Yazd�r

Onikomikozlu Olgular�n Direkt T�rnak Kaz�nt� �rneklerinden DNA �zolasyonu ve
Ger�ek Zamanl� Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Trichophyton rubrum Tan�mlanmas�*

DNA Extraction and Identification of Trichophyton rubrum by Real-Time
Polymerase Chain Reaction from Direct Nail Scraping Specimens of Patients with Onycomycosis

Elife BERK1, Semra KU�T�MUR2, Ay�e KALKANCI2, O. Murat �ZTA�3

1 SB Kayseri E�itim ve Ara�t�rma Hastanesi, Mikrobiyoloji Klini�i, Kayseri.

1 Kayseri Research and Training Hospital, Microbiology Clinics, Kayseri, Turkey.

2 Gazi �niversitesi T�p Fak�ltesi, T�bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal�, Ankara.

2 Gazi University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

3 Gazi �niversitesi T�p Fak�ltesi, Dermatoloji Anabilim Dal�, Ankara.

3 Gazi University Faculty of Medicine, Department of Dermatology, Ankara, Turkey.

* Bu �al��ma, ilk yazar�n t�pta uzmanl�k tez �al��mas� olup, XXXIII. T�rk Mikrobiyoloji Kongresi (21-25 Ekim 2008, Bodrum)'nde sunulmu�tur.

�ZET

Trichophyton rubrum, onikomikoz etkenleri aras�nda en s�k kar��la��lan dermatofit t�rlerindendir. Dermatofitlerin rutin tan�s� direkt mikroskobik inceleme (DM�) ve k�lt�r y�ntemlerine dayanmakla birlikte, etkenin fenotipik olarak tan�mlanmas�ndaki sorunlar, molek�ler y�ntemlerin g�ndeme gelmesine neden olmu�tur. Bu �al��mada, onikomikoz �ikayetleri olan hastalar�n t�rnak �rneklerinde, T.rubrum'a �zg�l ger�ek zamanl� polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) y�nteminin tan�sal performans�n�n, direkt mikroskopi ve k�lt�r y�ntemleri ile kar��la�t�r�lmas� ve erken tan�ya olan katk�s�n�n de�erlendirilmesi ama�lanm��t�r. �al��maya, hastanemizin dermatoloji poliklini�ine el ve ayak t�rnaklar�nda renk/�ekil de�i�ikli�i ve kal�nla�ma �ikayetleriyle ba�vuran 58'i erkek 90 hasta ile kontrol olarak tamamen sa�l�kl� 20 g�n�ll� dahil edilmi�tir. Hasta ve kontrollerden al�nan t�rnak kaz�nt� �rnekleri, %15 potasyum hidroksit, dimetil s�lfoksit ve klorazol siyah� kar���m� ile direkt mikroskopik olarak incelenmi� ve siklohekzimit i�eren ve i�ermeyen Sabouraud dekstroz agarda k�lt�rleri yap�lm��t�r. DNA izolasyonu i�in t�rnak �rnekleri �elik bir par�alay�c� ile ezilmi� ve fenol-kloroform-izoamil alkol safla�t�rma y�ntemi uygulanm��t�r. T.rubrum DNA's�n�n �o�alt�lmas� ve g�sterilmesi, �zg�l primerler ve problarla TaqMan protokol� kullan�larak RT-PCR y�ntemi (LightCycler-Roche, ABD) ile yap�lm��t�r. DM� ile 72 hasta pozitif, 18 hasta ise negatif sonu� vermi�; DM� pozitif olan hastalar�n %27.8 (20/72)'inin k�lt�r�nde dermatofit �remesi olmu� ve t�m izolatlar T.rubrum olarak tan�mlanm��t�r. DM� negatif bulunan 18 �rne�in hi�birisinin k�lt�r�nde �reme olmam��t�r. DM� ile pozitif saptanan 72 hastan�n 67 (%93)'si ve DM� negatif bulunan 18 hastan�n 8 (%44.4)'i PCR ile pozitif sonu� vermi�tir. K�lt�r�nde T.rubrum �retilen t�m �rnekler (n= 20) PCR ile de pozitif bulunmu�tur. Sa�l�kl� t�rnaklara sahip 20 g�n�ll�den al�nan �rneklerin hepsi DM�, k�lt�r ve PCR ile negatif sonu� vermi�tir. PCR y�nteminin performans�, k�lt�rden daha y�ksek duyarl�l��a sahip olan DM� sonu�lar� ile kar��la�t�r�lm�� ve PCR'nin duyarl�l�k, �zg�ll�k, pozitif ve negatif prediktif de�erleri s�ras�yla; %93, %56, %89 ve %67 olarak hesaplanm��t�r. �al��mam�zda, RT-PCR'nin tan� a��s�ndan etkin ve h�zl� bir y�ntem oldu�u izlenmi�; maliyet a��s�ndan da her ne kadar pahal� gibi g�r�nse de alt yap�s� haz�r merkezlerde k�lt�r ile aras�nda �nemli bir fark olmayaca�� d���n�lm��t�r. Sonu� olarak, dermatofitlerin tan�s�nda molek�ler bir y�ntem kullan�larak t�rnak kaz�nt�s� gibi zor bir klinik �rnekten DNA elde edilebilmi�, rutin uygulamada kullan�labilecek bir protokol olu�turulmu� ve k�sa s�rede t�r tan�m� yap�labilmi�tir.

