Yazdır

Klinik Örneklerden İzole Edilen Filamentöz Mantarların İki Farklı Yöntemle Tanımlanması ve Duyarlılık Sonuçları*

Identification of Filamentous Fungi Isolated from Clinical Samples by Two Different Methods and
Their Susceptibility Results

Şahin DİREKEL, Feza OTAĞ, Gönül ASLAN, Mahmut ÜLGER, Gürol EMEKDAŞ

Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Mersin.

Mersin University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Mersin, Turkey.

* Bu çalışma, Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi [proje no: BAP-SBE TM (ŞD) 2008-10 DR] tarafından desteklenmiş ve XXXIV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi (7-11 Kasım 2010 Girne, KKTC)'nde poster olarak sunulmuştur.

ÖZET

Küf mantarları doğada çok yaygın olarak bulunmaktadır. Aspergillus başta olmak üzere Fusarium, Scedosporium ve Zygomycetes türleriyle oluşan invaziv fungal enfeksiyonlar özellikle immün sistem yetmezliği bulunan hastalarda morbidite ve mortalitenin önemli nedenlerinden biridir. Bu çalışmada, klinik örneklerden izole edilen filamentöz mantarların konvansiyonel ve moleküler yöntemlerle tanımlanması ve antifungal duyarlılıklarının belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesinin kritik ünitelerinde yatan hastalardan, Nisan 2008-Ocak 2010 tarihleri arasında laboratuvarımıza gönderilen toplam 6742 klinik örnek dahil edilmiştir. Örneklerden izole edilen mantarlar klasik mikolojik yöntemler ve polimeraz zincir reaksiyonu bazlı DNA dizi analizi ile tanımlanmış; antifungal duyarlılıkları ise amfoterisin B, vorikonazol, flukonazol, kaspofungin ve posakonazole E-test ile, vorikonazol ve flukonazole disk difüzyon testiyle belirlenmiştir. Çalışmamızda, 32 hastaya (13'ü kadın, 19'u erkek; yaş aralığı 7 ay-77 yıl, yaş ortalaması: 46.6 yıl) ait 71 (%1.05) örnekten (13 balgam, 4 yara, 4 periton diyaliz sıvısı, 3 dış kulak yolu akıntısı, 3 apse ve birer beyin omurilik sıvısı, kan, doku biyopsi örneği, burun sürüntüsü, konjunktiva sürüntüsü örneği) filamentöz mantar izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Hastaların %62.3'ünde bir veya birkaç risk faktörü (kronik böbrek yetmezliği 8, kronik obstrüktif akciğer hastalığı 6, kanser 6, diabetes mellitus 5, periferal damar hastalığı 5) mevcuttur. Klasik yöntemle izolatların altısı Aspergillus niger, altısı Aspergillus flavus, beşi Aspergillus fumigatus, dördü Aspergillus terreus, beşi Fusarium spp., ikisi Bipolaris spp. ve birer adedi Acremonium spp., Aurebasidium spp., Mucor spp. ve Scedosporium spp. olarak tanımlanmıştır. DNA dizi analizi sonuçlarına göre sadece üç filamentöz mantarın tanısında farklılık saptanmıştır. Her iki yöntemle Aspergillus suşlarının tümü tür düzeyinde; diğer mantarlar ise konvansiyonel yöntemle cins, DNA dizi analiziyle tür düzeyinde tanımlanmıştır. E-test ile flukonazol minimum inhibitör konsantrasyonu (MİK) değerleri, Scedosporium spp. hariç, bütün suşlarda > 256 mg/L, vorikonazol MİK değeri tüm Aspergillus türlerinde < 0.38 mg/L, kaspofungin MİK değeri Fusarium, Scedosporium, Rhizopus ve Bipolaris suşlarında > 32 mg/L, Aspergillus türlerinde ≤ 0.006-0.125 mg/L olarak saptanmıştır. Posakonazolün MİK değeri üç suşta (Fusarium equiseti, Cylindrocarpon lichenicola ve Rhizopus oryzae) > 32 mg/L olarak bulunurken, diğer suşlarda < 1.5 mg/L olarak tespit edilmiştir. Amfoterisin B MİK değeri Fusarium, Scedosporium, Rhizopus ve tüm A.terreus suşlarında > 32 mg/L iken, diğer suşlarda < 2 mg/L olarak bulunmuştur. E-test ve disk difüzyon antifungal sonuçlarının birbiriyle ve yapılan diğer çalışmalarla uyumlu olduğu saptanmıştır. Sonuç olarak, özellikle riskli hastalardan sıklıkla izole edilen Aspergillus ve Fusarium gibi filamentöz mantarların tanısının klasik yöntemle doğru olarak ve kolayca yapılabildiği kanısına varılmış; invaziv fungal enfeksiyonların giderek arttığı günümüzde, özellikle kritik hastaların klinik örneklerinde filamentöz mantarların araştırılmasının mortalite riskini azaltması bakımından önemli olduğu düşünülmüştür.

