Clostridium difficile Enfeksiyonu: Epidemiyoloji, Risk Faktörleri, Patogenez, Klinik Özellikler, Tanı ve Tedavi
Clostridium difficile Infection: Epidemiology, Risk Factors, Pathogenesis, Clinical Features, Diagnosis and Therapy
Abdullah KILIÇ
Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.
Gulhane Military Academy of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.
ÖZET
Clostridium difficile gram-pozitif, spor oluşturan anaerobik bir bakteridir. C.difficile antibiyotik ile ilişkili ishal ve kolitlerin en önemli nedenidir. C.difficile enfeksiyonu (CDE) klinik spektrumu, hafif ishalden toksik megakolon, ileus, bağırsak perforasyonu ve psödomembranöz koliti içeren şiddetli intestinal hastalık tablosuna kadar oldukça değişken seyretmektedir. İleri yaş, hastanede kalış süresi ve özgün antibiyotiklere maruz kalma CDE için en yaygın risk faktörleridir. C.difficile'nin temel virülans determinantları toksin A (enterotoksin) ve toksin B (sitotoksin) olup, CDE tanısı dışkı örneklerinde C.difficile toksin A ve/veya toksin B'nin tespit edilmesine dayanmaktadır. C.difficile ve toksinleri tespit etmek için günümüzde çeşitli laboratuvar testleri geliştirilmiştir. Hücre kültürü sitotoksisite ve toksijenik kültür yöntemleri C.difficile toksinlerinin tespitinde referans yöntem olarak kabul edilmektedir. Ancak her iki yöntem de uygulanması güç, zaman alıcı ve uzman personel gerektiren yöntemlerdir. Bu nedenle çoğu mikrobiyoloji laboratuvarında daha pratik ve hızlı olan enzim temelli immünolojik yöntemler, glutamat dehidrojenaz antijen testleri ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılmaktadır. CDE tedavisinde ilk seçilecek antibiyotikler metronidazol ve vankomisindir. Bu derleme yazıda, CDE epidemiyolojisi, klinik özellikleri, risk faktörleri, patojenitesi, tanı testleri ve tedavisi özetlenmiştir.
Anahtar sözcükler: Clostridium difficile; enfeksiyon; epidemiyoloji; patogenez; risk faktörü; tanı; tedavi.
ABSTRACT
Clostridium difficile is a gram-positive, spore-forming anaerobic bacterium. C.difficile is the leading cause of antibiotic associated diarrhea and colitis. The clinical spectrum of C.difficile infection (CDI) is highly variable, ranging from mild diarrhea to severe forms of intestinal illness including toxic megacolon, ileus, bowel perforation, and pseudomembranous colitis. Advanced age, long duration of hospitalization, and exposure to certain antimicrobial agents are the most common risk factors for CDI. The main virulence determinants of C.difficile are toxin A (enterotoxin) and toxin B (cytotoxin). Diagnosis of CDI is based on the identification of C.difficile toxin A or B in diarrheal stool. Various laboratory tests have been currently developed for the detection of C.difficile or its toxins in stool samples. The cell culture cytotoxicity assay and toxigenic culture have been regarded as the reference standard methods for the detection of C.difficile toxins. However, both of the reference methods are laborious, time consuming, and need expert personnel. Therefore, many microbiology laboratories use enzyme immunoassays, glutamate dehydrogenase antigen tests and real-time polymerase chain reaction (PCR) which are more rapid and practical. First-line antibiotics for CDI treatment are metronidazole and vancomycin. In this review, epidemiology, clinical spectrum, risk factors, pathogenesis, diagnostic methods and treatment of CDI have been summarized.
Key words: Clostridium difficile; infection; epidemiology, pathogenesis; risk factors; diagnosis; therapy.
Geliş Tarihi (Received): 24.12.2012 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 26.03.2013
GİRİŞ
Clostridium difficile gram-pozitif, spor oluşturan anaerobik bir basildir. Tüm dünyada önemli bir sağlık sorunu olan antibiyotik ile ilişkili ishal olgularının %15-30'undan sorumlu tutulmaktadır. C.difficile ilk kez 1935 yılında sağlıklı bebeklerin dışkı florasından izole edilmiş ve izolasyonun zor olmasından dolayı Bacillus difficilis olarak isimlendirilmiştir. C.difficile'nin en önemli özelliklerinden biri ısı ve kuruluğa karşı dirençli spor oluşturması ve bu formların hastane ortamında uzun süre canlı kalabilmesidir1. Spor formları hastanelerde kolayca yayılabilmekte ve uzun dönem bakım ünitelerinde salgınlara neden olabilmektedir2. Bu yazıda C.difficile enfeksiyonu (CDE), epidemiyolojisi, risk faktörleri, patojenitesi, kliniği, tanısı ve tedavisi yönünden tartışılmaktadır.