Anahtar s�zc�kler: Onikomikoz; Trichophyton rubrum; tan�; polimeraz zincir reaksiyonu; t�rnak kaz�nt�s�.

ABSTRACT

Trichophyton rubrum is the most frequently encountered dermatophyte species causing onichomycosis. The routine diagnosis of dermatophytes depends on the direct microscopic examination (DME) and culture methods, however due to the phenotypic identification problems related to those agents, the molecular methods come into question. The aim of this study was to evaluate the diagnostic performance of real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) for the identification of T.rubrum by comparing to DME and culture methods, from nail samples of patients with the complaints of onychomycosis. A total of 90 patients of whom 58 were male who were admitted to the dermatology outpatients clinics of our hospital with the complaints of color/shape changes in the nails and thickening of the nail, were included in the study, together with the 20 healthy volunteer subjects as controls. The nail scraping samples obtained from the patients and controls were examined with direct microscopy using 15% potassium hydroxide, dimethyl sulphoxide and chlorazole black mixture and cultivated onto Sabouraud dextrose agar with and without cycloheximide. For DNA isolation, after the disruption of nail samples with a steel tool, phenol-chloroform-isoamyl alcohol purification method were used. The amplification and demonstration of the T.rubrum DNA have been performed by using specific primers and probes following TaqMan protocol of RT-PCR (LightCycler-Roche, USA) method. Seventy-two of the patients yielded positive and 18 yielded negative results with DME. Growth of molds was detected in the cultures of 20 (27.8%) of the 72 DME positive patients and all of the isolates were identified as T.rubrum. No fungal growth was seen in the samples of 18 patients who were DME negative. In DME positive group, 67 (93%) patients were found to be positive in RT-PCR, while 8 (44.4%) patients were RT-PCR positive in DME negative group. All of the culture positive samples (n= 20) were also found positive in RT-PCR. All of the samples from the control group with healthy nails yielded negative results in DME, culture and RT-PCR methods. The performance of PCR method were compared to direct microscopy that had higher sensitivity than culture and the sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of RT-PCR assay were estimated as 93%, 56%, 89% and 67%, respectively. In conclusion RT-PCR was thought to be an efficient and rapid assay in the diagnosis of onichomycosis. Although RT-PCR seems more expensive than culture, for the centres which already have support for the molecular methods, the difference in total cost doesn't count much. In conclusion, by the use of molecular methods DNA isolation was successfully done from a relatively difficult clinical specimen, namely nail scraping, a protocole that could easily be applied in routine laboratory was established and species-level identification in a short time was accomplished in this study.

Key words: Onycomycosis; Trichophyton rubrum; diagnosis; polymerase chain reaction; nail scrapings.

