Yazdır

Hastane Enfeksiyonu Etkeni Olarak İzole Edilen Candida Suşlarının Genotipik ve Fenotipik Olarak Tanımlanması

Phenotypic and Genotypic Identification of Candida Strains Isolated as Nosocomial Pathogens

Fatih ŞAHİNER1, Koray ERGÜNAY2, Mustafa ÖZYURT1, Nurittin ARDIÇ1, Tuğrul HOŞBUL1,
Tunçer HAZNEDAROĞLU1

1 Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Haydarpaşa Eğitim Hastanesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Servisi, İstanbul.

1 Gulhane Millitary Medical Academy, Haydarpasa Training Hospital, Department of Medical Microbiology, Istanbul, Turkey.

2 Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

2 Hacettepe University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

ÖZET

Son 10 yılda Candida enfeksiyonlarının epidemiyolojisi ve tedavide kullanılan antifungallerle ilgili önemli değişiklikler ortaya çıkmıştır. Candida türleri günümüzde özellikle yoğun bakım ünitelerinde enfeksiyon etkeni olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu çalışmanın temel amaçlarından biri enfeksiyon etkeni Candida türlerinin hastanemizdeki dağılımını belirleyerek hastane enfeksiyonlarının önlenmesine katkıda bulunmak, diğeri ise Candida izolatlarının tür düzeyinde tanımlanmasında kullanılan geleneksel ve moleküler yöntemlerin etkinliklerini ve pratik uygulanabilirliklerini değerlendirmektir. Çalışmaya, hastanede yatarak tedavi gören 60 (29 erkek, 24 kadın; 7'si çocuk) hastanın çeşitli klinik örneklerinden izole edilen 77 Candida suşu dahil edilmiştir. "Centers for Disease Control and Prevention (CDC)" kriterlerine göre bu izolatların 57 (%74)'si hastane enfeksiyonu (HE) etkeni olarak kabul edilmiştir. HE etkeni olarak en sık saptanan türler, C.albicans (22; %38.6), C.tropicalis (14; %24.6), C.parapsilosis (13; %22.8), C.glabrata (7; %12.3) ve Candida spp. (1; %1.75) olmuştur. Çalışmamızda Candida türlerinin en sık kan dolaşımı (26; %45.6) ve üriner sistem (24; %42.1) enfeksiyonlarından sorumlu olduğu belirlenmiştir. Kan dolaşımı enfeksiyonuna en sık yol açan tür C.parapsilosis (10; %38.5), üriner sistem enfeksiyonuna en sık neden olan tür ise C.albicans (12; %50) olarak saptanmıştır. Bu çalışmada ayrıca, Candida türlerinin tanımlanmasında yaygın olarak kullanılan geleneksel fenotipik yöntemlerin [germ tüp oluşumu, mısır unu agarda klamidospor oluşturma, 45°C'de üreme, CHROMagar Candida (CAC) besiyerindeki koloni özellikleri, API ID 32C (BioMerieux, Fransa) sistemi ile karbonhidrat asimilasyon özellikleri] ve bazı moleküler tekniklerin [ITS-1, ITS-3 ve ITS-4 primerleri uygulanan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism), ITS1-ITS4 ürünlerinin Msp I ve Bln I restriksiyon enzimleri ile kesildiği PCR-RFLP] avantaj ve dezavantajları değerlendirilmiştir. Sonuç olarak, Candida izolatlarının tür düzeyinde tanımlanmasında CHROMagar Candida besiyeri ve API ID 32C kiti birlikte kullanıldığında moleküler yöntemlerle elde edilen (%100 uyumlu) benzer sonuçlar alınabildiği bulunmuştur. Ayrıca bu yöntemlerin moleküler yöntemlere göre çok daha düşük maliyetli ve kolay uygulanabilir olduğu sonucuna varılmıştır.

Anahtar sözcükler: Hastane enfeksiyonu; Candida; fenotipik tanımlama; genotipik tanımlama.