EPİDEMİYOLOJİ
Son yıllarda CDE, Amerika Birleşik Devletleri (ABD), Kanada ve çoğu Avrupa ülkelerinde önemli bir sağlık sorunu haline gelmiştir. Bakteri %2-3 oranında sağlıklı kişilerin, %40-60 oranında da özellikle hastanede doğmuş olan yenidoğanların kolon florasında metabolik inaktif spor formunda bulunabilmektedir. İnsanlar bu bakteriyi veya sporlarını diğer asemptomatik kişilerden veya çevreden alarak enfekte olabilirler3. 2000'li yılların başlarında CDE epidemiyolojisi dramatik olarak değişmiştir. Hastalığın sadece insidansı artmamış, şiddeti de artmıştır. Kanada'da 1991 ile 2003 yılları arasında CDE insidansı her 100.000 kişide 35.6 olgudan 156.3 olguya çıkmıştır. Kasım 2004 ile Nisan 2005 yılları arasında Kanada'da yapılan çalışmada insidansın her 1000 hastada 4.6 olgu olduğu bildirilmiştir4. ABD'de de aynı şekilde artan bir CDE insidans ve hastalık şiddeti bildirilmiştir. Bu oranlar 1996 ile 2003 yılları arasında neredeyse iki katına çıkmıştır. Hem Kanada hem de ABD'de epidemik izolat olarak bilinen ribotip 027 en sık izole edilen ribotip olmuştur. Ribotip 027 diğer izolatlardan 16-23 kat daha fazla toksin A ve B salgılamaktadır ve üçüncü toksin olan binary toksin oluşturmaktadır. Şu ana kadar ABD'nin 40 eyaletinden ve Kanada'dan ribotip 027 nedenli olgular ve salgınlar bildirilmiştir5. Ribotip 027 haricinde ABD'de ribotip 106 ile oluşan CDE ve salgınları artan oranda bildirilmeye başlanmıştır2.
Avrupa'da da CDE artan oranda bildirilmeye başlanmıştır. Avrupa C.difficile Çalışma Grubu tarafından 2005 yılında 14 ülke ve 38 hastanenin katılımı ile, ishal olan ve toksijenik kültür sonucu pozitif olan hastaların dahil edildiği bir çalışma yapılmıştır. CDE insidansının 14 ülke arasında 10.000 hastada 0.13 ile 7.1 olgu arasında değiştiği ve ortalama insidansın her 10.000 hastada 2.45 olgu olduğu bildirilmiştir. Çalışmada 354 toksijenik C.difficile izolatı tanımlanmış, bu izolatların 66 farklı ribotipe sahip olduğu ve %6'sını ribotip 027'nin oluşturduğu ifade edilmiştir. Aynı çalışmada ülkeler arasında da farklı ribotiplerin yaygın olduğu bildirilmiştir. Fransa'da 014, Almanya'da 168 ve 001, İngiltere'de 077, İrlanda'da 017 ve 156, İtalya'da 020, Hollanda'da 027, Polonya'da 017, İspanya'da 001, İsviçre'de 002 en yaygın izole edilen ribotipler olmuştur. Türkiye'de izole edilen sekiz izolat ribotip 001 olarak bildirilmiştir6. 2007 yılında yapılan bir araştırmada, 11 Avrupa Birliği ülkesi ve İsviçre'de 027 ribotipinin en etkili ribotip olduğu ve 027 prevalansının ülkeler arasında %11-100 arasında değiştiği vurgulanmıştır7. Çalışmadan bir yıl sonra C.difficile 027, 16 Avrupa ülkesinde salgınlara, Danimarka, İsveç, Norveç, Macaristan, Polonya, Avusturya ve İspanya gibi ülkelerde ise sporadik olgulara neden olmuştur5. 2008 yılında 34 Avrupa ülkesindeki 106 laboratuvarı kapsayan çalışmada CDE insidansının ortalama her 10.000 hasta gününde 4.1 olgu olduğu bildirilmiştir. Çalışmada 65 farklı ribotip bulunmuş ve en sık olarak ribotip 014/020 (%16), 001 (%9), 078 (%8) ve 027 (%5) izole edilmiştir8. Son dönemlerde ribotip 027 Avusturalya, Kore, Singapur, Hong Kong, Japonya ve Kosta Rika'dan bildirilmiştir9. Diğer bazı ülkelerde de farklı ribotiplerin yaygın olarak bildirildiği görülmüştür. Kore'de yapılan çalışmada ribotip 018 (%26.4)10, İran'da ribotip 078 (%21)11, Hong Kong'da ribotip 002 (%10.1)12, en sık olarak bildirilen ribotipler olmuştur.