Geli� Tarihi (Received): 17.02.2010 • Kabul Edili� Tarihi (Accepted): 07.10.2010

G�R��

Onikomikoz, g�r�lme s�kl��� giderek artan bir enfeksiyon olup, t�rnak problemleri aras�nda ilk s�ray� almaktad�r1. Bu art���n sebepleri aras�nda; ya�am s�resinin uzamas�, uzun s�reli antibiyotik kullan�m�, ba����kl��� bask�layan hastal�klarda art��, diyabet ve periferik dola��m bozukluklar� gibi hastal�klar, sentetik �orap ve uygun olmayan ayakkab� kullan�m�, ortak kullan�lan ki�isel e�yalar, banyo ve y�zme havuzlar� gibi bir�ok fakt�r say�labilir2.

Trichophyton rubrum ba�ta olmak �zere dermatofitler onikomikozun en s�k g�r�len etkenidir3. Dermatofitlerin rutin tan�s� direkt mikroskobik inceleme (DM�) ve k�lt�r� i�erir. Potasyum hidroksit (KOH) ile mantar elemanlar�n�n g�r�lme olas�l��� ve k�lt�r ba�ar�s� %25-80 aras�nda de�i�mektedir4. DM�, h�zl�, kolay, ucuz ve etkin y�ntemlerden biridir; ancak bu y�ntemle etkenin cins veya t�r ayr�m� yap�lamamaktad�r5. Dermatomikoz etkenlerinin t�r d�zeyinde tan�mlanabilmesi, ancak k�lt�rde �retilmeleri ile m�mk�nd�r. Etkenin tan�mlanmas�, epidemiyolojik verilerin yan� s�ra etkin bir tedavi i�in de gereklidir. Onikomikoz, uzun s�reli antimikotik kullan�m�n� gerektirmesi nedeniyle g�n�m�zde tedavisi en pahal� hastal�klardan biridir1. �zellikle dermatofit d��� k�flerin etken oldu�u t�rnak ve deri enfeksiyonlar�nda etkenler, dermatofitoz tedavisinde kullan�lan antifungal ila�lara diren�li olabileceklerinden, kesin tan�n�n yap�lmas� gereklidir3.

Dermatofitlerin tan�mlanmas� besiyerindeki koloninin �zelliklerine ve mikroskobik morfolojilerine g�re yap�l�r; gerekli g�r�l�rse fizyolojik testlere ba�vurulur. Dermatofitlerin �retilmeleri s�cakl�k, besiyeri, hastan�n kemoterap�tik ila� kullan�m� gibi d�� fakt�rlerden kolayl�kla etkilenmektedir. K�lt�r i�in bir ay gibi uzun bir s�re beklenmekte ve t�r tan�mlanmas�nda s�k�nt�ya yol a�maktad�r. Mikroskopi ve k�lt�r gibi rutin tan� y�ntemlerinin deneyimli personel ve zaman gerektirmesi, b�t�n hastal�klarda oldu�u gibi erken �zg�l tan� ve tedavi gereksinimlerine ba�l� olarak molek�ler tan� y�ntemlerini �n plana ��karmaktad�r6.

Bu �al��mada, onikomikoz �ikayetleri olan hastalara ait t�rnak kaz�nt� �rneklerinde, T.rubrum'a �zg�l ger�ek zamanl� polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) y�nteminin tan�sal performans�n�n, direkt mikroskopi ve k�lt�r y�ntemleri ile kar��la�t�r�lmas� ve erken tan�ya olan katk�s�n�n de�erlendirilmesi ama�lanm��t�r.

GERE� ve Y�NTEM

Etik Kurul onay� ile ger�ekle�tirilen bu �al��maya, Gazi �niversitesi T�p Fak�ltesi Dermatoloji Anabilim Dal� Poliklini�ine, el ve ayak t�rnaklar�nda renk ve �ekil de�i�ikli�i ve t�rnakta kal�nla�ma �ikayetiyle ba�vuran 90 hasta (32 kad�n, 58 erkek) dahil edildi. Bu hastalardan al�nan t�rnak kaz�nt� �rnekleri, �nce poliklinikte yap�lan DM� ile de�erlendirildi. DM� pozitif bulunan 72 hasta onikomikoz �n tan�l� grup, negatif bulunan 18 hasta ise ��pheli kontrol grubu olarak s�n�fland�r�ld�. Ayr�ca, tamamen sa�l�kl� laboratuvar �al��an� 20 g�n�ll�den al�nan t�rnak kaz�nt� �rnekleri de sa�l�kl� kontrol grubu olarak ayr�ld�. T�m �rnekler DM�, k�lt�r ve PCR y�ntemlerinde kullan�lmak �zere ependorf t�plere b�l�nd�.