Anahtar sözcükler: Filamentöz mantar; Aspergillus; Fusarium; DNA dizi analizi; antifungal duyarlılık.

ABSTRACT

Molds are widely distrubuted in nature. Aspergillus spp. represent the most frequently observed causative agents, however less frequent pathogens Fusarium, Scedosporium and Zygomycetes have also been considered the most important causes of morbidity and mortality in profoundly immunosuppressed hosts. The aims of this study were to identify filamentous fungi isolated from clinical specimens by conventional and molecular methods, and to detect their antifungal susceptibilities. A total of 6742 clinical specimens obtained from hospitalized patients at critical units of Mersin University Medical Faculty Hospital and sent to our laboratory between April 2008-January 2010 were included in the study. The isolates were identified by classical mycological methods and polymerase chain reaction-based DNA sequencing. Susceptibilities to fluconazole and voriconazole were tested by disk diffusion method and to fluconazole, voriconazole, amfoterisin B, caspofungin and posaconazole by E-test. Filamentous fungi were isolated from 71 (1.05%) samples (13 sputum, 4 wound, 4 peritoneal fluid, 3 extrenal ear discharge, 3 abscess and one of each cerebrospinal fluid, blood, tissue biopsy, nasal swab and conjunctival swab) which belonged to 32 patients (13 female, 19 male; age range 7 months-77 years, mean age: 46.6 years). Of the patients 62.3% presented one or more risk factors such as chronic renal failure (n= 8), chronic obstructive lung disease (n= 6), malignancy (n= 6), diabetes mellitus (n= 5) and peripheral vascular disease (n= 5). Of the isolates six were identified as Aspergillus niger, six as Aspergillus flavus, five as Aspergillus fumigatus, four as Aspergillus terreus, five as Fusarium spp., two as Bipolaris spp., and one of each as Acremonium spp., Aurebasidium spp., Mucor spp., and Scedosporium spp. By conventional methods. Three isolates exhibited different identities by DNA sequencing. All Aspergillus isolates were correctly identified at species level by both methods, Other fungi were identified at genus level by conventional methods and at species level by DNA sequencing. Fluconazole minimum inhibitory concentration (MIC) values were determined as > 256 mg/L in all strains, except Scedosporium; voriconazole MIC values were < 0.38 mg/L in all Aspergillus spp. Caspofungin MIC values were > 32 mg/L for Fusarium, Scedosporium, Rhizopus and Bipolaris strains and ≤ 0.006-0.125 mg/L in all Aspergillus isolates, In three strains (Fusarium equiseti, Cylindrocarpon lichenicola and Rhizopus oryzae) posaconazole minimum inhibitory concentration (MIC) values were > 32 mg/L, however it was < 1.5 mg/L, for the other strains. Amphotericin B MIC values were > 32 mg/L for Fusarium, Scedosporium, Rhizopus and all A.terreus strains and < 2 mg/L for the others. E-test and disk diffusion test results were compatible with each other for all the antifungal agents tested. In conclusion, the identification of filamentous fungi such as Aspergillus and Fusarium spp. is easily and reliably achieved by conventional methods. Since the rate of invasive fungal infections is increasing currently, filamentous molds should be searched especially in the clinical specimens of immunocompromised patients for accurate and prompt diagnosis of such infections and to decrease the related mortality risk.

Key words: Filamentous fungi; Aspergillus; Fusarium; DNA sequencing; antifungal susceptibility.

Geliş Tarihi (Received): 04.05.2011 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 22.11.2011

GİRİŞ

Doğada yaygın olarak bulunan filamentöz mantarlar, özellikle belirli risk faktörlerine sahip hastalarda ciddi fırsatçı enfeksiyonlara neden olabilmektedir1. Örneğin; immün sistemi baskılanmış hastalarda, Aspergillus fumigatus başta olmak üzere Aspergillus türleriyle oluşan invaziv enfeksiyonların mortalitesi %58-99 gibi yüksek oranlara ulaşmaktadır2,3. Ancak son yıllarda Aspergillus harici filamentöz mantarların insidansında da bir artış saptanmakta olup, büyük çoğunluğu hematolojik maligniteli hastalar, altta yatan hastalığı olanlar, transplant alıcıları ve kortikosteroid ya da immünsüpresif ilaç kullanan hastalarda olmak üzere Fusarium, Bipolaris, Scedosporium ve Mucorales grubu gibi mantarlarla oluşan, mortalite oranı yüksek invaziv enfeksiyonlara rastlanmaktadır4,5,6,7,8,9,10,11. İnvaziv mantar enfeksiyonlarında erken tanı, uygun tedavinin bir an önce başlanabilmesi için hayati öneme sahiptir. Bu enfeksiyonlar çok hızlı ilerlediği ve tanımlanmasında güçlükler yaşandığı için, kesin tanı çoğunlukla otopsi sırasında konmaktadır12. Buna karşın aspergillozun tanısında polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve galaktomannan tespiti gibi hızlı yöntemlerin kullanılması, gecikmiş tanıdan kaynaklanan ölüm oranlarını düşürmektedir13.