Hastane kaynaklı enfeksiyonların yanında toplum kaynaklı C.difficile tüm dünyada izole edilmeye başlanmıştır. ABD'de her yıl 100.000 kişide 6.9 ile 46 arasında değişen toplum kaynaklı C.difficile olgusu saptanmaktadır. Retrospektif bir çalışmada Kuzey Carolina'da toplum kaynaklı C.difficile oranının 2005 yılında %20 olarak tahmin edildiği ve bu oranın Avrupa ve Kanada'da benzer olduğu bildirilmiştir13.
RİSK FAKTÖRLERİ
C.difficile enfeksiyonunun gelişiminde ileri yaş, hastanede yatış ve antibiyotik kullanımı en önemli risk faktörlerini oluşturmaktadır. Özellikle klindamisin, geniş spektrumlu sefalosporin veya florokinolon grubu antibiyotiklerin kullanılması bunların içinde en önemli risk faktörü olarak bilinmektedir14. Kullanılan antibiyotiklere bağlı olarak mikroorganizmaların bir yarış halinde bulunduğu kolon florasının yapısı bozulmakta, diğer anaerobik bakteriler ortamdan uzaklaştırılmakta ve baskın hale geçen C.difficile sporları vejetatif forma geçerek toksin salgılamaktadır15. Aztreonam gibi kolon florasındaki mikroorganizmaları etkilemeyen antibiyotiklerin kullanılması CDE için risk oluşturmamaktadır. Piperasilin-tazobaktam gibi antibiyotikler ise çoğu C.difficile'ye karşı etkili olduklarından daha az sıklıkla antibiyotik ile ilişkili ishale neden olmaktadır2. İleri yaş (≥ 65) da, CDE için önemli risk faktörlerinden biridir. Bunun genel olarak yaşlılıkla birlikte toksinlere karşı oluşan immün sistemde zayıflamaya bağlı geliştiği düşünülmektedir. Hastanede bir hafta yatan hastalarda C.difficile ile kolonize olma oranı %15 iken, üç hafta kalan hastalarda bu oran %45'e çıkmaktadır15. Bu üç risk faktörü haricinde, proton pompa inhibitörü kullanılması, inflamatuvar bağırsak sendromu, immün süpresyon, tüp ile beslenme, kronik karaciğer hastalığı ve son dönem böbrek yetmezliği de CDE gelişimi için risk faktörlerindendir1.
PATOGENEZ
C.difficile enfeksiyonlarında temel virülans faktörleri geniş klostridial sitotoksin ailesinin iki üyesi olan toksin A (enterotoksin) ve toksin B (sitotoksin)‘dir. Her iki toksin de potansiyel sitotoksik aktivite gösterir ve hücre iskeletinin önemli proteinleri olan Ras ve Rho proteinlerini glikozilasyon ile inaktive ederler. Bu proteinlerin glikozilasyonu hücre iskeletinin bozulmasına, hücre içindeki bağların kopmasına ve permeabilite artışı ile birlikte sekretuvar ishal oluşmasına neden olmaktadır. Önceki çalışmalarda toksin A'nın CDE oluşumunda daha önemli olduğu düşünülmekteyken, yapılan deneysel hayvan çalışmalarında toksin A negatif ve toksin B pozitif C.difficile izolatlarının da ciddi bir hastalık tablosu oluşturdukları görülmüştür. Bu çalışmalar, toksin B'nin toksin A gibi enterotoksin etkisi gösterdiğini ve hastalık oluşumunda esas faktör olduğunu düşündürmüştür16. Bu toksinler patojenik lokus olarak isimlendirilen genom bölgesindeki genler tarafından kodlanmaktadır. Bu bölge, toksin A ve B'nin sentez ve düzenlenmesini sağlayan tcdA, tcdB, tcdC, tcdR ve tcdE olmak üzere beş gen içermektedir. Patojenik olmayan C.difficile izolatları patojenik lokus