ABSTRACT

Over the last decade, there have been important changes in the epidemiology of Candida infections and antifungal agents used to treat these infections. In recent years, Candida species have emerged as important causes of invasive infections among patients in intensive care units. One of the main goals of this study was to evaluate the molecular epidemiology of infectious Candida species isolated in our hospital and accordingly supply data for hospital infection (HI) control. The other aim of this study was to evaluate effectiveness and practical applicability of traditional and molecular methods used to identify Candida isolates to the species level. A total of 77 Candida strains that were isolated from various clinical specimens of 60 hospitalized patients (29 male, 24 female; 7 were children) were included in the study. Fifty-seven (74%) of those isolates were defined as HI agents according to Centers for Disease Control and Prevention (CDC) criteria. The most common Candida species identified as agents of HI were C.albicans (22; 38.6%), followed by C.tropicalis (14; 24.6%), C.parapsilosis (13; 22.8%), C.glabrata (7; 12.3%) and Candida spp. (1; 1.75%). It was determined that bloodstream (26; 45.6%) and urinary tract infections (24; 42.1%) were the most frequently encountered nosocomial infections caused by Candida species. In addition it was detected that the most frequent causative agent of bloodstream infections was C.parapsilosis (10; 38.5%) and of urinary tract infections was C.albicans (12; 50%). The evaluation of advantages and disadvantages of traditional phenotypic methods [germ tube formation, chlamydospore formation in corn meal agar, growth at 45°C, colony characteristics on CHROMagar Candida medium, carbohydrate assimilation properties detected by API ID 32C (BioMerieux, France) system] and some molecular techniques [polymerase chain reaction (PCR) by using ITS-1, ITS-3 and ITS-4 primers, PCR-Restriction fragment length polymorphism (RFLP), PCR-RFLP in which ITS1-ITS4 products cut by Msp I ve Bln I restriction enzymes] for the identification of Candida species revealed that CHROMagar Candida medium combined with API ID 32C kit yielded the same results (100% compatible) as molecular techniques for the species identification of Candida isolates. Since these phenotypic methods were simple and cost effective when compared to molecular techniques, they should be considered in the identification of Candida species.

Key words: Hospital infection; Candida; phenotypic identification; genotypic identification.

Geliş Tarihi (Received): 27.10.2010 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 05.05.2011

GİRİŞ

Genellikle transplantasyon uygulanan ve immün süpresif ilaçlarla tedavi edilen, nötropenik ve immün yetmezlikli hastalarda daha sık enfeksiyonlara yol açtığı bilinen Candida türleri, günümüzde özellikle yoğun bakım ünitesi (YBÜ) hastalarında önemli patojenler durumuna gelmiştir1. Kandidemiler, tüm hastane kökenli kan dolaşımı enfeksiyonları (HKKDE) arasında üçüncü, YBÜ'lerde ise dördüncü sırada yer almaktadır. Bu enfeksiyonların mortalite oranları, modern tanı ve tedavi olanaklarına rağmen %40-60'a ulaşabilmektedir1,2.

Hekimlerin, hastanelerinin baskın florasını oluşturan mikroorganizmalar ile bunların direnç paternlerini, ayrıca klinikler bazında ve zaman içinde bu verilerde oluşan değişimleri bilmeleri etkin ve doğru enfeksiyon kontrol stratejilerinin geliştirilmesinde önemli bir koşuldur3. Günümüzde, hastane enfeksiyonları (HE)'nın erken saptanabilmesi ve etkenlerin hastalar arasında yayılmasının engellenmesine yönelik gerekli önlemlerin zamanında alınabilmesi için geleneksel yöntemlerin yanında moleküler yöntemlerin kullanılması da önemli bir gereksinim haline gelmiştir.

Bu çalışmada, enfeksiyon etkeni Candida türlerinin hastanemizdeki dağılımının belirlenmesi ve izolatların tür düzeyinde tanımlanmasında kullanılan geleneksel ve moleküler yöntemlerin etkinlik ve pratik uygulanabilirliklerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır.

GEREÇ ve YÖNTEM

Çalışmaya, Mayıs-Aralık 2007 tarihleri arasında GATA Haydarpaşa Eğitim Hastanesinde çeşitli kliniklerde yatarak tedavi gören yedisi çocuk toplam 60 hastanın (29 erkek, 24 kadın), enfeksiyon şüphesiyle alınan örneklerinden izole edilen 77 Candida suşu alındı. Örneklerinde Candida izole edilen hastalar takibe alınırken, her yeni üreme HE varlığı yönünden CDC kriterleri4 ve klinisyen görüşlerine göre hastanın kliniği ile birlikte ayrıca değerlendirildi. Hastaların benzer klinik örneklerinde aynı türe ait tekrarlayan üremeler olduğunda bunlardan sadece biri istatistiksel değerlendirme ve moleküler tanımlamalara dahil edildi.

Örnekler rutin kullanım besiyerlerine ekilirken, mikroskobik incelemelerinde maya hücreleri görülenler ayrıca Sabouraud dekstroz agar (SDA) (Merck) ve CHROMagar Candida (CAC) (BBL, Fransa) besiyerlerine ekildi. Kan örnekleri için BACTEC 9240 (Becton Dickinson, USA) kültür sistemi kullanıldı. Geleneksel yöntemlerle tanımlanan ve tek koloni ekimi ile saflaştırılan tüm suşlar %15 gliserinli buyyon içinde -80°C'de saklandı. Moleküler çalışmalar öncesi bu stoklardan SDA ve uygun sıvı besiyerlerine pasajlar yapılarak suşlar canlandırıldı ve testler uygulandı5,6,7,8. Kontrol suşu olarak C.albicans ATCC 14053, C.parapsilosis ATCC 90018 ve C.dubliniensis CBS 7987 kullanıldı.

