Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2016; 50(1): 021-033

T�rkiye'de 2014 Yılı İ�inde İzole Edilen Karbapeneme Diren�li Escherichia coli ve
Klebsiella pneumoniae İzolatlarında Karbapenemaz Varlığının Araştırılması*

Investigation of Carbapenemases in Carbapenem-Resistant Escherichia coli and
Klebsiella pneumoniae Strains Isolated in 2014 in Turkey

Aslı �AKAR1, Yakut AKY�N1, Deniz G�R1, Onur KARATUNA2, Dilara �Ğ�N�3, Betil �ZHAK BAYSAN3, Nilay ��PL�4,
Mustafa �AĞATAY4, Abdullah KILI�5, Mehmet BAYSALLAR5, Zahir BAKICI6, Cem �ELİK6, Zeynep G�LAY7,
Ş�hret AYDEMİR8, Alper T�NGER8, H�seyin KILI�9, Barış Derya ER�AL9, Zulal AŞ�I TORAMAN10, Yasemin ZER11,
Ayşe B�Y�KTAŞ11, Selma AY12, Zerrin AKTAŞ13, �iğdem KAYACAN13, G�l�in BAYRAMOĞLU14, Faruk AYDIN14,
Devrim D�NDAR15, Ufuk HASDEMİR16, Ramazan AYAŞ16, Keramettin YANIK17, Murat G�NAYDIN17,
H�seyin G�D�C�OĞLU18, Mehmet PARLAK18

1 Hacettepe �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

1 Hacettepe University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

2 Acıbadem �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul.

2 Acıbadem University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Istanbul, Turkey.

3 Akdeniz �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Antalya.

3 Akdeniz University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Antalya, Turkey.

4 Ankara Dışkapı Yıldırım Beyazıt Eğitim Araştırma Hastanesi, Mikrobiyoloji Laboratuvarı, Ankara.

4 Ankara Diskapi Yildirim Beyazit Training and Research Hospital, Microbiology Laboratory, Ankara, Turkey.

5 G�lhane Askeri Tıp Akademisi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

5 Gulhane Military Medical Academy, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

6 Cumhuriyet �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Sivas.

6 Cumhuriyet University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Sivas, Turkey..

7 Dokuz Eyl�l �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir.

7 Dokuz Eylul University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Izmir, Turkey.

8 Ege �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir.

8 Ege University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Izmir, Turkey.

9 Erciyes �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Kayseri.

9 Erciyes University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Kayseri, Turkey.

10 Fırat �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Elazığ.

10 Firat University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Elazig, Turkey.

11 Gaziantep �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Gaziantep.

11 Gaziantep University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Gaziantep, Turkey.

12 İn�n� �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Malatya.

12 Inon� University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Malatya, Turkey.

13 İstanbul �niversitesi İstanbul Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul.

13 Istanbul University Istanbul Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Istanbul, Turkey.

14 Karadeniz Teknik �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Trabzon.

14 Karadeniz Technical University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Trabzon, Turkey.

15 Kocaeli �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Kocaeli.

15 Kocaeli University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Kocaeli, Turkey.

16 Marmara �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul.

16 Marmara University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology,Istanbul, Turkey.

17 Ondokuz Mayıs �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Samsun.

17 Ondokuz Mayis University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Samsun, Turkey.

18 Y�z�nc� Yıl �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Van.

18 Y�z�nc� Yil University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Van, Turkey.

* Bu �alışma, XXXVI. T�rk Mikrobiyoloji Kongresi (12-16 Kasım 2014, Antalya)'nde poster olarak sunulmuştur.