gen bölgesini içermemektedir16. Yapılan çalışmalar TcdR'nin toksin gen ekspresyonunda önemli bir alternatif sigma faktörü olduğunu, TcdC'nin ise negatif bir düzenleyici olduğunu göstermiştir. TcdC, gen ekspresyonu için gerekli olan kor RNA polimeraz ile TcdR arasındaki ilişkiyi engelleyerek etkisini göstermektedir. Bu yüzden TcdC anti-sigma faktör olarak bilinmektedir. TcdE'nin fonksiyonları tam olarak bilinmemekle birlikte hücrelerden toksin salınımında etkili olduğu düşünülmektedir17. Virülans özelliği yüksek izolatlar, toksin A ve B haricinde aktine özgül ADP riboziltransferaz olan binary toksin veya CDT isimli üçüncü bir toksin üretmektedirler. Bu toksin patojenik lokus dışındaki CDT lokus bölgesinde bulunan cdtA ve cdtB genleri tarafından kodlanmaktadır. Hastalık oluşumunda bu toksinin rolü henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Çalışmalar, binary toksinin kolon hücre yüzeylerine klostridial yapışmayı artırmak için hücrelerinin dış yüzeylerinde sitotoksik etki yaptığını göstermiştir. Bu bulgular binary toksinin daha şiddetli hastalık oluşumunda önemli bir kolonizasyon faktörü olduğunu düşündürmüştür16.
KLİNİK ÖZELLİKLER
Antibiyotik ile ilişkili ishal semptomları antibiyotik tedavisi esnasında veya tedavi sonlandıktan sonraki sekiz hafta içinde ortaya çıkabilmektedir14. Hastalık asemptomatik kolonizasyondan, orta derece ishal, fulminant kolit ve hatta ölüme kadar giden klinik tablolar ile kendini gösterebilmektedir18.
Asemptomatik Kolonizasyon
Asemptomatik kolonizasyonda kolon C.difficile ile kolonizedir, ancak ishal gibi klinik bulgular oluşmamaktadır. Yapılan kültürde toksin pozitif C.difficile üremesi olmaktadır. Özellikle hastanelerin yüksek riskli bölümlerinde yatan ve antibiyotik alan hastaların %10-16'sı C.difficile ile kolonize hale gelebilmektedir16.
Clostridium difficile İshali
Sıklıkla karın ağrısı ile birlikte hafif veya orta şiddette ishal ile kendini göstermektedir. Halsizlik ve ateş nadir de olsa görülebilmektedir. Antibiyotik tedavisi esnasında, kısa bir süre sonra veya birkaç hafta sonra oluşabilmektedir. En önemli laboratuvar bulguları lökositoz ve hipoalbüminemidir16.
Clostridium difficile Koliti
En sık görülen CDE tablosudur. Psödomembranöz olmasa da klinik ciddi seyredebilmektedir. Hastalarda hafif ve orta şiddette karın ağrısı, bulantı, kusma, iştahsızlık ve sulu ishal vardır. Sigmoidoskopide özgül olmayan yaygın veya yama tarzında psödomembransız eritematöz kolit tablosu görülebilmektedir16.
Psödomembranöz Kolit
C.difficile kolitinin klasik tipi olarak bilinmektedir. C.difficile kolitinden daha ağır seyreder; hastalarda şiddetli ishal ile birlikte sağ veya sol alt kadranda yoğun bir rahatsızlık hissi vardır. Hastaların endoskopik muayenelerinde genellikle kalın bağırsak proksimalinde 2-10 mm çapında, sarı renkli plak artışı şeklinde ve kolorektal mukoza boyunca psödomembran dağılımları görülebilmektedir. Laboratuvar bulgusu olarak beyaz kan hücresi sayısı 20.000/µl üzerinde albümin seviyesi ise 3.0 g/dl veya daha az olarak izlenmektedir19.