İzolatların germ tüp ve klamidospor oluşturma, 45°C'de üreme, CAC besiyerindeki koloni özellikleri standart protokollere uygun olarak değerlendirildi5,6,9. Karbonhidrat asimilasyon özellikleri ise API ID 32C (BioMerieux, Fransa) kitiyle üretici firmanın önerilerine göre değerlendirildi. CAC besiyerinde parlak yeşil kolonileri olan, mısır unu agar (MUA)'da klamidospor oluşturan ve germ tüp pozitif olup 45°C'de üreyebilen izolatların tamamı C.albicans olarak kabul edildi ve API ID 32C kiti ile tanımlamaya gereksinim duyulmadı. API ID 32C kiti, randomize olarak seçilen üç C.albicans izolatı ve albicans-dışı tüm izolatların tür düzeyindeki tanımlanması için kullanıldı.

Stoklardan çoğaltılan mayaların DNA'ları standart fenol-kloroform izoamilalkol metodu ile ekstrakte edildi10,11. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), daha önce tanımlanmış bir yöntem temel alınarak; ITS1 (ileri) 5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3', ITS3 (ileri) 5'-gcatcgatgaagaacgcagc-3' ve ITS4 (ters) 5'-tcctccgcttattgatatgc-3' (Iontek, Türkiye) primerleri ile gerçekleştirildi12. Reaksiyon 95°C'de 5 dakika başlangıç denatürasyonunu takiben 95°C'de 30 saniye, 54°C'de 30 saniye, 72°C'de 1 dakika olarak 30 döngü ve 72°C'de 7 dakika son döngü şeklinde ısı döngü cihazında (Icycler-BioRad, İtalya) gerçekleştirildi ve amplifikasyon ürünleri %1.5'lik agaroz jelde yürütülerek UV ışık altında görüntülendi. Ek olarak, ITS1-ITS4 ürünleri Msp I (SibEnzyme®, Rusya) ve Bln I (Roche Diagnostics®, Almanya) restriksiyon enzimleri ile kesildi ve sırasıyla %1.8 ve %2'lik agaroz jellerde yürütülerek UV ışık altında görüntülendi10,13.

BULGULAR

Çalışmanın verileri, aktif sürveyans ile toplanan klinik ağırlıklı bulgular (Tablo I) ve izole edilen suşların tanımlanmasında yaygın olarak kullanılan yöntemlerin etkinlik, hız ve maliyetlerinin karşılaştırılması ile elde edilen laboratuvar ağırlıklı bulgular (Tablo II) olmak üzere iki ana bölümde değerlendirilmiştir.


Tablo I

CDC kriterleri ve klinisyen kararlarına göre 77 izolatın 57 (%74)'si HE etkeni olarak belirlenirken, en sık görülen enfeksiyon tipleri sırasıyla kan dolaşımı 26 (%45.6) ve asemptomatik kandidüriler de dahil olmak üzere üriner sitem enfeksiyonları 24 (%42.1) olarak saptanmıştır (Tablo I). Altmış hastadan elde edilen 72 klinik örneğin 69 (%95.8)'unda tek Candida türü izole edilirken, bir kan kültüründe üç (C.albicans, C.tropicalis, C.parapsilosis), bir yara kültüründe üç (C.albicans, C.glabrata, C.parapsilosis) ve bir aspirasyon kateter ucu kültüründe iki farklı tür (C.albicans, C.glabrata) izole edilmiştir. Tüm izolatların 35 (%45.5)'i C.albicans, 17 (%22)'si C.parapsilosis, 14 (%18.2)'ü C.tropicalis, 10 (%13)'u C.glabrata olarak tanımlanırken, bir tür (%1.3) hem geleneksel hem de moleküler yöntemlerle eksik (incomplete) olarak (C.lusitaniae veya C.intermedia şeklinde) tanımlanabilmiştir.

Çalışmamızda etkenlerin çoğu kan ve idrar örneklerinden izole edilirken, kan kültürlerinden albikans-dışı türler daha sık izole edilmiştir (Şekil 1). Üreme saptanan örnekler toplam 15 farklı klinik veya üniteden elde edilirken, bu örneklerin %44 (32/72)'ü Genel Cerrahi ve İç Hastalıkları YBÜ'lerinde yatan hastalara aittir.