Hastalardan poliklinikte al�nan ve Gazi �niversitesi T�p Fak�ltesi T�bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal� Laboratuvar�na g�nderilen t�rnak kaz�nt� �rnekleri, burada tekrar direkt mikroskobik incelemeye tabi tutuldu. Bu ama�la, temiz bir lam �zerine konulan �rneklerin �zerine %15 KOH, dimetil s�lfoksit (DMSO) ve klorazol siyah� i�eren kar���mdan damlat�l�p lamel kapat�ld�5. Haz�rlanan preparatlar oda �s�s�nda 20 dakika bekletildikten sonra hif varl��� a��s�ndan incelendi.

K�lt�r i�in �rnekler, siklohekzimit i�eren ve i�ermeyen, yatay cam t�plerde haz�rlanm�� Sabouraud dekstroz agar (SDA) besiyerlerine ekildi ve hem oda �s�s�nda hem de 37�C'de bir ay s�reyle ink�be edildi. Ekim yap�lan t�pler g�n a��r� kontrol edildi ve �reyen koloniler makroskobik ve mikroskobik olarak de�erlendirildi. �remi� olan k�f kolonileri selofan bant y�ntemiyle incelendi. Mikroskobik inceleme ile tan�da ��pheye d���ld��� durumlarda, fizyolojik testlerden yararlan�ld�4. T.rubrum ile Trichophyton mentagrophytes ayr�m� �reaz testi ile do�ruland�.

PCR i�in DNA eldesi amac�yla, 1.5 ml'lik ependorflara konulmu� olan t�rnak �rnekleri �elik bir par�alay�c� yard�m�yla ezildi. Ependorflar buz kab�na konularak �zerine s�v� nitrojen eklendi ve 2-3 dakika beklendi. Ependorflara 400 �l par�alama sol�syonundan [100 mM Tris HCl, 30 mM EDTA (pH: 8), %0.5 SDS] eklendi ve 100�C'de 15 dakika kuru �s� blo�unda tutuldu. T�pler 14.000 rpm'de iki dakika santrif�j edildikten sonra DNA i�eren �st s�v� yeni bir t�pe al�nd�. Daha sonra fenol-kloroform-izoamil alkol (25.24.1) safla�t�rma y�ntemi uyguland�. DNA �rnekleri 30 �l Tris-EDTA (TE) tamponu i�inde -20�C'de bekletildi. �al��mada pozitif kontrol olarak T.rubrum olarak tan�mlanm�� k�f kolonisi kullan�ld�.

T.rubrum DNA's�n�n �o�alt�lmas� ve g�sterilmesi, ger�ek zamanl� PCR y�ntemi (Real Time PCR, LightCycler-Roche, ABD) ile yap�ld�. Bu ama�la T.rubrum'a �zg�l primerler (5'-CGGAGGACAGACACCAAGAA-3' ve 5'-ATTTCGCTGCGTTCTTCATC-3') ve FAM ve TAMRA ile i�aretlenmi� problar kullan�larak (FAM-CAGTCTGAGCGTTTAGCAAGCACAATC-TAMRA) TaqMan protokol� uyguland�. DNA'n�n �o�alt�lmas� i�in enzim i�eren Roche LightCycler FastStart DNA MasterPLUSHybProbe kiti kullan�ld�. Veri analizleri LightCycler Software version 4.0.0.23 ile yap�ld�. Veriler 530 kanal�ndan "absolute quantification" analizi ile de�erlendirildi.

Onikomikoz tan�s�nda KOH ve/veya klorazol ile yap�lan direkt mikroskopi y�nteminin duyarl�l���n�n k�lt�rden daha y�ksek olmas� nedeniyle7,8,9, PCR y�nteminin performans�, DM� sonu�lar� ile kar��la�t�r�larak belirlendi.