Günümüzde mantar enfeksiyonlarının tedavisi büyük bir sorun oluşturmaktadır. Antifungal ajanların kullanımı, toksisitesi veya uygun olmayan farmakokinetik özelliklerine bağlı olarak çeşitli ilaçlarla etkileşimleri nedeniyle oldukça kısıtlıdır. Ayrıca, kullanımda olan antifungal ilaçlara karşı görülen direnç de giderek artış göstermektedir14,15. Bu çalışmada, Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesinde yatan hastaların klinik örneklerinden izole edilen filamentöz mantarların klasik ve moleküler yöntemlerle tanımlanması ve antifungal ilaçlara karşı duyarlılıklarının belirlenmesi amaçlanmıştır.

GEREÇ ve YÖNTEM

Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Sağlık Araştırma ve Uygulama Merkezinde Nisan 2008-Ocak 2010 tarihleri arasında kritik ünitelerde (yoğun bakım üniteleri, reanimasyon, diyaliz üniteleri, transplantasyon, onkoloji) ve diğer servislerde (göğüs hastalıkları, nefroloji, hematoloji, pediatri, enfeksiyon hastalıkları, kardiyoloji, dermatoloji ve tüm cerrahi servisler) yatan ve uzun süreli tedavi gören hastalardan tıbbi mikrobiyoloji anabilim dalı laboratuvarına gönderilen 6742 klinik örnek çalışma kapsamına alındı.

Örneklerin ekimi için %5 kanlı agar, EMB (Eosin-methylene-blue) agar, çikolata agar ve Saboraud dekstroz agar (SDA) besiyerleri kullanıldı. Bakteriyolojik açıdan değerlendirildikten sonra küf üremesinin takibi için petriler 25°C'de en az yedi gün daha inkübe edildi. Üreyen küf kolonileri, makroskobik (koloni büyüklüğü ve rengi, yüzey görünümü, pigment oluşumu vb.) ve laktofenol pamuk mavisi (LFPM) ile boyanarak mikroskobik (hif ve spor yapıları, konidyumların dizilişi vb.) özelliklerine göre değerlendirildi ve klasik yöntemlerle tanımlandı16,17.

Mikroskobik değerlendirme sonuçlarına göre, her hastadan birer suşun DNA dizi analizi için çalışılması uygun bulundu. Patates dekstroz agarda (PDA) saf olarak üretilen kolonilerin hif ve sporları DNA izolasyonu için kullanıldı. DNA ekstraksiyonları, dondurma-kaynatma, sıvı nitrojen, Qiamp DNA Mini kit (Qiagen) gibi farklı yöntemlerle ve modifiye edilerek kullanılan Makimura ve arkadaşlarının18 yöntemiyle gerçekleştirildi. DNA miktarları spektrofotometre (ND 1000 UV-Vis, NanoDrop Technologies, ABD) ile ölçüldü. DNA dizilerinin çoğaltılması için daha önce tanımlanmış olan protokole göre PCR karışımı hazırlanarak termal döngü cihazına (Eppendorf Mastercycler, Almanya) yerleştirilerek amplifiye edildi.

PCR karışımı; toplam 25 µl olacak şekilde, örnek başına 3 µl kalıp DNA, 2.5 µl PCR tamponu (10X, Vivantis), 2 µl MgCl2 (25 mM, Vivantis), 0.3 µl dNTP karışımı (10 mM, Vivantis), 0.3 µl ITS (internal transcribed spacer)-1 primeri (100 pmol) (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'), 0.3 µl ITS-4 primeri (100 pmol) (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'), 0.2 µl Taq DNA polimeraz (5 U/µl, Vivantis) ve 16.4 µl steril nükleaz içermeyen distile su kullanılarak hazırlandı. Amplifikasyon şartları; 94°C'de 5 dakikalık 1 döngü başlangıç denatürasyonunu takiben, 94°C'de 20 saniye denatürasyon, 58°C'de 45 saniye bağlanma, 72°C'de 1.5 dakika uzama olmak üzere toplam 40 döngü ve 72°C'de 7 dakikalık 1 döngü son uzama şeklinde uygulandı. PCR ürünleri 0.5 µg/ml etidyum bromür içeren %1.5'lik agaroz jelde elektroforeze tabi tutularak mantarlara özgü DNA bantları (500-600 baz çifti) ultraviyole ışık altında incelendi.

Klinik suşların DNA dizi analizleri, elde edilen PCR ürünleri ve primerleri kullanılarak özel bir laboratuvarda (RefGen) ABI 3100 Genetic Analyzer cihazı kullanılarak gerçekleştirildi. Dizi analizi verileri "National Center for Biotechnology Information (Bethesda, ABD)" BLAST sistemi (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) kullanılarak analiz edildi ve suşlar tür düzeyinde tanımlandı.