�Z

T�m d�nyada Enterobacteriaceae ailesi �yeleri arasında �oklu ila� direncine sahip izolatlar artış g�stermekte ve tedavide son se�enek olarak kabul edilen karbapenemlere karşı bu izolatlarda bulunabilen karbapenemazlar tedavide başarısızlıklara yol a�abilmektedir. Bu enzimlerin �lkemizdeki sıklıklarına ilişkin �ok merkezli �alışmalar bulunmamaktadır. Bu �alışmanın amacı, European Survey on Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae (EuSCAPE) projesi kapsamında, T�rkiye'nin değişik b�lgelerindeki merkezlerden izole edilen Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae izolatlarında karbapenemaz varlığını ve enzim tiplerini belirlemektir. T�rkiye'de belirlenmiş 18 merkezden Kasım 2013 tarihinden itibaren ilk altı aylık s�re i�inde karbapenem grubu antibiyotiklerden (imipenem, meropenem veya ertapenem) en az birine diren�li olarak saptanan ilk 10 klinik izolat koordinat�r merkeze g�nderilmiştir. İzolatlarda imipenem, meropenem ve ertapenem antibiyotik duyarlılıkları mikrodil�syon y�ntemi ile EUCAST standartlarına g�re araştırılmış ve karbapenemaz varlığı fenotipik olarak kombinasyon sinerji testi ile doğrulanmıştır. Karbapenemaz tipleri, VIM, IMP, NDM, KPC ve OXA-48 karbapenemaz genlerine �zg�l primerler kullanılarak multipleks-polimeraz zincir reaksiyonu y�ntemi ile araştırılmıştır. Altı aylık s�re i�inde, koordinat�r merkeze, karbapenemaz varlığı ş�pheli 155 klinik izolat [21'i (%13.5) E.coli, 134'� (%86.5) K.pneumoniae] g�nderilmiştir. E.coli izolatlarının 19'unda (%90.5) ve K.pneumoniae izolatlarının 124'�nde (%92.5) olmak �zere toplam 155 izolatın 143'�nde (%92.3) genotipik olarak en az bir karbapenemaz geni saptanmıştır. Bu enzimler 136 izolatta tek başına (OXA-48: %84.6; NDM: %6.3; VIM: %2.8; IMP: %1.4) bulunurken, yedi izolatta iki enzim bir arada (OXA-48 + NDM: %2.1; OXA-48 + VIM: %2.1; VIM + NDM: %0.7) olarak tespit edilmiştir. İzolatların hi� birinde KPC enzimi g�zlenmemiştir. Mikrodil�syon testi sonu�larına g�re OXA-48 pozitif izolatların imipenem, meropenem ve ertapeneme diren� y�zdeleri sırasıyla %59.5, %52.9 ve %100 olarak belirlenmiştir. Karbapenemaz varlığının doğrulanması i�in yapılan kombinasyon sinerji testinin molek�ler test ile %100 uyumlu olduğu saptanmıştır. OXA-48 enzimi i�eren izolatların bir�oğunun meropeneme duyarlı ancak tamamının ertapeneme diren�li olması nedeniyle, karbapenemaz taramasında ertapenemin en uygun antibiyotik olduğu, ekipman ve maliyet gerektiren molek�ler y�ntemlerin uygulanamadığı merkezlerde sinerji tekniğine dayalı bu fenotipik y�ntemin g�venle kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.

Anahtar s�zc�kler: Karbapenemaz; Enterobacteriaceae; OXA-48; metallo-beta-laktamaz; T�rkiye.

ABSTRACT

Carbapenems are the choice of treatment in infections caused by multidrug resistant Enterobacteriaceae. In recent years carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates due to carbapenemases have been increasingly reported worldwide. Multicenter studies on carbapenemases are scarce in Turkey. The aim of this study was to determine the distribution of carbapenemases from different parts of Turkey as a part of the European Survey of Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae (EuSCAPE) project. Beginning in November 2013, carbapenem-resistant isolates resistant to at least one of the agents, namely imipenem, meropenem, and ertapenem were sent to the coordinating center. Minimum inhibitory concentrations for these carbapenems were determined by microdilution tests following EUCAST guidelines. Production� of carbapenemase was confirmed by combination disk synergy tests. Types of carbapenemases were investigated using specific primers for VIM, IMP; NDM, KPC and OXA-48 genes by multiplex polymerase chain reaction. In a six month period, 155 suspected carbapenemase-positive isolates were sent to the coordinating center of which 21 (13.5%) were E.coli and 134 (86.5%) were K.pneumoniae. Nineteen (90.5%) strains among E.coli and 124 (92.5%) strains among K.pneumoniae were shown to harbour at least one carbapenemase gene by molecular tests, with a total of 92.3% (143/155). Carbapenemases were determined as a single enzyme in 136 strains (OXA-48: 84.6%; NDM: 6.3%; VIM: 2.8%; IMP: 1.4%) and as a combination in seven isolates (OXA-48 + NDM: 2.1%; OXA-48 + VIM: 2.1%; VIM + NDM: 0.7%). KPC was not detected in any of the isolates. According to the microdilution test results, resistance to imipenem, meropenem and ertapenem in OXA-48 isolates were 59.5%, 52.9% and 100%, respectively. The combination disk synergy test was 100% compatible with the molecular test results. As most of the OXA-48 producing isolates were susceptible to meropenem but all were resistant to ertapenem, ertapenem seems to be the most sensitive agent in screening carbapenemases in areas where OXA-48 is prevalent and phenotypic combination tests can be useful� in centers where molecular tests are not available.