BULGULAR

�Klinik �ikayetler ile dermatoloji anabilim dal� klini�ine ba�vuran ve poliklinikte yap�lan ilk DM� sonucu pozitif bulunan 72 onikomikoz �n tan�l� hasta ile DM� sonucu negatif bulunan 18 ��pheli hastan�n t�rnak �rnekleri, mikrobiyoloji anabilim dal� laboratuvar�nda yap�lan ikinci DM� ile de ayn� sonu�lar� vermi�tir (Resim 1).


Resim 1

�DM� pozitif olan 72 hastan�n 20 (%27.8)'sinde T.rubrum �remesi olmu�; bu hastalar�n hi�birisinde dermatofit d��� k�f mantar� g�r�lmemi�tir. �ikayeti olan, ancak DM� negatif bulunan 18 hastan�n t�rnak �rneklerinin k�lt�r�nde ise �reme olmam��t�r.

DM� ile pozitif saptanarak onikomikoz �n tan�s� alan 72 hastan�n 67 (%93)'si ve DM� negatif bulunan 18 hastan�n 8 (%44.4)'i PCR ile pozitif sonu� vermi�tir (�ekil 1). K�lt�r�nde T.rubrum �retilen t�m �rnekler (n= 20) PCR ile de pozitif bulunmu�tur.


�ekil 1

�Sa�l�kl� t�rnaklara sahip 20 g�n�ll�den al�nan kontrol grubu �rneklerinin hi�birisinde DM�, k�lt�r ve PCR ile pozitif sonu� saptanmam��t�r.

Direkt mikroskopi ile kar��la�t�r�ld���nda, PCR y�nteminin duyarl�l�k, �zg�ll�k, pozitif ve negatif prediktif de�erleri s�ras�yla; %93, %56, %89 ve %67 olarak hesaplanm��t�r (Tablo I).


Tablo I

TARTI�MA �����

Yap�lan �al��malarda, �lkemizde onikomikoz ve tinea pedis s�kl��� b�lgelere ve �al��ma gruplar�na g�re de�i�iklik g�stermekle birlikte %21-70 aras�nda bildirilmektedir2,10,11,12,13,14. Ku�timur ve El-Nahi10 �al��malar�nda, Balgat ve �evresinde en s�k tinea pedis enfeksiyonu bulundu�unu, b�lgenin dermatofit floras�nda T.mentagrophytes ve T.rubrum'un bask�n oldu�unu, onikomikozlu hastalardan en s�k T.rubrum, ikinci s�rada T.mentagrophytes izole ettiklerini bildirmi�lerdir. �lkit ve arkada�lar�12, onikomikozlu olgulardan al�nan 98 k�lt�r pozitif �rne�in 74 (%75.5)'�nden dermatofit, 24 (%24.5)'�nden ise maya izole etmi�; dermatofitler aras�nda en s�k T.rubrum (%48) ve T.mentagrophytes var. interdigitale (%26.6), mayalar aras�nda ise en s�k Candida tropicalis (%11.2) ve Candida albicans (%9.2)'� saptam��lard�r.

Onikomikozun standart tan�s�, direkt mikroskopide mantar elemanlar�n� g�rmek ve k�lt�rde patojen organizmay� �retmekle konulur1,4. Yap�lan �al��malarda DM�'lerde farkl� sonu�lar elde edilmi�tir5,7,8,9,15. Bizim �al��mam�zda, el ve ayak t�rnaklar�nda renk/�ekil de�i�ikli�i ve kal�nla�ma gibi onikomikoz �ikayetleri olan 90 hastan�n 72 (%80)'sinde DM� ile pozitiflik saptanm��t�r. Mikroskobik incelemede yanl�� negatif sonu� al�nmas�n�n en yayg�n nedeni, �rne�in yanl�� yerden al�nmas�d�r. Ayr�ca, klinisyenin deneyiminin eksik olmas�, materyali incelemek i�in yeterince zaman ayr�lmamas� ve bozulmu� KOH sol�syonu kullan�lmas� da yanl�� negatif sonucun nedenleri aras�ndad�r. DM�'de yanl�� pozitif sonu�lar ise, artefakt yo�unlu�u ve normal keratinosit h�cre duvar�n�n yanl��l�kla hif olarak yorumlanmas� nedeniyle olabilir. Bu y�ntemin duyarl�l���n�n art�r�lmas� i�in �e�itli boyalarla KOH'nin kombinasyonu g�ndeme gelmi�tir5. Bizim �al��mam�zda direkt inceleme i�in KOH-klorazol boyas� ve DMSO kar���m� kullan�lm��t�r.