Fulminant C.difficile Enfeksiyonu
Bu tablo ileus, megakolon, kolon perforasyonu ve ölüm gibi ciddi komplikasyonla seyredebilmekte ve CDE'li hastaların %2-3'ünde görülebilmektedir1. Hastalar birkaç saat gibi kısa zaman içinde veya haftalar içinde fulminant CDE tablosuna girebilir. Burada hastanın yaşı, immün durumu, altta yatan başka hastalıkları ve bakterinin toksin durumu etkili olmaktadır. Hastalarda ishal, alt kadran veya yaygın karın ağrısı ile birlikte şişkinlik vardır. Bazı hastalarda yüksek ateş, üşüme ve titreme belirtileri olabilmektedir. Zayıf prognozlu hastalarda peritonit belirtisi olabilecek şiddetli karın ağrısı veya 50.000/µl üzerinde beyaz kan hücre seviyesi veya 5 mmol/l üzerinde laktat seviyesi vardır. Hastalığın kontrol altına alınmasında erken tanı ve tedavi büyük önem taşımaktadır16.
Rekürent CDE
Vankomisin veya metronidazol ile tedavi edilen hastalarda birkaç hafta içinde tekrar ishal ve diğer semptomların ortaya çıkması tablosu rekürent CDE olarak adlandırılır. CDE'li hastaların %20'sinde rekürent görülmektedir. Birinci rekürentten sonra olguların %40'ında ikinci rekürent, ikinci rekürent oluşan hastaların %60'ında üçüncü rekürent görülebilmektedir. Rekürent olguları orijinal izolat veya farklı izolat ile oluşabilmektedir. Antibiyotik kullanmaya devam etme, antiasit kullanılması ve ileri yaş rekürent CDE gelişiminde risk faktörü olarak bilinmektedir1.
C.difficile enfeksiyonlarında kolon dışı kan akımı enfeksiyonu, yara ve eklem enfeksiyonu gibi klinik bulgular oluşabilmektedir. Ayrıca irritabl bağırsak hastalığı ve reaktif artrit gibi reaktif veya postenfeksiyöz sendromlar ortaya çıkabilir16.
TANISAL TESTLER
Doğru, güvenilir ve hızlı tanı özellikle hastane kaynaklı CDE'lerin kontrol altına alınması ve hasta takibi açısından önemlidir. CDE tanısı, klinik özellikler ve laboratuvar testleri temelinde olmaktadır. Sadece toksin A ve/veya toksin B üreten izolatların hastalık yapma yeteneğinin olmasından dolayı dışkı örneklerinden toksinlerin tespit edilmesi tanıda önemli bir kriterdir. Hastanede antibiyotik ile ilişkili ishal gelişen hastaların yaklaşık %30'unda neden CDE olduğu için eğer uygun tanı testleri varsa, tanı testi yapmadan ampirik tedavi uygulanması uygun değildir20. Hastalarda 36 saatte en az altı sulu ishal, 48 saat içinde sekizin üzerinde şekilsiz ishal veya iki gün için günde üç şekilsiz ishal olması klinisyenlere CDE varlığını düşündürmelidir21. Hücre kültürü sitotoksisite yöntemi ve toksijenik kültür CDE tanısında referans yöntemler olarak bilinmektedir. Ancak her iki yöntem de uzun zaman almakta, uzman teknik personel ve özel laboratuvar ortamı gerektirmektedir. Bu yüzden de çoğu laboratuvar, duyarlılığı düşük olmasına rağmen bunların yerine glutamat dehidrojenaz (GDH) ve toksinleri tespit eden enzim temelli immünolojik yöntemleri tercih etmektedir. Son dönemlerde ise direkt olarak klinik örnekten etkeni tanımlayan gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemleri geliştirilmiştir22.
Örneklerin Toplanması ve Taşınması
Dışkı örnekleri alınır alınmaz laboratuvara steril kuru kapta ve herhangi bir transport sıvısı eklenmeden gönderilmelidir. Rektal sürüntü örnekleri toksin testi için tavsiye edilmemesine rağmen, ishalsiz ileuslu hastalarda örnek olarak kullanılabilmektedir. Semptomların başlangıcında alınan bir veya iki örnek genellikle tanı için yeterlidir. Eğer birinci örnek negatif ise ilave ishal örneği ile testin tekrarlanması faydalı olabilir. Üç farklı dışkı örneğinin test edilmesi pozitiflik olasılığını %10 civarında artırmasına rağmen maliyeti yükselttiğinden dolayı tavsiye edilmemektedir20,21.