Şekil 1

MUA'da yalancı hif yapıları ve klamidospor oluşturmayan 10 izolat morfolojik olarak C.glabrata, klamidospor oluşturan 35 izolat C.albicans veya C.dubliniensis şeklinde tanımlanırken, diğer izolatların tür düzeyinde tanısı için MUA tek başına yeterli olmamıştır. CAC besiyeri ile izolatların 35 (%45.5)'i C.albicans, 14 (%18.2)'ü C.tropicalis ve 10 (%13)'u C.glabrata olarak tanımlanmış, diğer 18 (%23.4) izolat ise CAC'da tür düzeyinde tanımlanamamıştır. C.dubliniensis standart suşunun CAC besiyerinde, 24. ve 36. saatlerde C.albicans kolonilerinden tam olarak ayırt edilemeyen yeşil renkli parlak koloniler oluşturduğu, inkübasyon süresi uzatıldıkça bunların koyu-yeşil renkte, mat görünümlü kolonilere dönüştüğü gözlenirken6, hastanemiz izolatları içinde benzer özellik gösteren başka bir suşa rastlanmamıştır. Tüm yöntemlerin kullanılmasıyla elde edilen son tanımlamalar standart olarak kabul edilmek üzere API ID 32C kitinin duyarlılığı; 24. saatte %72.9 (35/48), 48. saatte %95.8 (46/48) ve 72. saatte %87.5 (42/48) olarak saptanmıştır. Bir Candida türü API ID 32C kiti ile düşük düzeyde ve eksik olarak C.intermedia veya C.lusitaniae şeklinde tanımlanabilmiştir. Bu türün dışında API ID 32C testi bir C.tropicalis türünü ikinci olasılık olarak tanımlayabilmiş; 24. ve 72. saatlerde yapılan hatalı değerlendirmelerin birçoğu (%55.5) da yine diğer yöntemlerle C.tropicalis olarak tanımlanmıştır.

Çalışma sonunda doğrulama amaçlı test tekrarları yapılmış; kör değerlendirmelerde tek değişken kullanılan hasta serumu olmak üzere, germ tüp oluşturduğu daha önceden saptanmış olan C.albicans türlerinin %8.6-14.3 oranları arasında yanlış negatif olarak değerlendirilebileceği saptanmıştır. Yine, daha önce tümünün MUA'da klamidospor oluşturduğu belirlendiği halde bazı C.albicans türlerinin kontrol amaçlı yapılan testlerde klamidospor oluşturmadığı gözlenmiştir.

ITS-1, ITS-3 ve ITS-4 primerleri ile elde edilen amplifikasyon ürünlerinin büyüklük farklılıklarına göre yapılan tanımlamada ise, C.glabrata'nın kolaylıkla tanımlanabildiği ancak izolatların büyük çoğunluğunu (> %85) oluşturan üç Candida türünün (C.albicans, C.parapsilosis ve C.tropicalis) birbirlerinden tam olarak ayırt edilemediği görülmüştür. Bu üç türün daha kolay ayırt edilebilmesi için daha önce bildirilen bir PCR-RFLP yöntemi10 uygulanmıştır (Şekil 2). C.glabrata'nın amplikonları diğer tüm Candida türlerine göre daha büyük olduğundan ikinci bir yönteme gereksinim kalmadan tanımlanmıştır. Çalışmada izole edilen türlerden biri daha önceden tanımlanmış olan paternlere12 göre C.lusitaniae veya C.intermedia şeklinde eksik olarak tanımlanabilmiştir. Her iki yöntem de C.dubliniensis, C.albicans ayırımını yapamadığı için, bu iki türün birbirinden ayırt edilmesinde Bln I (Avr II) enziminin kullanıldığı farklı bir PCR-RFLP yöntemi13 uygulanmış ve izolatlarımız arasında C.dubliniensis suşunun olmadığı moleküler yöntemlerle de doğrulanmıştır.


Şekil 2

TARTIŞMA

Günümüzde invazif fungal enfeksiyonlar için risk altındaki popülasyon giderek artmakta ve buna paralel olarak hastane kökenli fungal enfeksiyonların %80'inden fazlasından sorumlu olan ve HKKDE etkenleri arasında ilk sıralarda yer alan Candida türleri her geçen gün önem kazanmaktadır. Son yıllarda özellikle albicans-dışı Candida türlerinin etken olduğu enfeksiyonlarda dikkat çekici artışlar göze çarpmaktadır14,15. Kandidemilerin %95'inden fazlasında etken olarak beş tür (C.albicans, C.parapsilosis, C.tropicalis, C.glabrata ve C.krusei) izole edilmekte, en sık saptanan tür C.albicans olmakla birlikte bazı çalışmalarda ilk sırayı C.parapsilosis almaktadır15,16,17. Kan dolaşımı enfeksiyonu (KDE) etkeni olan Candida türlerinin görülme sıklıkları coğrafi bölgelere ve ülkelere göre değişiklik göstermektedir15,16,17,18,19. Çalışmamızda, Candida kaynaklı 26 KDE epizodu tespit edilmiş ve sık görülen etkenler sırasıyla C.parapsilosis (%38.5), C.tropicalis (%30.8) ve C.albicans (%26.9) olarak tanımlanmıştır. Bu durum, tüm dünyada olduğu gibi hastanemizde de albicans-dışı Candida türlerinin giderek daha da önem kazanacağının bir göstergesi olarak değerlendirilmiştir.

