Kefir Tüketiminin İnsan Bağışıklık Sistemi Üzerine Etkileri: Bir Sitokin Çalışması
The Effect of Kefir Consumption on Human Immune System: A Cytokine Study
Ali Kudret ADİLOĞLU1, Nurettin GÖNÜLATEŞ2, Mehmet İŞLER3, Altuğ ŞENOL3
1 Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Bölümü, Ankara.
1 Ankara Education and Research Hospital, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.
2 Gümüşhane Devlet Hastanesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı, Gümüşhane.
2 Gumushane State Hospital, Medical Microbiology Laboratory, Gumushane, Turkey.
3 Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi, Gastroenteroloji Bilim Dalı, Isparta.
3 Suleyman Demirel University Faculty of Medicine, Department of Gastroenterology, Isparta, Turkey.
ÖZET
Sütün, kefirde bulunan mikroorganizmalar tarafından fermente edilmesi sonucu ortaya çıkan biyoaktif peptidlerin sistemik etkileri son yıllarda ilgi duyulan araştırma konularından biri olmuştur. Biyoaktif peptidlerin makrofaj aktivasyonunu uyararak doğal bağışık yanıtı aktive ettiği; NO üretimi, fagositoz ve sitokin üretimini artırdığı; lümen içi IgG düzeylerini ve bağırsak dokusundaki IgA+ B-hücrelerini artırdığı saptanmıştır. Bu çalışmada, sağlıklı gönüllülerde kefir tüketimi sonrası serum sitokin profillerinin araştırılarak, yardımcı T (TH) hücre polarizasyonunun belirlenmesi ve kefirin doğal bağışıklığa ve allerjik yanıta olan etkilerinin saptanması amaçlanmıştır. Prospektif, öz-kontrollü (self-controlled) olarak planlanan bu çalışmaya, bir üniversite hastanesinde görev yapan 18 sağlıklı gönüllü (yaş aralığı: 20-40 yıl, yaş ortalaması: 35.5 ± 7.38 yıl), etik kurul onayı ve bilgilendirilmiş onam formu alınarak dahil edilmiştir. Beden kitle indeksleri normal sınırlarda (20.10-25.70 kg/m2) olan katılımcılara, tüm fermente ürünlerden yoksun iki haftalık diyet ile beslenmeyi takiben, altı hafta boyunca günde 200 ml kefir verilmiştir. Taze kefir, yağsız sütün Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Lactococcus lactis ssp. lactis ve Streptococcus termophilus bakterilerini içeren kefir mayası (Danisco Biolacta Sp - 05223B 10001, Polonya) ile 26°C'de bir gece inkübasyonu sonucunda elde edilmiş ve hazırlandığı gün tüketilmiştir. Katılımcıların açlık kan örnekleri, kefir kullanımından hemen önce (0. hafta), kefir tüketiminin 3. ve 6. haftaları sonrası (3. hafta ve 6. hafta) ve kefir tüketimi sonlandırıldıktan 3 hafta sonra (9. hafta) toplanmıştır. Serum örneklerinde TNF-α, IL-1, IL-5, IL-8 ve TGF-β düzeyleri, ticari ELISA kitleri (BioSource, Belçika ve Invitrogen, ABD) kullanılarak araştırılmış; ayrıca takip amacıyla tüm örneklerde hemoglobin, serum kreatinin, ALT düzeyleri belirlenmiştir. Tüm katılımcılar çalışmayı sorunsuz tamamlamış ve herhangi bir şikayet bildirmemişlerdir. Olguların hemoglobin, serum kreatinin ve ALT düzeylerinin kefir tüketimiyle değişmediği saptanmıştır. Serum IL-8 düzeyleri, 0. hafta ile karşılaştırıldığında 3. ve 6. haftalarda azalırken (p< 0.001), kefirsiz 3. haftada düşük düzeyini korumuştur (0.-9. hafta farkı; p= 0.005). IL-5 düzeyleri 3. haftada artarken (0.-3. haftalar; p= 0.01), 9. haftada "rebound etki" ile azalmıştır (6.-9. haftalar; p= 0.003). TNF-α düzeyleri ise kefir kullanımıyla artarken (p= 0.046) ikili karşılaştırmalarda sadece 6. haftada istatistiksel olarak sınırda artış göstermiştir (p= 0.013). IL-5 ve TNF-α düzeylerinin, kefir tüketiminin kesilmesiyle orijinal düzeylerine (0. hafta) geri geldiği izlenmiştir. Ölçülen diğer sitokin (IL-1 ve TGF-β) düzeylerinde kefir tüketimi sonrası bir değişiklik saptanmamıştır. Bu bulgular, kefir kullanımının TH1 tipi immün yanıta polarizasyonu artırdığını, TH2 tipi yanıt ve buna bağlı olarak allerjik yanıtı baskıladığını düşündürmüştür. Kefir kullanımının IL-8 düzeyinde düşüşe neden olması, nötrofil kemotaksisi ve aktivasyonunu baskılayarak inflamasyonun kontrol altına alınmasını; IL-5 düzeyinde artışa neden olması ise, salgısal IgA düzeylerini artırarak gastrointestinal sistem lümenindeki immün yanıtın daha etkili çalışmasını sağlayabileceği şeklinde yorumlanmıştır.