Suşların antifungal duyarlılıkları, amfoterisin B, vorikonazol, flukonazol, kaspofungin ve posakonazol için E-test ile, vorikonazol ve flukonazol için disk difüzyon testi ile GM-MHA besiyeri (%2 glukoz ve 0.5 µg/ml metilen mavisi eklenmiş Mueller-Hinton Agar) kullanılarak araştırıldı. PDA'da üretilen suşların spor süspansiyonları 10 ml steril serum fizyolojik içerisinde 1 x 106 spor/ml olacak şekilde hazırlandı. GM-MHA besiyeri yüzeyine 5'er ml'lik hacimlerde yayılan spor süspansiyonlarının fazlası beş dakika bekletildikten sonra steril pipetle toplanarak atıldı. Besiyerine inokülasyon için 15 dakika beklendikten sonra E-test stripleri her petri için bir tane olacak şekilde yerleştirildi. Antifungal diskler için tek petri kullanıldı. 35°C'de inkübe edilen petriler, 24 ve 48 saat sonra değerlendirilerek E-test MİK değerleri ve disk difüzyon zon çapları belirlendi.

Standart kontrol suşları olarak Aspergillus niger (RSHMB 04017) ve A.fumigatus (RSHMB 04005) kullanıldı.

BULGULAR

Çalışmamızda, 22 aylık dönemde 32 hastaya ait 71 (%1.05) örnekten filamentöz mantar izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Hastaların 13'ü kadın 19'u erkek olup, beşi pediatri hastası olmak üzere yaş aralığı 7 ay-77 yıl arasında (ortalama: 46.6 yıl) değişmektedir. Hastaların sekizinde kronik böbrek yetmezliği, altısında kronik obstrüktif akciğer hastalığı, altısında kanser, beşinde diabetes mellitus ve beşinde periferal damar hastalığı mevcut olup, küf mantarı izole edilen hastaların %62.3'ünde risk faktörü varlığı saptanmıştır.

Hiçbir hastada birden fazla türe ait küf üremesi olmamıştır. Her hastadan birer suş olmak üzere 13 balgam, 4 yara, 4 periton diyaliz sıvısı, 3 dış kulak yolu akıntısı, 3 apse ve birer beyin omurilik sıvısı (BOS), burun sürüntüsü, doku biyopsi örneği, periferik kan ve konjunktiva sürüntüsünden izole edilen suşların klasik yöntemle altısı A.niger (%18.7), altısı Aspergillus flavus (%18.7), beşi Aspergillus fumigatus (%15.6), dördü Aspergillus terreus (%12.5) olmak üzere tür düzeyinde, beşi Fusarium (%15.6), ikisi Bipolaris (%6.2) ve birer Scedosporium (%3.1), Acremonium (%3.1), Mucor (%3.1), Aureobasidium (%3.1) olmak üzere cins düzeyinde tanımlanmıştır (Tablo I).


Tablo I

Dondurma-kaynatma yöntemiyle Fusarium, sıvı nitrojen yöntemiyle Fusarium, Rhizopus ve Scedosporium, hazır DNA ekstraksiyon kiti (Qiagen, ABD) ile A.fumigatus ve A.flavus türleri ve modifiye yöntemle18 bütün türlerin DNA ekstraksiyonları yapılabilmiştir. PCR ürünlerinin görüntüleri Resim 1'de verilmiş; ancak özellikle bazı Aspergillus türlerinde (A.niger, A.flavus, A.fumigatus) çok zayıf bantlar elde edildiği için tekrar ikinci bir DNA ekstraksiyonu yapılmıştır (Resim 2).


Resim 1


Resim 2

Klasik yöntemle elde edilen sonuçlardan farklı olarak DNA dizi analizi ile Fusarium, Bipolaris, Scedosporium ve Aureobasidium suşları tür düzeyinde tanımlanmıştır. Acremonium, Mucor ve Fusarium olarak cins düzeyinde tanımladığımız suşlar, DNA dizi analizi ile sırasıyla Lecythophora hofmannii, Rhizopus oryzae ve Cylindrocarpon lichenicola olarak tür düzeyinde tanımlanmıştır.

Aspergillus spp. kronik böbrek yetmezliği, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, kanser, diabetes mellitus ve periferal damar hastalığı olan hastalardan; Fusarium spp. kronik böbrek yetmezliği, diabetes mellitus ve kanserli hastalardan; Bipolaris spp. kronik böbrek yetmezliği ve diabetes mellituslu hastalardan; Lecythophora kronik böbrek yetmezliği ve diabetes mellitusu olan bir hastadan; Rhizopus pansitopenisi olan hastadan; Scedosporium yabancı cisim batması olan hastadan ve Aureobasidium penil protez implantasyonu yapılan hastadan izole edilmiştir. Aspergillus üreyen 21 hastadan altısı invaziv pulmoner aspergilloz ve biri meningosel aspergilloz tanısı almıştır. Hastaların 7 (%21.8)'si filamentöz mantar izolasyonundan kısa bir süre sonra hayatını kaybetmiştir.