Kandidemi tedavisinde tercih edilen flukonazol, Candida türlerinin çoğuna karşı etkili olup, yan etkileri görece olarak azdır ve maliyeti düşüktür1. Ancak flukonazol nadir izole edilen bir tür olan C.krusei'ye karşı etkisizken C.glabrata'ya karşı da sınırlı etki göstermektedir1. Eğer bir hastanede kandidemiye neden olan en sık etkenler C.albicans, C.parapsilosis ve C.tropicalis ise kandidemi tedavisinde flukonazol tercih edilirken, eğer izolatların %15-20'den fazlası C.glabrata ise ilk tercihin kaspofungin olması önerilmektedir1. Kandidemi tedavisi için daha uygun olan ve daha az yan etkiye sahip ekinokandinler, flukonazol grubu ilaçlara göre hala çok pahalı olduğundan birçok hastanede kullanımları kısıtlıdır. Bu nedenle hekimler hastanelerinde kan dolaşımı invazyonuna neden olan en yaygın Candida türlerini bilmelidirler. Çalışma süresince C.glabrata ve C.krusei türlerinin etken olduğu HKKDE saptayamamış olmamızda, HEKK kararları gereği hastanemizde profilaktik flukonazol kullanımının kısıtlanmasının rolü olabilir. Ayrıca bu durum flukonazolün hastanemizde kandidemi olgularında ampirik tedavi için iyi bir seçenek olabileceğini göstermektedir.

Genel Cerrahi YBÜ'de dört C.parapsilosis ve İç Hastalıkları YBÜ'de yedi C.albicans suşu aynı tarihlerde aynı ünitelerde yatan hastalardan izole edilmiştir. Bunun nedeni, yetersiz koruyucu önlemlere bağlı hastalar arası bulaş olabileceği gibi, benzer risk faktörlerine sahip hastalarda aynı türlerin saptanmış olması da olabilir. Bu olasılıkların açıklanabilmesi için klonal ilişkinin araştırıldığı epidemiyolojik moleküler çalışmalara gereksinim olduğunu düşünmekteyiz.

Kandidemiler sırasında tekrarlayan negatif kan kültürlerine rastlanabileceğinden, kolonizasyonu olan hastalarda invazif kandidiyazis varlığı klinik ile paralel olarak dikkatle araştırılmalıdır. Çalışmamızda takip edilen 30 hastanın çeşitli vücut bölgelerinde kolonizasyon saptanırken, özellikle üriner sistem ve vasküler kateter ucu kolonizasyonlarının ilerleyen dönemlerde invazif enfeksiyonlara neden olabildiği (sekonder KDE ve katetere bağlı KDE gibi, Tablo I) saptanmış ve HE kontrolünde kültür pozitifliği olan her hastanın aktif olarak takip edilmesinin önemi bir kez daha gösterilmiştir. Vasküler kateter kolonizasyonu olan hastalarda, kateterlerin çıkarılmasıyla mayaların kandan temizlenmesi hızlanmaktadır. Kandidemi ortadan kalkıncaya kadar günlük kan kültürlerinin alınması ve ilk negatif kan kültüründen iki hafta sonraya kadar antifungal tedaviye devam edilmesi önerilmektedir1.

Candida türlerinin tanımlanmasında en sık ve ilk basamakta kullanılan ve duyarlılığı %95-98 arasında raporlanan germ tüp testi, insan serumunun kullanılması gibi çeşitli faktörlerden etkilenebilmektedir7,20,21. C.tropicalis germ tüp benzeri yalancı hifler oluşturabilir; ancak bu yapıların ana hücreden uzadığı noktada daralma göstermesi ayırıcı tanıda yararlıdır20,22. C.dubliniensis'in de germ tüp testi pozitif olan diğer bir tür olduğu hatırda tutulmalıdır23. Özellikle polimikrobiyal üremenin olduğu durumlarda sadece germ tüp testi ile tanımlamaya gidildiğinde, germ tüp oluşturanların yanında oluşturmayan diğer türler gözden kaçabilir.