Anahtar sözcükler: Kefir; probiyotik; sitokin; interlökin; bağışıklık sistemi.
ABSTRACT
The systemic effects of bioactive peptides which are produced by the fermentation of milk via the microorganisms found in kefir have been the subject of interest in recent years. Bioactive peptides activate innate immunity by stimulating macrophages, increasing phagocytosis, augmenting NO and cytokine production and boosting the lumen levels of IgG and IgA+ B-lymphocytes. The aim of the present study was to determine the serum cytokine profiles of healthy volunteers after kefir consumption to evaluate helper T (TH) cell polarization and to bring out the effects on native and allergic immune responses. The study was designed as a prospective and self-controlled study. A total of 18 healthy volunteers (age range: 20-40 yrs, mean age: 35.5 ± 7.38 yrs) from a university hospital staff were recruited to the study, with the approval of ethical board and informed consent. The body mass indices of all participants were between normal range (20.10-25.70 kg/m2). After two weeks of a diet free from fermented products, the participants consumed 200 mL kefir daily, for six weeks. Kefir product was prepared by using kefir starter culture (Danisco Biolacta Sp - 05223B 10001, Poland) which contains Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Lactococcus lactis ssp. lactis and Streptococcus termophilus, an overnight incubation at 26°C, and consumed freshly. Fasting blood samples of subjects were collected just before kefir use (0th week), at the end of the 3rd and 6th weeks of kefir consumption, and three weeks after cessation of kefir usage (9th week). Serum TNF-α, IL-1, IL-5, IL-8 and TGF-β levels were measured by using commercial ELISA kits (BioSource, Belgium and Invitrogen, USA). Hemoglobin, serum creatinine and ALT levels of all subjects were also determined for follow-up. All volunteers completed the study period without any problem and declared no complaint. Hemoglobin, creatinine and ALT levels did not change with kefir consumption. Serum IL-8 levels were decreased at 3rd and 6th weeks (p< 0.001) and were at low levels at 9th week (p= 0.005) when compared with baseline levels (0th week). Serum IL-5 levels were increased at 3rd week (0th-3rd weeks; p= 0.01) and decreased by a rebound effect at 9th week (6th-9th week p= 0.003). TNF-α levels were increased with kefir consumption (p= 0.046) but the increase was insignificant in paired comparisons and the level was borderline between 0th and 6th weeks (p= 0.013). IL-5 and TNF-α levels returned to their original levels (0th week) at 9th week. Levels of the other cytokines (IL-1 and TGF-β) did not change significantly with kefir usage. These results indicated that kefir use increased polarization of the immune response towards TH1 type and decreased TH2 type response and accordingly allergic response. The decrease in IL-8 level due to kefir use, might control the inflammatory response by suppressing neutrophil chemotaxis and activation. On the other hand it was also concluded that increased IL-5 might stimulate secretory IgA at gastrointestinal mucosa leading to a more efficient immune response in the intestinal lumen.
Key words: Kefir; probiotic; cytokine; interleukin; immune system.