İzolatların E-test ve disk difüzyon yöntemleriyle saptanan antifungal duyarlılık sonuçları ayrıntılı olarak Tablo II'de görülmektedir.


Tablo II

TARTIŞMA

Son yıllarda filamentöz mantarların neden olduğu enfeksiyonların sayısında yaygın bir artış olduğu bildirilmiştir19,20. Birçok çalışmada hastaların klinik örneklerinden %69.8-85 oranlarıyla en sık Aspergillus cinsi küf mantarları izole edilmektedir3,8,13,21,22. Bizim çalışmamızda da ilk sırayı %62.5 izolasyon oranıyla Aspergillus spp. almıştır. Casto'n ve arkadaşları22 retrospektif çalışmalarında 1994-2004 yılları arasındaki dönemde yatarak ya da ayakta tedavi gören 332 hastanın 505 solunum yolu örneğinden sırasıyla Aspergillus (%80.5), Penicillium (%7.9), Fusarium (%2.1), Scedosporium (%5.3), Alternaria (%1.4), Paecilomyces (%0.8), Cladosporium (%0.8), Mucor (%0.6), Rhizomucor (%0.2) ve Trichoderma (%0.2) türlerini izole ettiklerini bildirmişlerdir. Bizim çalışmamızda, incelenen toplam 6742 klinik örnekten 32 hastaya ait 71 (%1.05) örnekte filamentöz mantar üremiş ve bunların klasik yöntemle tanımlanması sonunda sırasıyla A.niger (%18.7), A.flavus (%18.7), A.fumigatus (%15.6), A.terreus (%12.5), Fusarium spp. (%15.6), Bipolaris spp. (%6.2) ve %3.1 oranında olmak üzere Aureobasidium spp., Acremonium spp., Mucor spp. ve Scedosporium spp. saptanmıştır. Husain ve arkadaşlarının20 çok merkezli olarak dört yıllık dönemde yaptıkları çalışmada da, invaziv küf enfeksiyonu bulunan 53 karaciğer/kalp alıcısından, bizim izolat dağılımımıza benzer şekilde, en çok Aspergillus spp. (n= 37) izole edilmiş, bunu Aspergillus dışı Hyalohyphomycetes (n= 5), Phaeohyphomycetes (n= 5), Zygomycetes (n= 3) ve diğerleri (n= 3) izlemiştir. Eren ve arkadaşları23, 10 aylık dönemde kritik ünitelerde yatan immün sistemi baskılanmış 43 hastaya ait klinik örnekleri mikolojik olarak değerlendirmişler ve örneklerin sekizinden filamentöz mantar (dört Penicillum chrysogenum, iki A.fumigatus, bir A.flavus, bir Valsa sordida) izole ederek moleküler yöntemlerle doğrulamışlardır.

Filamentöz mantar üretilen hastaların çoğunda altta yatan bir hastalık bulunmaktadır. Nir-Paz ve arkadaşları6 Fusarium izolasyonu yaptıkları 89 klinik örneğin 22'sinin kronik böbrek yetmezliği, 27'sinin diabetes mellitus, 15'inin periferal damar hastalığı, 14'ünün iskemik kalp hastalığı ve sekizinin yanıklı hastalara ait olduğunu belirtmişlerdir. Çalışmamızda da en sık tespit edilen Aspergillus ve Fusarium türlerinin kronik böbrek yetmezliği, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, kanser, diabetes mellitus ve periferal damar hastalığı bulunan hastalardan izole edildiği izlenmiştir. Yapılan bir çalışmada, 22 hematopoietik kök hücre alıcısının %82'sinden Aspergillus cinsi, %18'inden Zygomycetes grubu izole edilmiş ve hastalardan 20 (%91)'sinin öldüğü bildirilmiştir21. Karacan ve arkadaşlarının24 solid organ transplantasyonu yapılan 207 hastayı üç yıl izledikleri çalışmalarında, yedi hastaya invaziv pulmoner aspergilloz tanısı konulmuş ve bunların 5 (%71.4)'i antifungal tedaviye rağmen kaybedilmiştir. Bizim çalışmamızda ise mortalite oranı %21.8 (7/32) olarak saptanmıştır.