Dermatofitoz tan�s�nda k�lt�r y�nteminin �zg�ll��� y�ksek olmakla birlikte duyarl�l��� olduk�a d���k olup, dermatofitlerin k�lt�rden izolasyon oran� %20-60 aras�nda de�i�mektedir7,8,9,14,15. Bizim �al��mam�zda k�lt�rde pozitiflik oran� %27.8 (20/72) olarak saptanm�� ve �retilen tek mantar t�r� T.rubrum olmu�tur. Hastalardan sadece bir kez �rnek al�nabildi�i i�in dermatofit d��� k�fler ve saprofit olarak da g�r�lebilen mayalar etken olarak kabul edilmemi�tir.

Dermatofit enfeksiyonlar�nda etkenin fenotipik olarak tan�mlanmas�ndaki s�k�nt�lar, molek�ler y�ntemlerin g�ndeme gelmesine neden olmu�tur. Farkl� ara�t�rmalarda farkl� PCR y�ntemleri kullan�lm��, ancak alt�n standart bir molek�ler y�ntem belirtilmemi�tir. Panfungal primerler kullan�larak ger�ekle�tirilen �al��malardan birisi, dermatolojik �rneklerden t�r d�zeyinde molek�ler tan�n�n ama�land��� Turin ve arkada�lar�n�n6 �al��mas�d�r. Bu �al��mada; Microsporum, Trichophyton, Candida ve Aspergillus cinslerinden toplam 17 t�re ek olarak Malassezia pachydermatis, Saccharomyces cerevisiae, Cryptococcus neoformans, Penicillium, Acremonium ve Trichoderma t�rleri de "internal transcribed spacer" (ITS) 1 ve ITS 4 primer �ifti ile test edilmi�, sekiz farkl� amplikon elde edilebilmi�tir. Ara�t�r�c�lar bu y�ntemle Aspergillus t�rlerinde ba�ar�s�z olmu�, T.mentagrophytes ve T.rubrum'u ise ay�rt edememi�lerdir6. Garg ve arkada�lar�16 kitin sentaz genine �zg�l primerler kullanarak, t�m dermatofit t�rlerine �zg�l (pandermatofit) "nested" PCR ile yapt�klar� �al��mada, bu y�ntemin standart PCR'den daha y�ksek duyarl�l��a sahip oldu�unu ve onikomikoz tan�s�nda alt�n standart olabilece�ini ifade etmi�lerdir. T.rubrum'a �zg�l primerler kullan�larak yap�lan PCR'nin �zg�ll���n�n, ITS gibi daha homojen bir b�lgeyi hedef olarak i�eren �al��malardan daha ba�ar�l� oldu�u d���n�lmektedir. Gupta ve arkada�lar�n�n17 yapt��� �al��mada, T.rubrum'a �zg�l aktin gen b�lgesi hedef al�nm�� ve duyarl�l���n�n ITS 1 ve ITS 4 ile yap�lan PCR'ye g�re daha y�ksek oldu�u bildirilmi�tir. Arabatzis ve arkada�lar�18 dermatofit t�rlerinin karma��k genom yap�s�ndan dolay� konvansiyonel PCR y�ntemlerinin standart metoda alternatif olamayaca��n�, florofor problar veya TaqMan prob kullan�lan ger�ek zamanl� PCR'nin duyarl�l���n�n daha fazla oldu�unu belirtmi�lerdir.