Kümeler halinde ikili veya üçlü klamidospor oluşturma özelliği C.dubliniensis'te daha sık görülmekle beraber bu durumun türe özgü olmadığı, bazı C.albicans suşlarında da görülebildiği bildirilmiştir24. Zaman alıcı olmasının yanı sıra, çalışmamızda klamidospor saptanmayan durumlarda doğrulama amaçlı yapılan test tekrarlarında klamidospor varlığının görülmesi, yöntemin duyarlılığı konusunda çekinceler oluşturmuştur. Yüksek ısıda üreme özelliği, C.dubliniensis ve C.albicans türlerinin ayırımında kullanılan diğer bir metot olup, ayırım için en uygun ısının 45°C olduğu bildirilmiştir25. Çalışmamızda bu yöntem ile 35 C.albicans ve pozitif kontrol olarak kullanılan bir C.dubliniensis suşu doğru olarak tanımlanmıştır. Biyokimyasal özellikleri birbirine benzeyen bu iki türün ayırt edilmesinde ticari kitler de kullanılmakla birlikte bu kitlerin de yetersiz kalabileceği unutulmamalıdır26. CAC besiyerinde iki tür için en iyi ayırımın inkübasyon süresinin 72 saate uzatılmasıyla mümkün olabileceği, bu durumun ise tanıda gecikmelere neden olabileceği bildirilmektedir6. Tüm bu bilgiler ışığında, C.albicans'a göre azollere dirençli olma olasılığı daha yüksek olan C.dubliniensis suşlarının tanımlanmasında en güvenilir sonuçların moleküler çalışmalar ile elde edilebileceği ifade edilmektedir13.

Kromojenik substrat içeren CAC besiyerinin C.albicans, C.tropicalis ve C.krusei türlerinin tanımlanmasında duyarlılığı %94-100, özgüllüğü ise %99-100 olarak bildirilmektedir8,27. CAC besiyeri ile C.glabrata'yı tanımlamada güvenilir sonuçlar elde ettiklerini bildiren araştırmacılar bulunmakla beraber, bazı araştırıcılar daha az izole edilen bazı türlerin ayırımında güçlükler yaşandığını bildirmişlerdir6,27,28. Çalışmamızda bu besiyeri ile 24-36 saat içinde, C.albicans ve C.tropicalis izolatlarının tamamı kolaylıkla tanımlanmış; ayrıca 10 (%13) C.glabrata suşunun tamamı gerek saf olarak gerekse çoklu üremelerin bir parçası olduğunda zamanla koyu menekşe rengine dönüşen pembe mor kolonileri ile diğer türlerden kolaylıkla ayırt edilebilmiştir6. Nadiren izole edilen diğer Candida türlerinin çoğu ve C.parapsilosis suşları CAC besiyerinde konveks, krem gibi, pembenin çeşitli tonlarından açık mora ve fildişi rengine kadar değişebilen renklerde birbirinden ayırt edilemeyen koloniler oluşturmaktadır6. Bu çalışmada, çoğu daha sonra C.parapsilosis olarak tanımlanan 18 suş CAC besiyeri ile tür düzeyinde tanımlanamadığından ek yöntemlere gereksinim duyulmuştur.

Çoklu etkene bağlı kandidemi sıklığı %3-10 arasında değişmekte olup, polimikrobiyal enfeksiyonlarda antifungal tedavinin geniş spektrumlu olması hayati önem taşımaktadır27,28,29. CAC besiyeri polimikrobiyal üremeyi erken dönemde saptayabildiğinden bu amaçla tarama testi şeklinde kullanımı kabul görmüştür9,27. CAC besiyeri ile ilgili bulgularımız, tür tanımlamasında C.albicans için germ tüp testinden (sırasıyla %100 ve %85.7), C.tropicalis için API ID 32C testinden (sırasıyla %100 ve %92.8) daha duyarlı olduğunu ve daha kolay uygulanabildiğini göstermektedir. Ayrıca yöntem, C.glabrata ve C.krusei tanısında da etkin olarak kullanılabilmektedir. Çalışmamızda kullandığımız PCR temelli yöntemler polimikrobiyal etkenleri saptamada yetersiz kaldığından12 CAC besiyerinin çoklu üremeleri kolayca saptayabilmesi yöntemin diğer bir avantajı olarak değerlendirilmiştir. Diğer taraftan CAC besiyerinde kolonilerin renk ve morfolojik görünümlerine göre tam olarak adlandırılamayan Candida türlerinin tanımlanmasında API ID 32C sisteminden yararlanılabileceği düşüncesindeyiz.

Candida türlerinin hızlı tanısı için geliştirilen ticari sistemlerden olan API ID 32C, 60'dan fazla maya türünü güvenilir bir şekilde tanımlayabildiği için çoğu araştırıcı tarafından kullanılmaktadır. Ancak bu ve benzeri yöntemlerin tanıda yetersiz kaldığı durumlar da vardır20. Çalışmamızda, testin duyarlılığı %95.8 olarak bulunurken en iyi sonuçlar 48. saatte elde edilmiş, bu sürenin kısa veya daha uzun olmasının sonuçları olumsuz etkilediği gözlemlenmiştir.