Filamentöz mantarlar, sert hücre duvar yapılarına ve aktif nükleazlara sahip oldukları için genomik DNA ekstraksiyonu oldukça zahmetli ve zaman alıcı bir işlemdir25. Çalışmamızda Aspergillus'ların DNA ekstraksiyonunda farklı yöntemler denenmiş olmasına rağmen tam olarak etkili sonuçlar Makimura ve arkadaşlarının18 yöntemiyle alınmıştır. Elde edilen DNA'ların dizi analizi sonuçları, klasik yöntemlerle elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldığında, Aspergillus'ların tamamının klasik yöntemlerle tür düzeyinde; Fusarium suşlarından biri hariç diğerlerinin cins düzeyinde; Bipolaris, Scedosporium ve Aureobasidium suşlarının ise sadece cins düzeyinde doğru olarak tanımlanabildiği görülmüştür. Klasik yöntemle sırasıyla Acremonium, Mucor ve Fusarium olarak tanımladığımız suşlar dizi analizi sonucuna göre yine sırasıyla Lecythophora, Rhizopus ve Cylindrocarpon olarak tanımlanmıştır. Buna göre klasik yöntemle cins düzeyinde doğru tanımlama oranı %90 (29/32) olarak tespit edilmiştir. Klasik yöntemle tanımlanan tüm Aspergillus türleri moleküler yöntemle %100 uyumlu bulunmuş; diğer üç suşun klasik yöntemle tanımlanan cinslerle aynı aile içerisinde olduğu belirlenmiştir. Bunun, klasik yöntemlerle tiplendirme yapılırken gözden kaçırılmış olan küçük ayrıntılardan kaynaklandığı düşünülmüştür. Yaygın olarak izole edilen filamentöz mantarlar mikoloji atlaslarından yararlanılarak doğru olarak tanımlanabilse de, daha nadir rastlanan ve klasik yöntemle zor tanımlanan suşların referans laboratuvarlarda incelenmesi uygun olacaktır.

Filamentöz mantarların antifungal duyarlılıklarının belirlenmesinde uzun zamandır standardize olmayan test yöntemleri kullanıldığından direnç durumlarının yorumlanması oldukça zordur. Bu amaçla "Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)" referans yöntem olarak sıvı dilüsyon yöntemlerini önermekte ve E-test ile makro ve mikrodilüsyon testleri arasında iyi bir uyum olduğu bildirilmektedir26. Yapılan çalışmalarda Aspergillus ve Fusarium suşlarında E-test ile mikrodilüsyon arasındaki uyumun %100, makrodilüsyon yöntemiyle %80 olduğu ifade edilmiştir26,27,28. Buna karşın Aspergillus spp. için antifungal duyarlılık testleri hastanelerdeki rutin klinik mikrobiyoloji laboratuvarları için önerilmemektedir29. Çalışmamızda tüm izolatların antifungal duyarlılıkları E-test ve disk difüzyon yöntemleriyle araştırılmıştır (Tablo II). Flukonazolün Aspergillus türlerine karşı temel olarak etkisiz olduğu bildirilmektedir29,30. Çalışmamızdaki tüm Aspergillus suşlarının MİK değerleri > 256 mg/L ve disk difüzyon ile zon çapı < 6 mm olarak saptanmıştır. Vorikonazolün Aspergillus türlerine karşı in vitro ve in vivo mükemmel bir aktivite sergilediği vurgulanmıştır31. Çalışmamızda Aspergillus spp. için E-test ile MİK değeri 24 saatte < 0.38 mg/L bulunurken, disk difüzyon ile zon çapının ≥ 15 mm olduğu görülmüştür. Kaspofungin; Fusarium, Scedosporium, Zygomycetes, P. boydii ve dematiaceous küflere karşı ya sınırlı bir etkiye sahiptir veya etkisizdir32. Bizim çalışmamızda da Fusarium spp., Scedosporium spp., Rhizopus spp. ve Bipolaris spp. suşlarında kaspofungin E-test MİK değerleri > 32 mg/L olarak tespit edilmiştir. Aspergillus'larda kaspofungin duyarlılığı E-test ile ≤ 0.006-0.125 mg/L MİK değerleri arasında saptanmış ve diğer çalışmalarla uyumlu olduğu görülmüştür33,34.

Posakonazolün sıklıkla izole edilen birçok maya (Candida) ve filamentöz mantara (Aspergillus, Zygomycetes) karşı etkili olduğu bildirilmiştir32. Çalışmamızda üç suşun (birer Fusarium, Cylindrocarpon ve Rhizopus suşu) posakonazol MİK değeri > 32 mg/L bulunurken, diğer suşların MİK değeri < 1.5 mg/L olarak tespit edilmiştir. Özellikle Aspergillus suşlarının diğer çalışmalarla35 uyumlu olarak düşük MİK değerine sahip olduğu görülmüştür. A.terreus suşlarının genellikle amfoterisin B'ye dirençli olduğu bildirilirken29, çalışmamızda risk faktörü taşımayan dört hastadan izole edilen ve klasik yöntemle tanımlanan A.terreus suşlarının da E-test ile MİK değerleri > 32 mg/L olarak saptanmıştır. Ayrıca, Fusarium spp., Scedosporium spp., Rhizopus spp. amfoterisin B MİK değerleri > 32 mg/L olarak bulunurken, diğer suşların MİK değerinin < 2 mg/L olduğu görülmüştür.