Bug�ne kadar onikomikoz ile ilgili bu �al��malar�n �o�unlu�unda DNA ekstraksiyonu k�lt�rden yap�lm�� �ok az �al��mada direkt t�rnak �rne�inden DNA izolasyonu ba�ar�labilmi�tir. Bunlardan birisi, Arca ve arkada�lar�n�n11 panfungal ITS 1 ve ITS 4 primerleri kullanarak yapt�klar� �al��mad�r. Bu �al��mada, onikomikozlu 52 olgudan al�nan t�rnak �rneklerinin 40 (%77.7)'� KOH ile pozitif, 12 (%23)'si k�lt�r pozitif ve 20 (%38)'si PCR pozitif olarak bulunmu�; k�lt�r negatif 40 olgunun 14'�, mikroskopi negatif 12 olgunun d�rd� ve hem mikroskopisi hem k�lt�r� negatif olan d�rt �rnek PCR ile pozitif sonu� vermi�tir11. Bizim �al��mam�zda, direkt t�rnak �rneklerinden DNA izolasyonunda haz�r ticari kit kullan�lmam��, DNA izolasyonu s�v� azot, kaynatma ve ard�ndan fenol-kloroform-izoamil alkol safla�t�rma y�ntemi kullan�larak yap�lm��t�r. Ayr�ca �al��mam�zda, amplifikasyon i�in �zg�ll��� y�ksek TaqMan probu kullan�larak T.rubrum ve T.mentagrophytes ayr�m� kesin olarak yap�labilmi�tir. Dolay�s�yla onikomikozlu olgular�m�z�n t�rnak �rneklerinin %93 (67/72)'�nde PCR ile T.rubrum varl��� do�rulanm��t�r. PCR y�nteminin bir di�er avantaj� da, dermatofitlerin t�r tan�m� i�in gereken iki-d�rt haftal�k s�reyi b�y�k �l��de azaltmas�d�r. �al��mam�zda bu y�ntem ile bir saatte DNA izolasyonu tamamlanm��, bir saatte �o�alt�lm�� ve klasik y�ntemlere g�re k�sa s�rede sonu� elde edilebilmi�tir.

Dermatofit enfeksiyonlar�n�n tan�s�nda kullan�lan klasik y�ntemler negatif sonu� verdi�inde veya t�r tan�m� yap�lamad���nda, molek�ler bir y�ntemin �nerilmesi s�z konusu olabilir19. Bu �al��ma ile geli�tirilmi� olan TaqMan PCR yakla��m� bu a��dan de�erlidir. Ancak yine de, uygulanabilecek ideal tek bir molek�ler y�ntemin olmad��� ak�ldan ��kar�lmamal�d�r. Molek�ler tekniklerin baz�lar�n�n ay�r�m g�c�, baz�lar�n�n ise tekrarlanabilirlikleri y�ksektir. Bu nedenle molek�ler tiplendirmede kullan�lacak y�ntem, amaca g�re de�i�iklik g�stermeli, yani bir teknik di�erinin yerini almak yerine ona katk�da bulunmal�d�r. Molek�ler y�ntemler geleneksel y�ntemlerin tamamlay�c�s� olmal�d�r. Literat�r bilgileri, molek�ler �al��malar aras�nda standardizasyon olmamas� sebebiyle dikkatle k�yaslanmal�d�r.