Geliş Tarihi (Received): 22.09.2012 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 07.01.2013
GİRİŞ
Fermente süt proteinleri, laktik asit bakterileri gibi proteolitik mikroorganizmaların hidroliziyle ortaya çıkan biyoaktif peptidlerin en önemli kaynağı olarak kabul edilmektedir1,2. Bu peptidlerin immünomodülatör etkileri son yıllarda aktif olarak çalışılan konulardan birisidir. Biyoaktif peptidlerin makrofaj aktivasyonunu uyararak doğal bağışık yanıtı aktive ettiği (bu süreçte TNF-α, IL-1 ve IL-6 gibi proinflamatuvar sitokinler salınır), NO üretimi, fagositoz ve sitokin üretimini artırdığı gösterilmiştir2,3. Hayvan modellerinde yapılan çalışmalarda da, yoğurt tüketiminin antiinflamatuvar sitokinleri ve apoptozu artırarak tümör büyümesini engellediği saptanmıştır4.
Kefir, ekzopolisakkarid ve proteinlerden oluşan kompleks bir matriks (kefir daneleri) içerisinde bulunan laktik asit bakterilerinin, mayanın ve asetik asit bakterilerinin sütü fermente etmesi sonucu oluşan bir içecektir5. Kefir veya laktik asit bakterilerinin tüketilmesiyle, prostaglandin sentezinin düzenlendiği, lümen içi IgG düzeyi ve bağırsak dokusundaki IgA+ B-hücrelerinde sayısal artış olduğu ifade edilmektedir6. Ayrıca çeşitli çalışmalarda, vajinal laktobasillerin grup B streptokokları in vitro şartlarda inhibe ettiği7; kefir ile beslenen farelerde regülatör T (CD4+ CD25+) hücrelerinin artıp CD19+ B-hücrelerinin azaldığı8; kefirin, pulmoner ve peritoneal kaynaklı makrofajların fagositik aktivitelerini artırdığı ve uzak bölgelerdeki mukozal yanıta etki edebildiği9 gösterilmiştir.
Bu çalışma, kefirin immünomodülatör kapasitesini, insanların kefir kullanımı sonrası serum TNF-α, IL-1, IL-5, IL-8 ve TGF-β düzeyleri üzerindeki in vivo etkilerini saptayarak, bağışıklık sisteminin aktive olup olmadığını ve hangi yöne polarize olduğunu belirlemek amacıyla planlanmıştır. Kefir tüketimiyle yapılan insan çalışmalarının daha az sayıda bulunması ve bildiğimiz kadarıyla daha önce aynı kefir kompozisyonuyla yapılan insan çalışmasının bulunmaması araştırmamızı özgün kılmaktadır.
GEREÇ ve YÖNTEM
Çalışma Grubu
Prospektif, öz-kontrollü (self-controlled) klinik araştırma olarak planlanan bu çalışmaya, bir üniversite hastanesinde görev yapan, 20-40 yaş arası gönüllü kişiler dahil edildi. Çalışma, yerel etik kurul onayı ile gerçekleştirildi ve tüm gönüllü katılımcılardan yazılı onam formu alındı.
Dışlanma kriterleri olarak; sigara ve alkol kullanımı, süte allerji veya intolerans, diyabet, karaciğer ve böbrek hastalığı, hamilelik, çalışmanın başlamasından önceki bir ay içinde veya çalışma sırasında inflamasyon varlığı ve antibiyotik kullanma öyküsü, çalışmanın başlamasından üç ay öncesine kadar girişimsel bir işlem geçirmiş olma öyküsü gibi özellikler dikkate alındı. Bu değerlendirmeler sonucunda 20 gönüllüden 18'i çalışmaya dahil edildi. Çalışmaya alınan gönüllülerin beden kitle indeksleri normal sınırlarda (20.10-25.70 kg/m2) idi. Olguların diğer özellikleri Tablo I'de belirtildi.
Gönüllülere iki hafta fermente ürünlerden yoksun diyet almaları sonrasında toplam altı hafta, hafta içi günlerde 200 ml kefir verildi. Kefir verilmeden hemen önce (0. hafta), kefir başlandıktan sonra 3. ve 6. haftalar ve kefir verilmesi kesildikten üç hafta sonra (9. hafta) kan örnekleri alındı.