Sonuç olarak, invaziv fungal enfeksiyonların giderek arttığı günümüzde özellikle kritik hastaların klinik örneklerinde filamentöz mantarların araştırılması önemlidir. Sıklıkla izole edilen Aspergillus ve Fusarium gibi mantarların LFPM ile boyanmış preparatlarının incelenmesiyle kolayca tanısı yapılabilmektedir. Bu prospektif çalışmanın Mersin'de ilk defa yapılıyor olması çalışmamızın önemini artırmaktadır. Çalışmamız sırasında artan klinik-laboratuvar iş birliği sayesinde mikoloji laboratuvarlarının önemi anlaşılmıştır. Nitekim nötropenik ateş, immün sistem yetmezliği ve malignitesi olan hastaların örneklerinden izole edilen mantar etkenlerinin doğru ve kısa sürede tanımlanarak klinisyenin en kısa zamanda tedaviye başlamasının sağlanmasıyla, klinik örneklerden küf mantarlarının aranmasıyla ilgili talepler artmıştır. Ek olarak çalışmamızın verilerinin, bölgemiz ve ülkemizdeki klinik filamentöz mantarların epidemiyolojik durumunun belirlenmesinde daha sonra yapılacak olan çalışmalara ışık tutacağı düşünülmüştür.

KAYNAKLAR

  1. Maertens J, Vrebos M, Boogaerts M. Assessing risk factors for systemic fungal infections. Eur J Cancer Care (Engl) 2001; 10(1): 56-62. [Özet]
  2. Rubin RH. Fungal infections in the organ transplant recipient, pp: 473-80. In: Anaissie EJ, McGinnis MR, Pfaller MA (eds), Clinical Mycology. 2009, 2nd ed. Chuchill Livingstone, Philadelphia.
  3. Ozçelik T, Ozkalemkaş F, Kocaeli H, et al. Successful treatment of neuroaspergillosis in a patient with acute lymphoblastic leukemia: role of surgery, systemic antifungal therapy and intracavitary therapy. Mikrobiyol Bul 2009; 43(3): 499-506. [Özet] [PDF]
  4. Ener B. Nadir görülen fırsatçı mikozlar, s: 1105-9. Ustaçelebi Ş (ed), Temel ve Klinik Mikrobiyoloji Kitabı. 1999, 1. Baskı. Güneş Kitabevi, Ankara.
  5. Karaarslan A, Arikan S, Karaarslan F, Cetin ES. Skin infection caused by Scedosporium apiospermum. Mycoses 2003; 46(11-12): 524-6. [Özet]
  6. Nir-Paz R, Strahilevitz J, Shapiro M, et al. Clinical and epidemiological aspects of infections caused by Fusarium species: a collaborative study from Israel. J Clin Microbiol 2004; 42(8): 3456-61. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  7. Greenberg RN, Scott LJ, Vaughn HH, Ribes JA. Zygomycosis (mucormycosis): emerging clinical importance and new treatments. Curr Opin Infect Dis 2004; 17(6): 517-25. [Özet]
  8. Kantarcıoğlu AS, Yücel A. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı'nda tanımlanmış olan Pseudallescheriasis olguları ve Avrupa Tıp Mikolojisi Konfederasyonu (ECMM) Pseudallescheriasis çalışma grubu. Cerrahpasa J Med 2005; 36 (2): 90-6. [PDF]
  9. Kalkanci A, Kustimur S, Sucak GT, et al. Fulminating fungal sinusitis caused by Valsa sordida, a plant pathogen, in a patient immunocompromised by acute myeloid leukemia. Med Mycol 2006; 44(6): 531-9. [Özet]
  10. Anaissie EJ, Grazziutti M, Nucci M. Invasive fungal infections in cancer patient, pp: 431-71. In: Anaissie EJ, McGinnis MR, Pfaller MA (eds), Clinical Mycology. 2009, 2nd ed. Chuchill Livingstone, Philadelphia.
  11. Coşkun T. Ev ortam havasındaki küf ve mayaların ve ev karakteristiklerinin çocuklarda allerjik astımla ilişkisi. Yüksek Lisans Tezi, Mersin Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 2009. Mersin.
  12. Yeğenoğlu Y. İnvaziv mantar hastalıklarının mikolojik tanısı. İstanbul Tıp Fakültesi Dergisi 2007; 70(1): 23-8.
    [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  13. Luong ML, Clancy CJ, Vadnerkar A, et al. Comparison of an Aspergillus real-time polymerase chain reaction assay with galactomannan testing of bronchoalveolar lavage fluid for the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis in lung transplant recipients. Clin Infect Dis 2011; 52(10): 1218-26. [Özet]
  14. Gündüz K. Safety of systemic antifungal drugs. Türkderm 2003; 37(4): 294-301. [Özet] [PDF]
  15. Dalgıç N, İnce E. Sistemik etkili antifungal ilaçlar. Klinik Pediatri 2005; 4(3): 90-8.
  16. Winn WC Jr, Allen SD, Janda WM, et al. Laboratory approach to the diagnosis of fungal infections, pp: 1156-66. In: Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 2006, 6th ed. Lippincott Williams, Philadelphia.
  17. Winn WC Jr, Allen SD, Janda WM, et al. Hyaline molds and hyalohyphomycosis, pp: 1172-87. In: Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 2006, 6th ed. Lippincott Williams, Philadelphia.