Enzim Temelli İmmünolojik Yöntemler (EIA)
İlk kez 1984 yılında C.difficile toksin A veya toksin A ve B'yi tespit etmek için kullanılmıştır23. Referans yöntem ile karşılaştırıldıklarında hızlı, teknik olarak kolay ve düşük maliyetli oldukları için ABD'deki laboratuvarların %90'dan fazlasında kullanılmaktadırlar20. EIA ile yapılan çalışmalarda, referans yöntem ile karşılaştırıldığında duyarlılığın düşük, özgüllüğün ise duyarlılıktan daha yüksek olduğu görülmüştür. Eastwood ve arkadaşları24 600 dışkı örneği ile yaptıkları çalışmada, testlerin duyarlılıklarını %60-81, özgüllüklerini ise %91-99.4 arasında bildirmişlerdir. Crobach ve arkadaşları22, 13 farklı ticari EIA ile toksin A ve/veya toksin B tespit eden 34 çalışmayı değerlendirmişler; testlerin duyarlılıklarının %31-99, özgüllüklerinin ise %65-100 arasında olduğunu belirlemişlerdir. Turgeon ve arkadaşları25, altı ticari EIA testini referans yöntem ile karşılaştırmışlar ve duyarlılığın %55-89, özgüllüğün ise %89-99 arasında olduğunu bildirmişlerdir.
C.difficile toksinleri dışında, hem toksin oluşturan hem de oluşturmayan C.difficile suşlarının ürettiği metabolik enzim olan GDH'yı tespit eden EIA testleri de vardır26. Çoğu laboratuvar ilk basamağında GDH testi olan iki basamaklı algoritmayı kullanmaktadır. Bu algoritmada ilk önce GDH testi yapılmakta, eğer negatif ise ileri test yapılmamaktadır. Eğer pozitif ise takibinde toksin testi yapılması gerekmektedir. GDH testi pozitif, toksin testi negatif ise, ya hasta toksijenik olmayan bir C.difficile taşımakta veya toksin testinin yalancı negatif sonuç verdiği düşünülmektedir. Her iki test de pozitif ve hasta da semptomatik ise CDE tanısı konulmaktadır27. Şu an piyasada hem GDH, hem de toksini tespit eden ve 30 dakikada sonuç veren C. Diff Quick Chek Complete (Techlab, ABD) kiti mevcuttur. Vasoo ve arkadaşları28 192 dışkı örneği ile yaptıkları çalışmada, C. Diff Quick Chek Complete testinin GDH komponentinin duyarlılık ve özgüllüğünü sırasıyla %95.8 ve %89.6, toksin komponentinin duyarlılık ve özgüllüğünü ise sırasıyla %79.2 ve %100 olarak bulmuşlardır. Bir başka çalışmada, 200 dışkı örneği C. Diff Quick Chek Complete testi ile araştırılmış ve her iki testin beraber olarak duyarlılığının %70.8 ve özgüllüğünün %97.4 olduğu bildirilmiştir29.
Kültür
Kültür CDE tanısında kullanılan önemli yöntemlerden biridir ve salgın araştırmaları ve hastane izolatlarının epidemiyolojik amaçlı incelenmesinde esastır. Laboratuvarlarda genellikle C.difficile kültürü için sikloserin, sefoksitin ve fruktoz içeren selektif agar (CCFA) kullanılmaktadır. Bu besiyerine sporların üremelerini artırmak için taurakolat ve lizozim ilave edilebilmektedir. Kullanmadan önce agar plaklarını anaerobik ortamda tutmak bakterinin üremesini artırmaktadır. C.difficile, agar yüzeyinde düz yüzeyli, sarı, buzlu cam görümünde ve etrafında sarı hale olan koloniler oluşturur. Kolonilerin tipik para-kresol (at ahırı kokusuna benzer) kokusu vardır ve Wood ışığında floresan vermektedirler. Gram boyamada koloniler tipik olarak gram-pozitif veya değişken basil olarak görülmektedir. CCFA haricinde sikloserin mannitol kanlı agar (CMBA) ve çeşitli kan ürünlerinin ilavesi ile hazırlanmış sikloserin, sefoksitin agarlar da C.difficile izolasyonunda kullanılmaktadır21. Anaerop kültür yapma imkanı olan laboratuvarlarda C.difficile izolasyonu selektif besiyerleri kullanılarak yapılmakla birlikte, uzun zaman alması ve işlemin pahalı olmasından dolayı çoğu laboratuvar tarafından tercih edilmemektedir. Ayrıca, rutin kültür ile üreyen C.difficile izolatlarının toksijenik olup olmadıklarının ayrımı yapılamamaktadır. Bu nedenle özgüllüğü %90'ın üzerinde olmasına rağmen çoğu laboratuvar rutinde kültürü tercih etmemektedir14. Organizma izole edildikten sonra toksin üretip üretmediğinin hücre kültürü sitotoksisite yöntemi veya PCR ile tespit edilmesi işlemine toksijenik kültür yöntemi adı verilmektedir30.