Günümüzde Candida türlerinin hızlı tanısına yönelik PCR temelli yöntemler de geliştirilmiştir30. Fujita ve arkadaşları12, hem ITS1 hem de ITS2 bölgelerini PCR ile çoğaltarak 30 maya türüne ait 29 farklı patern rapor etmişlerdir. Ancak bu yöntemin C.albicans ve C.dubliniensis türlerini ayırt edememesi ve karışık florası olan klinik örneklerden mantarların direkt tanısında bazı sorunların olması en önemli dezavantajlar olarak değerlendirilmiştir. PCR ile elde edilen ürünlerin çeşitli restriksiyon enzimleri ile kesilmesi ya da dizi analizi, tür düzeyinde tanımlama amacıyla kullanılabilir; ancak kesin sonuca iki basamakta ulaşılabilmesi maliyeti daha da artırmaktadır10,12,13.

Sonuç olarak, germ tüp testi erken dönemde sonuç vermesi nedeniyle önemini korumaktadır. Tek başlarına kullanıldıklarında bazı eksik yönleri olan CAC besiyeri ve API ID 32C sistemi, birlikte kullanıldığında moleküler test sonuçları ile %100 uyumlu sonuç vermektedir. Öncelikle CAC besiyeri ve daha sonra (gerekirse) API ID 32C sisteminin kullanılmasıyla maliyet önemli ölçüde azalmaktadır (Tablo II). Bu çalışmada, fenotipik yöntemlerle elde edilen sonuçların doğrulanmasında kullandığımız moleküler yöntemler yüksek maliyetli olup rutinde uygulamaları efektif bulunmamıştır (Tablo II). Hastaların hastanede yatış süresi ve tedavileri sırasında uygulanan tanısal amaçlı testlerin maliyet-etkinlik durumları dikkate alındığında, moleküler yöntemlerin özellikle epidemiyolojik araştırmalarda ve doğrudan klinik örneklerde etkeni saptayabilen standardize edilmiş yöntemler geliştirildiğinde tercih edilebilir olduklarını düşünmekteyiz. Günümüzde fungal (kandida) enfeksiyonların tanısına yönelik olarak geliştirilen moleküler ticari sistemlerin halen araştırma aşamasında olduğu ve henüz tam anlamı ile standardize edilmemiş oldukları da göz önünde bulundurulmalıdır.