Kefir
Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Lactococcus lactis ssp. lactis, Streptococus thermophilus ve kefir mayası içeren ticari kefir kültürü (Danisco Biolacta Sp - 05223B 10001; Polonya), steril yağsız süt (%0.1 yağ) ile karıştırıldı (%3, w/v) ve 26°C'de 16 saat (gece boyu) etüvde bekletilerek kefir elde edildi. Kefir hazır olduğu gün tüketildi.
Serum Sitokin Analizi
Katılımcılardan alınan kan örnekleri santrifüj edilip serumları ayrıldı ve -80°C'de saklandı. Serum örneklerinde TNF-α (BioSource Europe SA, Belçika), IL-1 ve IL-8 (BioSource Immunoassays, Belçika), IL-5 ve TGF-β (Invitrogen Corporation, ABD) düzeyleri, ticari ELISA kitleri kullanılarak üretici firmaların önerilerine göre çalışıldı. Sonuçların kantitatif değerlendirmesinde, kit içeriğinde bulunan kalibratörler kullanıldı. Tüm testler manüel olarak çalışıldıktan sonra otomatize ELISA cihazı (Alisei QS, Radim SpA, İtalya) ile optik dansiteleri belirlendi ve kalibrasyon sonrası kantitasyonları yapıldı. Takip amacıyla tüm örneklerde hemoglobin, serum kreatinin ve ALT düzeyleri otomatize sistem (Aeroset Analyzer, Abbott, ABD) saptandı.
İstatistiksel Analiz
Çalışmada, 0. ve 3. hafta fark "kısa dönem etki", 0.-6. hafta arası fark "uzun dönem etki", 0.-9. haftalar arası fark "kalıcı etki", 3.-6. haftalar arası fark "kısa dönem-uzun dönem etki farkı" ve 6.-9. haftalar arası fark "rebound etki" olarak kabul edildi. Fark analizi, nonparametrik Friedman testiyle yapıldı ve p< 0.05 anlamlı kabul edildi. Friedman testiyle anlamlı bulunan değerler ikili olarak karşılaştırıldı. Bu amaçla Wilcoxon Signed-Rank testi kullanıldı ve Benferoni düzeltmesi yapılarak p< 0.0125 anlamlı kabul edildi. Tüm istatistiksel analizler SPSS v. 20.0 programı kullanılarak yapıldı.
BULGULAR
Çalışmaya dahil edilen 18 kişi, kefir kullanımına tam uyum göstermiş ve herhangi bir şikayetleri olmadığını beyan etmişlerdir. Katılımcıların hemoglobin, serum kreatinin ve ALT testlerinde çalışma boyunca anlamlı bir değişiklik saptanmamıştır (kreatinin değerleri: 0.5-1.0 mg/dl arası p= 0.845; ALT değerleri: 8.0-35.0 U/L arası p= 0.719).
Serum IL-8 düzeyleri kefir kullanımıyla birlikte 3. ve 6. haftalarda düşmüş (p< 0.001) ve kefirsiz 3. haftada düşük düzeyini 0. haftaya göre korumuştur (0.-9. hafta farkı; p= 0.005) (Şekil 1). Serum IL-5 düzeyleri kefir kullanımıyla birlikte 3. haftada yükselmiş (p= 0.01) ve kefirsiz 3. haftada tekrar düşmüştür (6.-9. hafta farkı; p= 0.003) (Tablo II) (Şekil 2). TNF-α düzeyleri kefir kullanımıyla artarken (p= 0.046), ikili karşılaştırmalarda sadece 6. haftada istatistiksel olarak sınırda artış göstermiştir (p= 0.013). IL-8'in kefir tüketimi kesildikten üç hafta sonra bile düşük düzeyini koruduğu için etkisinin daha uzun süreli devam ettiği, IL-5 ve TNF-α etkilerinin ise kefir tüketiminin kesilmesiyle orijinal (0. hafta) düzeylerine geri geldiği saptanmıştır. Çalışılan diğer parametrelerde (IL-1 ve TGF-β) anlamlı bir fark saptanmamıştır (Tablo II).