Hücre Kültürü Sitotoksisite Yöntemi
Uzun dönemdir hücre kültürü sitotoksiste yöntemi klinik örneklerde toksin (toksin B) varlığını direkt olarak gösterdiği için referans yöntem olarak kabul edilmektedir. Bu yöntemle toksin B'nin 1.0 pg miktarı tespit edilebilir. Toksin varlığının C.difficile veya çapraz reaksiyon veren Clostridium sordellii antitoksini ile doğrulanması gerekmektedir. Sitotoksin tespitinde Vero, Hep 2, HeLa ve MRC-5 akciğer fibroblast hücre kültürleri kullanılmaktadır19. Özgüllüğü > %97, duyarlılığı %75-85 arasında olmasına rağmen, pahalı, zaman alıcı olması ve iyi gelişmiş laboratuvar gerektirdiğinden rutin laboratuvarlar tarafından tercih edilmemektedir14.
Nükleik Asit Amplifikasyon Yöntemleri
Nükleik asit amplifikasyon (NAA) yöntemleri C.difficile tanısında son dönemlerde sık olarak kullanılmaya başlanmıştır. Günümüzde PCR ve loop-mediated izotermal amplifikasyon (LAMP) temelli yöntemler kullanılmaktadır. ABD Gıda ve İlaç Yönetimi (FDA); BD-GeneOhm Cdiff (BD, Franklin Lakes, New Jersey), Prodesse ProGastro Cd (Gen-Probe, Inc. San Diego, CA), Cepheid GeneXpert C.difficile (Cepheid, Sunnyvale, CA) ve Illumigene C.difficile (Meridian Diagnostics, Inc., Ohio) yöntemleri için onay vermiştir. Bu yöntemlerden ilk üçü gerçek zamanlı PCR temelli ve toksin B'yi tespit ederken, dördüncü test LAMP temellidir ve toksin A'yı tespit etmektedir27. BD-GeneOhm Cdiff yönteminde manuel DNA ekstraksiyonu sonunda Cepheid SmartCycler cihazı ile amplifikasyon işlemi yapılmakta ve iki saat sonunda sonuç alınmaktadır. ABD'deki laboratuvarlarda en çok çalışılan moleküler testtir. Duyarlılığı %84-96, özgüllüğü ise %94-99 arasında değişmektedir16. Progastro CD yönteminde, DNA izolasyonu bioMerieux NucliSENS easyMAG otomatik sistemi ile, amplifikasyon işlemi ise Cepheid SmartCycler II cihazında yapılmakta; sonuçlar yaklaşık 4 saatte alınmaktadır. Çalışmalarda duyarlılığı %77.3-95.7, özgüllüğü ise %99-100 olarak bildirilmiştir31,32. Cepheid GeneExpert yöntemi GeneExpert cihazında gerçekleştirilmektedir. Eküvyon ile alınan dışkı örneği önce tampon içeren şişeye konulur, vortekslenir ve buradan alınarak kartuştaki örnek bölümüne aktarılır. DNA ekstraksiyonu, PCR ve tespit işlemlerinin hepsi kartuş içinde gerçekleşir; sonuçlar yaklaşık 29 dakika sonra elde edilir. Yapılan çalışmalar, bu yöntemin duyarlılığını %94-100, özgüllüğünü %93-99 olarak vermektedir30. FDA tarafından onaylanmış diğer yöntem LAMP temelli Illumigene yöntemi olup, diğerlerinden farklı olarak toksin A'yı tespit etmekte ve DNA'yı çoğaltmak için gerçek zamanlı PCR teknolojisi kullanmamaktadır. PCR ile karşılaştırıldığında, basit, hızlı, özgül ve ucuz bir yöntemdir. LAMP teknolojisinde uygun primerlerin kullanımı ile DNA amplifikasyonu belirli bir ısı altında (60-65°C), termal döngü cihazı gerektirmeden olmaktadır. Ortamda bulunan polimeraz enzimi ile çift zincir DNA'lar pirofosfat iyonları oluşturmakta, oluşan piropfosfat iyonları ortama ilave edilen manganez ile reaksiyona girerek, floresan metal indikatörü olan kalsein yardımıyla görünür hale gelmektedir. 30-60 dakikada oluşan renk değişikliği basit bir türbidimetre ile veya çıplak gözle tespit edilebilmektedir. Illumigene yönteminin duyarlılığı %93.3-95.2, özgüllüğü ise %96.6-99.7 arasında değişmektedir33,34.