KAYNAKLAR

  1. Elewski BE. Onychomycosis: pathogenesis, diagnosis and management. Clin Microbiol Rev 1998; 11(3): 415-29. [�zet] [Tam Metin] [PDF]
  2. Hilmioglu Polat S, Metin DY, Inci R, Dereli T, Kilinc I, Tumbay E. Non-dermatophytic molds as agents of onychomycosis in Izmir, Turkey-a prospective study. Mycopathologia 2005; 160(2): 125-8. [�zet]
  3. Mugge C, Haustein UF, Nenoff P. Causative agents of onychomycosis-a retrospective study. J Dtsch Dermatol Ges 2006; 4(3): 218-28. [�zet]
  4. Faergemann J, Baran R. Epidemiology, clinical presentation and diagnosis of onychomycosis. Br J Dermatol 2003; 149(Suppl 65): 1-4. [�zet]
  5. Panasiti V, Borroni RG, Devirgiliis V, et al. Comparison of diagnostic methods in the diagnosis of dermatomycoses and onychomycoses. Mycoses 2006; 49(1): 26-9. [�zet]
  6. Turin L, Riva F, Galbiati G, Cainelli T. Fast, simple and highly sensitive double-rounded polymerase chain reaction assay to detect medically relevant fungi in dermatological specimens. Eur J Clin Invest 2000; 30(6): 511-8. [�zet]
  7. Lilly KK, Koshnick RL, Grill JP, Khalil ZM, Nelson DB, Warshaw EM. Cost-effectiveness of diagnostic tests for toenail onychomycosis: a repeated-measure, single-blinded, cross-sectional evaluation of 7 diagnostic tests. J Am Acad Dermatol 2006; 55(4): 620-6. [�zet]
  8. Lawry MA, Haneke E, Strobeck K, Martin S, Zimmer B, Romano PS. Methods for diagnosing onychomycosis: a comparative study and review of the literature. Arch Dermatol 2000; 136(9): 1112-6. [�zet] [Tam Metin] [PDF]
  9. Karimzadegan-Nia M, Mir-Amin-Mohammadi A, Bouzari N, Firooz A. Comparison of direct smear, culture and histology for the diagnosis of onychomycosis. Australas J Dermatol 2007; 48(1): 18-21. [�zet]
  10. Ku�timur S, El-Nahi H. Ankara'n�n Balgat ve �evresindeki yerle�im b�lgelerinden izole edilen dermatomikoz etkenleri. T�rk Mikrobiyol Cem Derg 1993; 23: 116-8.
  11. Arca E, Saracli MA, Akar A, Yildiran ST, Kurumlu Z, Gur AR. Polymerase chain reaction in the diagnosis of onychomycosis. Eur J Dermatol 2004; 14(1): 52-5. [�zet]
  12. Ilkit M. Onychomycosis in Adana, Turkey: a 5-year study. Int J Dermatol 2005; 44(10): 851-4. [�zet]
  13. Sahin I, Kaya D, Parlak AH, Oksuz S, Behcet M. Dermatophytoses in forestry workers and farmers. Mycoses 2005; 48(4): 260-4. [�zet]
  14. Hilmioglu S, Gunduz T, Metin DY, et al. Onychomycosis in primary school children: association with socioeconomic conditions. Mycoses 2006; 49(5): 431-3. [�zet]
  15. Weinberg JM, Koestenblatt EK, Tutrone WD, Tishler HR, Najarian L. Comparison of diagnostic methods in the evaluation of onychomycosis. J Am Acad Dermatol 2003; 49(2): 193-7. [�zet]
  16. Garg J, Tilak R, Singh S, et al. Evaluation of pan-dermatophyte nested PCR in diagnosis of onychomycosis. J Clin Microbiol 2007; 45(10): 3443-5. [�zet] [Tam Metin] [PDF]
  17. Gupta AK, Zaman M, Singh J. Fast and sensitive detection of Trichophyton rubrum DNA from the nail samples of patients with onychomycosis by a double-round polymerase chain reaction-based assay. Br J Dermatol 2007; 157(4): 698-703. [�zet]
  18. Arabatzis M, Bruijnesteijn van Coppenraet LE, Kuijper EJ, et al. Diagnosis of common dermatophyte infections by a novel multiplex real-time polymerase chain reaction detection/identification scheme. Br J Dermatol 2007; 157(4): 681-9. [�zet]
  19. Sara�l� MA. Dermatomikozlar�n tan�s�nda molek�ler y�ntemler, s: 74-9. �zbal Y, Ko� AN (eds), Dermatomikoz Etkenleri ve Dermatomikozlar. 2. Ulusal Mantar Hastal�klar� ve Klinik Mikoloji Sempozyumu Kitab�, 2004. T�rk Mikrobiyoloji Cemiyeti, Kayseri.

�leti�im (Correspondence):

Prof. Dr. Semra Ku�timur,

Gazi �niversitesi T�p Fak�ltesi,

T�bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal�,

06500, Be�evler, Ankara, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 312 202 4629,

E-posta (E-mail): kustimur@gazi.edu.tr

Yazd�r