Tablo II

KAYNAKLAR

  1. Kauffman CA. Fungal Infections. Proc Am Thorac Soc 2006; 3(1): 35-40. [Özet]
  2. Ellepola AN, Morrison CJ. Laboratory diagnosis of invasive candidiasis. J Microbiol 2005; 43(Spec No): 65-84. [Özet] [PDF]
  3. Uzun Ö. Hastane İnfeksiyonları: Tanımlar, s: 35-57. Doğanay M, Ünal S (ed), Hastane İnfeksiyonları. 2003, 1. baskı. Bilimsel Tıp Yayınevi, Ankara.
  4. Horan TC, Gaynes RP. Surveillance of nosocomial infections, pp: 1659-702. In: Mayhall CG (ed), Hospital Epidemiology and Infection Control. 2004, 3rd ed. Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore.
  5. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Laboratory methods in basic mycology, pp: 629-713. In: Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology. 2007, 12th ed. Mosby Elsevier, St. Louis.
  6. Hospenthal DR, Beckius ML, Floyd KL, Horvath LL, Murray CK. Presumptive identification of Candida species other than C.albicans, C.krusei, and C.tropicalis with the chromogenic medium CHROMagar Candida. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2006; 5: 1. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  7. Larone DH. Yeast and yeastlike organisms, pp: 61-90. In: Medical Important Fungi. 1995, 3rd ed. ASM Press, Washington, DC.
  8. Odds FC, Bernaerts R. CHROMagar Candida, a new differential isolation medium for presumptive identification of clinically important Candida species. J Clin Microbiol 1994; 32(8): 1923-9. [Özet] [PDF]
  9. Otağ F, Aslan G, Şen S, Emekdaş G. Fungemi etkeni Candida türlerinin hızlı tanısında CHROMagar Candida besiyerinin kullanımı. Türk Mikrobiyol Cem Derg 2006; 36(4): 200-4. [Özet] [PDF]
  10. Mirhendi H, Makimura K, Khoramizadeh M, Yamaguchi H. A one-enzyme PCR-RFLP assay for identification of six medically important Candida species. Jpn J Med Mycol 2006; 47(3): 225-9. [Özet]
  11. Yamada Y, Makimura K, Mirhendi H, et al. Comparison of different methods for extraction of mitochondrial DNA from human pathogenic yeast. Jpn J Infect Dis 2002; 55: 122-5. [Özet]
  12. Fujita SI, Senda Y, Nakaguchi S, Hashimoto T. Multiplex PCR using internal transcribed spacer 1 and 2 regions for rapid detection and identification of yeast strains. J Clin Microbiol 2001; 39(10): 3617-22. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  13. Mirhendi H, Makimura K, Zomorodian K, Maeda N, Ohshima T, Yamaguchi H. Differentiation of Candida albicans and Candida dubliniensis using a single-enzyme PCR-RFLP method. Jpn J Infect Dis 2005; 58(4): 235-7. [Özet] [PDF]
  14. Akalın H. Nozokomiyal Candida İnfeksiyonları, s: 67-9. Özsüt H (ed), Klinikte Candida İnfeksiyonları Eğitim Toplantısı Kitabı. 24-25 Mart 2007, İstanbul.
  15. Warnock DW. Trends in the epidemiology of invasive fungal infections. Nihon Ishinkin Gakkai Zasshi 2007; 48(1): 1-12. [Özet]
  16. Durán MT, Velasco D, Canle D, Moure R, Villanueva R. Antifungal susceptibility of Candida spp. isolates from blood cultures in a five-year period (1997-2001). Enferm Infecc Microbiol Clin 2003; 21(9): 488-92. [Özet]
  17. Medrano DJ, Brilhante RS, Cordeiro Rde A, Rocha MF, Rabenhorst SH, Sidrim JJ. Candidemia in a Brazilian hospital: the importance of Candida parapsilosis. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2006; 48(1): 17-20. [Özet]
  18. St-Germain G, Laverdière M, Pelletier R, et al. Prevalence and antifungal susceptibility of 442 Candida isolates from blood and other normally sterile sites: results of a 2-year (1996 to 1998) multicenter surveillance study in Quebec, Canada. J Clin Microbiol 2001; 39(3): 949-53. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  19. Aquino VR, Lunardi LW, Goldani LZ, Barth AL. Prevalence, susceptibility profile for fluconazole and risk factors for candidemia in a tertiary care hospital in southern Brazil. Braz J Infect Dis 2005; 9(5): 411-8. [Özet]
  20. Lo HJ, Ho YA, Ho M. Factors accounting for misidentification of Candida species. J Microbiol Immunol Infect 2001; 34(3): 171-7. [Özet]
  21. Yücesoy M, Esen N, Yuluğ N. Use of chromogenic tube and methyl blue-sabouraud agar for the identification of Candida albicans strains. Kobe J Med Sci 2001; 47(4): 161-7. [Özet] [PDF]
  22. Yücel A, Kantarcıoğlu AS. Candida albicans'ın taksonomisindeki önemli bazı değişiklikler. Cerrahpaşa Tıp Derg 1999; 30(3): 236-46. [Tam Metin]
  23. Davis LE, Shields CE, Merz WG. Use of a commercial reagent leads to reduced germ tube production by Candida dubliniensis. J Clin Microbiol 2005; 43(5): 2465-6. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  24. Tintelnot K, Haase G, Seibold M, et al. Evaluation of phenotypic markers for selection and identification of Candida dubliniensis. J Clin Microbiol 2000; 38(4): 1599-608. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  25. Pinjon E, Sullivan D, Salkin I, Shanley D, Coleman D. Simple, inexpensive, reliable method for differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans. J Clin Microbiol 1998; 36(7): 2093-5. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  26. Pincus DH, Coleman DC, Pruitt WR, et al. Rapid identification of Candida dubliniensis with commercial yeast identification system. J Clin Microbiol 1999; 37(11): 3533-9. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  27. Ülger Toprak N, Erdoğan S, Çelik C, Johansson C. Kandidemi olgularında etken mayaların hızlı tanısında CHROMagar Candida'nın yeri. Türk Mikrobiyol Cem Derg 2003; 33(3): 262-5. [Özet] [PDF]
  28. Pfaller MA, Houston A, Coffmann S. Application of CHROMagar Candida for rapid screening of clinical specimens for Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei and Candida (Torulopsis) glabrata. J Clin Microbiol 1996; 34(1): 58-61. [Özet] [PDF]
  29. Nguyen MH, Peacock JE Jr, Morris AJ, et al. The changing face of candidemia: emergence of non-Candida albicans species and antifungal resistance. Am J Med 1996; 100(6): 617-23. [Özet]
  30. Saraçlı MA. Candida İnfeksiyonlarının Laboratuvar Tanısında Moleküler ve Genetik Tanı Yöntemleri, s: 133-44. Kiraz N, Kiremitçi A, Akgün Y (ed), Candida Mikrobiyolojisi ve İnfeksiyonları Simpozyumu Kitabı. TMC Yayını No: 43. 21-22 Haziran 2002, Eskişehir.

İletişim (Correspondence):

Dr. Fatih Şahiner,

Gülhane Askeri Tıp Akademisi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

Etlik, 06018 Ankara, Türkiye.

Tel (Phone): +90 312 304 3481,

E-posta (E-mail): sahinermikro@gmail.com

Yazdır