TARTIŞMA
Günümüzde fermente süt ve süt ürünlerinde bulunan biyoaktif peptidlerin insan sağlığı üzerindeki olumlu etkileri iyi bilinmektedir2,4,6,8,10. Bizim çalışmamızda da, bu ürünlerden birisi olan kefirin immünomodülatör özelliğinin değerlendirilmesi amacıyla, gönüllü sağlıklı bireylerde kefir tüketimi öncesi ve sonrası bazı sitokin (TNF-α, IL-1, IL-5, IL-8, TGF-β) düzeylerinin araştırılması planlanmıştır.
Bilindiği gibi bağışık yanıtın ilk basamağı, mikroorganizma antijenlerinin makrofajlar ve dendritik hücreler gibi yüzeylerinde TLR (Toll-like receptor) bulunduran hücreler tarafından tanınması ve proinflamatuvar sitokin salınımının indüklenmesidir. Bir nötrofil kemotaktik faktör olan IL-8 de, doğal bağışık yanıtın ilk sentezlenen sitokinlerinden olup, nötrofil ve granülositlerin inflamasyon bölgesine göçünü sağlar. IL-8'in sürekli salınımı ve nötrofillerin sahaya sürekli göçü, epitel hücrelerinin hasarına yol açmaktadır11. Kefir içeriğinde bulunan saprofit bakteriler, bağırsaktaki TLR'leri işgal ederek serbest durumda olan TLR miktarını mekanik olarak düşürmektedir. Bu da, hem patojen olan bakterilerin hücreye tutunmasını ve hücre içine girişini zorlaştırmakta, hem de IL-8 düzeylerinin düşmesiyle birlikte doğal bağışık yanıtın abartılı tepki vermesine engel olmaktadır. Literatürde benzer çalışmalarda IL-8 düzeylerinde düşüş saptanmıştır. Wagar ve arkadaşları6, soya sütü ve sütün, Streptococcus thermophilus ST5, Bifidobacterium longum RO 175 ve Lactobacillus helveticus R0052 ile fermente edilmesiyle elde edilen ürünün, insan bağırsak epitel hücre kültürlerinin TNF-α ile uyarımı sonrası IL-8 sentezini azalttığını göstermişlerdir. Bu araştırıcıların6 kullandığı probiyotik bakteriler, bizim kullandığımız bakterilerle örtüşmektedir. Bir başka çalışmada, allerjik nezlesi olan 30 yetişkin gönüllüye, dört hafta boyunca Lactobacillus paracasei ST11 ile fermente edilmiş süt veya plasebo verilmiş; daha sonra periferal kan örneklerinden hazırlanan mononükleer hücre kültürlerinin IL-8 ve IL-10 sentezlerinin plasebo grubuna göre düşük olduğu saptanmıştır12. Malago ve arkadaşlarının11 çalışmasında, Salmonella ile uyarılmış enterosit benzeri Caco-2 hücre kültürlerinde, B.infantis W52, L.casei W56 ve L.lactis W58 probiyotik bakterileriyle uyarımı sonrası IL-8 düzeylerinin düştüğü; bu süpresyonun geçici olduğu ve iki saat sonunda kaybolduğu gözlenmiştir. Ülseratif kolit ve Crohn hastalığı gibi inflamatuvar bağırsak hastalıklarında IL-8 sentezinin sürekli arttığı bilinmektedir13. IL-8 düzeyinin düşürülmesi ile epitel hasarı azalmakta ve bu durum hastaların kliniğini pozitif yönde etkileyebilmektedir14. Yapılan çalışmalarda, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli ve Yersinia enterocolitica gibi enteropatojenlerle enfekte olmuş HT29 (insan kolon adenokarsinom hücre kültürü) ve bağırsak hücrelerinin Lactobacillus ve Bifidobacterium ile ek inkübasyonu sonrası, enteropatojenlerle uyarım sonucu yükselen IL-8 düzeylerinde azalma görüldüğü bildirilmiştir15,16. Bu sonuç, verilen probiyotiklerin enterositleri akut inflamatuvar yanıttan koruduğunu göstermektedir.