C.difficile enfeksiyonlarının laboratuvar tanısı, hem hasta hem de bakterinin hastane içi yayılımının önlenmesi açısından önemlidir. Standartlar, sulu veya yarı katı dışkı örneklerinin önce GDH testi yapılması sonra da doğrulamak için toksijenik kültür veya hücre kültürü sitotoksisite yöntemi yapılmasını önermektedir. Amerika Mikrobiyoloji Cemiyeti ise tek başına NAA yöntemlerinin kullanılmasını desteklemektedir35.
TEDAVİ
Tedavide en önemli yaklaşım hastalığa neden olduğu düşünülen antibiyotiğin kesilmesidir. Orta şiddetteki CDE'nin %25'inde 48 saat içinde semptomlarda azalma görülmektedir. Hastalara sıvı ve elektrolit takviyesi yapılmalıdır. Eğer antibiyotiğe devam edilmesi zorunlu ise klindamisin, sefalosporinler veya geniş spektrumlu penisilin dışı antibiyotiklerin tercih edilmesi önerilmektedir. Antiperistaltik ajanlardan kaçınılması gerekmektedir. Hafif ve orta şiddetteki olgularda başlangıç tedavisi olarak 500 mg oral metronidazolün günde üç kez, 10-14 gün kullanılması önerilmektedir. Metronidazol intoleransı veya allerjisi olan hastalar, hamile veya emziren kadınlar ile şiddetli enfeksiyonu olan hastalar, 125 mg oral vankomisini günde dört kez, 10-14 gün kullanmalıdır. Eğer olgunun durumu ciddi ve komplike ise, 500 mg oral vankomisin günde dört kez veya nazogastrik tüp artı 500 mg IV metronidazol her sekiz saatte bir verilmelidir36,37. Fidaksomisin, C.difficile'ye etkili yeni bir geniş spektrumlu makrolid antibiyotiktir. FDA, Mayıs 2011 tarihinde fidaksomisinin C.difficile nedenli ishallerin tedavisinde kullanımına onay vermiştir. Tedavi maliyeti yüksek olmasına rağmen, yüksek riskli gruptaki hastalarda rekürent CDE oranını düşürdüğü için önemli bir antibiyotiktir. Doz olarak günde iki kez 200 mg oral olarak 10 gün önerilmektedir37. CDE tedavisinde antibiyotiklere alternatif olarak probiyotikler, intestinal mikrobiyal flora transferi ve immünoterapi gibi tedavi yöntemleri de kullanılmaktadır. Probiyotiklerin kullanılmasının özellikle kolon florasının dengesini sağlayarak CDE önlenmesinde ve tedavisinde etkili olduğu bildirilmiştir. Fekal transplantasyon da, alternatif tedavi yaklaşımı olarak yine kolon florasını tamir etmek amacıyla sağlıklı vericilerden alınarak uygulanmaktadır. C.difficile kolonizasyonunda immün yanıt önemli olduğundan intravenöz immünoglobulinler tedavi amaçlı olarak hastalara uygulanabilmektedir38.
SONUÇ
C.difficile enfeksiyonlarının son zamanlarda tüm dünyada hem sıklığı hem de şiddeti artmıştır. Hastalığın risk faktörleri iyi bilinmekte olup, klinisyenlerin bu risk faktörlerine göre hastaları değerlendirmeleri önerilmektedir. Tanıda hızlı ve güvenilir testler mevcut olmasına rağmen optimal özgüllük sorunları yaşanabilmektedir. İlk seçilen ajan olan metronidazole karşı tedavi başarısızlığının artmasından dolayı yeni geliştirilen ilaçlar ile tedaviye yönelik çalışmalar yapılması gerekmektedir.
KAYNAKLAR
İletişim (Correspondence):
Doç. Dr. Abdullah Kılıç,
Gülhane Askeri Tıp Akademisi,
Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,
Etlik, Ankara, Türkiye.
Tel (Phone): +90 312 304 3412,
E-posta (E-mail): abkilic@gata.edu.tr