzere birbirleriyle ilişkisiz toplam 35 C.glabrata suşu dahil edilmiştir. Bu izolatlar, üç mikrosatellit göstergenin (RPM2, MTI ve Cg6), değişken sayıdaki uç tekrarlarındaki farklılıklarına dayalı, çoklu lokus gösterge analizi (Multiple-locus variable number tandem repeat analysis) ile genotiplendirilmiştir. Mikrosatellit gösterge analizi, RPM2, MTI ve Cg6 mikrosatellitlerinin PCR amplifikasyonu ve elde edilen ürünlerin kapiller elektroforezi ile yapılan fragment uzunluk analizi ile gerçekleştirilmiştir. Her bir suş için, bir gen (CgERG11) ve dört lokus (CgPDR1, NTM1, TRP1 ve URA3)'un DNA dizi analizleri yapılmış ve antifungal direnç ile ilişkili olabilecek mutasyonlar araştırılmıştır. CLSI M27-A3 belgesine göre 13 antifungal ilaç ve borik asidin in vitro duyarlılık profili belirlenmiş ve fenotipik ilaç direnci ile genotip ve belirlenen mutasyonlar arasındaki olası ilişki sorgulanmıştır. Çalışmamızda, C.glabrata CBS 138 suşu tüm antifungal ilaçlara duyarlı bulunmuş; 34 vajinal C.glabrata izolatından 1 (%2.9)'i flukonazol, 13 (%38.2)'ü itrakonazol ve 3 (%8.8)'ü vorikonazole doza bağlı duyarlı olarak saptanmış; bu antifungallere karşı dirençli izolata rastlanmamıştır. Klotrimazol direnci ise yalnızca 3 (%8.8) suşta izlenmiş; ancak genotip ve fenotipik direnç arasında ilişki olmadığı belirlenmiştir (p> 0.05). Mikrosatellit gösterge analizine göre 13 farklı genotip saptanmış ve yöntemin ayırt etme gücü yüksek (DP= 0.877) bulunmuştur. Sonuç olarak, C.glabrata izolatlarının genotiplendirmesinde mikrosatellit gösterge analizinin hızlı ve uygulanabilir bir yöntem olduğu, ancak ayırt etme gücünün yüksek olmakla birlikte ideal olmadığı belirlenmiştir. Fenotipik direnç testi ile mutasyon arasındaki ilişkinin doğrulanması için daha geniş örnek hacmine sahip, ileri çalışmaların yapılması gerektiği düşünülmüştür.

Anahtar sözcükler: Candida glabrata; genotiplendirme; antifungal test; flukonazol; klotrimazol; mikrosatellit gösterge; vajinit; kandidoz.

ABSTRACT

Vulvovaginal candidosis is the second most common cause of vaginitis (17-39%) after bacterial vaginosis (22-50%). Since the diagnosis of vulvovaginal candidosis mainly depends on clinical findings without mycologic confirmatory tests and treated empirically, the actual incidence rate of vulvovaginal candidosis is unknown. Approximately 70-90% of vulvovaginal candidosis cases are caused by Candida albicans, however the increasing incidence of C.glabrata infections and its reduced susceptibility to azole drug therapy have generated increasing attention. The epidemiology and population structure of vulvovaginal candidosis due to C.glabrata are poorly characterized. This study was aimed to genotype the C.glabrata strains isolated from vaginal samples in Cukurova region, Turkey by microsatellite markers, to investigate the antifungal susceptibility profiles of the strains and to determine the molecular mechanisms leading to phenotypical azole resistance. A total of 34 unrelated vaginal C.glabrata strains isolated from patients with acute (n= 11) and recurrent (n= 14) vulvovaginal candidosis, control group (n= 9) without vaginitis symptoms, and a reference strain of C.glabrata CBS 138 (ATCC 2001) were included in the study. These isolates were genotyped using multiple-locus variable number tandem repeat analysis of three microsatellite markers (RPM2, MTI, and Cg6). Analysis of microsatellite markers was performed by fragment size determination of RPM2, MTI, and Cg6 PCR products through capillary electrophoresis. For each of the evaluated strains, DNA sequence analysis was performed for one gene (CgERG11) and four loci (CgPDR1, NTM1, TRP1, and URA3) to detect mutations possibly associated with antifungal resistance in each strain. In vitro susceptibility profiles of the strains to 13 antifungals and boric acid were determined according to CLSI document M27-A3 to investigate possible relationships between detected mutations and phenotypic resistance. C.glabrata CBS 138 strain was found to be susceptible to all the antifungals tested, while one of (%2.9) 34 vaginal C.glabrata isolates was found to be dose-dependent susceptible to fluconazole, 13 (38.2%) to itraconazole and 3 (8.8%) to voriconazole. No resistant strain were detected in the study population. Only three isolates were found to be resistant to clotrimazole (8.8%), however no relationship was identified between the genotypes and phenotypic resistance (p> 0.05). Thirteen genotypes were detected by microsatellite marker analysis, with high discrimination power (DP= 0.877). As a result, microsatellite marker analysis was validated as a rapid, reliable method for genotyping C.glabrata strains with good, but not optimal discriminatory power. Further studies examining larger numbers of isolates are needed to verify possible relationships between mutations and phenotypic resistance.

Key words: Candida glabrata; genotyping; antifungal testing; fluconazole; clotrimazole; microsatellite marker; vaginitis; candidosis.

Geliş Tarihi (Received): 07.08.2012 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 29.09.2012

İletişim (Correspondence):

Yrd. Doç. Dr. Aylin Döğen,

Mersin Üniversitesi Eczacılık Fakültesi,

Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

33169 Yenişehir, Mersin, Türkiye.

Tel (Phone): 90 324 3412815,

E-posta (E-mail): aylinats@hotmail.com

[ Tam metin ][ PDF ]
<< Geri Yazdır