  18. Makimura K, Murayama SY, Yamaguchi H. Detection of a wide range of medically important fungi by the polymerase chain reaction. J Med Microbiol 1994; 40(5): 358-64. [Özet] [PDF]
  19. Marr KA, Carter RA, Crippa F, Wald A, Corey L. Epidemiology and outcome of mould infections in hematopoietic stem cell transplant recipients. Clin Infect Dis 2002; 34(7): 909-17. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  20. Husain S, Alexander BD, Munoz P, et al. Opportunistic mycelial fungal infections in organ transplant recipients: emerging importance of non-Aspergillus mycelial fungi. Clin Infect Dis 2003; 37(2): 221-9. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  21. Shaukat A, Bakri F, Young P, et al. Invasive filamentous fungal infections in allogeneic hematopoietic stem cell transplant recipients after recovery from neutropenia: clinical, radiologic, and pathologic characteristics. Mycopathologia 2005; 159(2): 181-8. [Özet] [PDF]
  22. Caston JJ, Linares MJ, Gallego C, et al. Risk factors for pulmonary Aspergillus terreus infection in patients with positive culture for filamentous fungi. Chest 2007; 131(1): 230-6. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  23. Eren A, Kuştimur S, Kalkanci A, Unverdi S, Aktaş F, Sucak GT. Investigation of the effect of constructions in hospital environment on the crucial units for immunocompromised patients and the development of opportunistic mold infections. Mikrobiol Bul 2008; 42(1): 83-93. [Özet] [PDF]
  24. Karacan Ö, Akçay Ş, Eyüboğlu FÖ ve ark. Solid organ transplant alıcılarında invaziv pulmoner aspergillozis. Tuberk Toraks 2003; 51(2): 177-82. [Özet] [PDF]
  25. Suzuki S, Taketani H, Kusumoto K, Kashiwagi Y. High-throughput genotyping of filamentous fungus Aspergillus oryzae based on colony direct polymerase chain reaction. J Biosci Bioeng 2006; 102(6): 572-4. [Özet]
  26. Pfaller MA, Messer SA, Mills K, Bolmström A. In vitro susceptibility testing of filamentous fungi: comparison of Etest and reference microdilution methods for determining itraconazole MICs. J Clin Microbiol 2000; 38(9): 3359-61.
    [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  27. Lalitha P, Shapiro BL, Srinivasan M, et al. Antimicrobial susceptibility of Fusarium, Aspergillus, and other filamentous fungi isolated from keratitis. Arch Ophthalmol 2007; 125(6): 789-93. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  28. Mukherjee PK, Sheehan DJ, Hitchcock CA, Ghannoum MA. Combination treatment of invasive fungal infections. Clin Microbiol Rev 2005; 18(1): 163-94. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  29. Singh N, Paterson DL. Aspergillus infections in transplant recipients. Clin Microbiol Rev 2005; 18(1): 44-69.
    [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  30. Xie L, Zhai H, Zhao J, Sun S, Shi W, Dong X. Antifungal susceptibility for common pathogens of fungal keratitis in Shandong Province, China. Am J Ophthalmol 2008; 146(2): 260-5. [Özet]
  31. Latgé JP. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clin Microbiol Rev 1999; 12(2): 310-50. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  32. Cornely OA. Aspergillus to Zygomycetes: causes, risk factors, prevention, and treatment of invasive fungal infections. Infection 2008; 36(6): 605-6.
  33. Martos AI, Romero A, González MT, et al. Evaluation of the Etest method for susceptibility testing of Aspergillus spp. and Fusarium spp. to three echinocandins. Med Mycol 2010; 48(6): 858-61. [Özet]
  34. Shi JY, Xu YC, Shi Y, et al. In vitro susceptibility testing of Aspergillus spp. against voriconazole, itraconazole, posaconazole, amphotericin B and caspofungin. Chin Med J (Engl) 2010; 123(19): 2706-9. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  35. Alanio A, Sitterlé E, Liance M, et al. Low prevalence of resistance to azoles in Aspergillus fumigatus in a French cohort of patients treated for haematological malignancies. J Antimicrob Chemother 2011; 66(2): 371-4. [Özet]

İletişim (Correspondence):

Dr. Şahin Direkel,

Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

Mersin, Türkiye.

Tel (Phone): +90 505 911 2595,

E-posta (E-mail): sdirekel@yahoo.com

Yazdır