Eozinofillerin farklılaşması, gelişmesi ve olgun eozinofillerin aktivasyonundan sorumlu sitokin olan IL-5, aynı zamanda B hücresi büyüme faktörüdür ve salgısal IgA üretimini indüklemektedir. IL-5 salınımının artmasıyla IgA sentezi artmakta, bunun yanı sıra, eozinofil aktivasyonunda da artış görülmektedir. Fare modelinde yapılan bir in vivo çalışmada, soya sütü kefirinin intestinal IgA sentezini artırdığı ve sarkom tümörünün büyümesini yavaşlattığı saptanmıştır17. Jain ve arkadaşları18, Lactobacillus casei içeren hint yoğurdu verilen farelerin bağırsak salgılarında IgA üretiminin arttığını bildirmişlerdir. Bu çalışmaların yanı sıra, insanlarda Lactobacillus GG tüketimi sonrası elde edilen polimorfonükleer hücre kültüründe IL-5 salınımının azaldığı saptanmıştır19.
TNF-α, TH1 tipi immün yanıtın ve doğal bağışıklığın ana mediyatörüdür. Kefirin, TH1 yanıtını artırmak ve TH2 yanıtını baskılamak suretiyle antiallerjik etki gösterdiği bilinmektedir8. Diaz-Ropero ve arkadaşları20, Lactobacillus türlerinin kemik iliği makrofajlarına tek başına verildiğinde TNF-α üretimini ciddi olarak artırdığını, lipopolisakkaridlerle birlikte verildiğinde ise IL-8 indüksiyonunu baskıladığını göstermişlerdir. Tellez ve arkadaşları21, Lactobacillus helveticus içeren süt ile aktive edilmiş fare makrofajlarının, hidrolize süt ya da lipopolisakkarid ile aktive edilmiş makrofajlarla karşılaştırıldığında, daha fazla TNF-α, IL-6 ve IL-1b salgıladıklarını saptamışlardır. Jain ve arkadaşları22, Lactobacillus casei eklenen yoğurdun (Dahi-Hint yoğurdu) TH1 tipi sitokinlerin salınımını artırdığını rapor etmişler; Hong ve arkadaşları8 ise, kefir ile beslenen farelerin splenosit kültürlerinde TNF-α, IFN-γ, IL-1b ve IL-12 düzeylerinin yükseldiğini bildirmişlerdir. Konu ile ilgili yapılan birçok çalışmada da, probiyotik içeren süt, yoğurt gibi ürünlerin kullanımı sonrasında gerek proinflamatuvar sitokinlerin (TNF-α, IFN-γ, IL-1b, IL-2, IL-6) gerekse antiinflamatuvar sitokinlerin (TGF-β, IL-4, IL-10) düzeylerinde artış olduğu gösterilmiştir23,24,25,26,27. Bizim çalışmamızda, TNF-α düzeyleri sınırda artış göstermiş (p= 0.013); TGF-β düzeylerinde saptanan artış ise istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır.
Sonuç olarak, çalışmaya alınan 18 gönüllü katılımcının altı haftalık kefir kullanımı sonrası IL-8 düzeylerinde azalma, IL-5 ve TNF-α düzeylerinde artma saptanmış; IL-8 değerlerinin kefir kesildikten üç hafta sonra bile düşük düzeylerini koruduğu belirlenmiştir. Bu bulgular, kefir kullanımının TH1 tipi immün yanıta polarizasyonu artırdığını, TH2 tipi yanıt ve buna bağlı olarak allerjik yanıtı baskıladığını düşündürmüştür. Kefir kullanımının IL-8 düzeyinde düşüşe neden olması, nötrofil kemotaksisi ve aktivasyonunu baskılayarak inflamasyonun kontrol altına alınmasını; IL-5 düzeyinde artışa neden olması ise, salgısal IgA düzeylerini artırarak gastrointestinal sistem lümenindeki immün yanıtın daha etkili çalışmasını sağlayabileceği şeklinde yorumlanmıştır.
KAYNAKLAR
İletişim (Correspondence):
Doç. Dr. Ali Kudret Adiloğlu,
Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi,
Tıbbi Mikrobiyoloji Bölümü,
Ulucanlar Caddesi, Cebeci, Ankara, Türkiye.
Tel (Phone): +90 312 595 3568,
E-posta (E-mail): aliadiloglu@gmail.com