Keywords: Carbapenemase; Enterobacteriaceae; OXA-48; metallo-beta-lactamase; Turkey.

Geliş Tarihi (Received): 11.06.2015 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 19.12.2015

GİRİŞ

Enterobacteriaceae ailesi i�inde �oklu ila� direncine sahip izolatlar t�m d�nyada olduğu gibi �lkemizde de hızla artmaktadır. Bu izolatlar, karbapenemler gibi ciddi enfeksiyonların tedavisinde son se�enek olan antibiyotiklere de diren�li olabilmekte ve bu diren� gelişimi klinik tedavi se�eneklerini kısıtlayarak tedavide başarısızlıklara yol a�abilmektedir. Enterik bakterilerde karbapenem direncine neden olan iki temel mekanizma bulunmaktadır. Bunlardan ilki, karbapenemleri hidrolize eden karbapenemaz enzimlerinin varlığıdır. Bu enzimler i�erisinde en sık, sınıf A karbapenemazlar (KPC tipleri), sınıf B'de yer alan metallo-beta-laktamaz (MBL)'lar (VIM, NDM ve IMP) ve sınıf D oksasilinazlar (OXA-48 benzeri) karbepenem direncine neden olabilmektedir. Enterobacteriaceae ailesinde karbapenemlere azalmış duyarlılığın diğer bir nedeni de, porin kaybı ile beraber izolatta bulunabilen geniş spektrumlu beta-laktamazlar (GSBL) ve/veya AmpC enzimlerinin varlığıdır1. Karbapenemaz i�eren izolatlar t�m beta-laktam antibiyotiklere diren�li hale gelmelerinin yanı sıra, bu izolatlarda florokinolon, aminoglikozid ve ko-trimoksazole karşı da genellikle diren� g�zlenmektedir. �lkemizin de i�inde bulunduğu bir�ok Avrupa �lkesinde OXA-48 i�eren izolatlar salgınlara yol a�makta ve prevalansı hızla artış g�stermektedir2,3.

Kazanılmış karbapenemaz i�eren bakterilerin yayılımı, �nemli bir halk sağlığı sorunu oluşturmaktadır. Bu nedenle, bu izolatların saptanması, enfeksiyon kontrol�nde olduk�a �nemlidir ve rutin bakteriyoloji laboratuvarlarında kullanılmak �zere g�venilir tanı testlerine ihtiya� duyulmaktadır4. Enterobacteriaceae �yeleri arasında diren� varlığının taranması ve doğrulanmasına y�nelik farklı fenotipik ve genotipik y�ntemler geliştirilmiştir. Avrupa'da, merkezi Hollanda'da bulunan "European Survey on Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae (EuSCAPE)" adlı kuruluş, t�m Avrupa �lkelerinde karbapenemaz i�eren enterik bakterilerin sıklığını ve yayılımını araştıran bir merkezdir. Bu �alışmanın amacı, EuSCAPE projesi kapsamında T�rkiye'de belirlenen 18 merkezden izole edilen ve karbapenemaz ş�phesi bulunan E.coli ve K.pneumoniae izolatlarında karbapenemaz varlığını ve enzim tiplerini belirlemektir.

GERE� ve Y�NTEM

Bakteri İzolatlarının Toplanması

Belirlenen 18 merkezden, Kasım 2013-Mayıs 2014 tarihleri arasında, klinik �rneklerden izole edilen ve gerek otomatize sistemler ile gerekse manuel antibiyotik duyarlılık testlerine g�re en az bir karbapenem grubu antibiyotiğe diren�li olan ya da azalmış duyarlılığı bulunan ilk 10 K.pneumoniae ve/veya E.coli klinik izolatı merkezimize g�nderildi. Bakteri izolatları �alışılıncaya kadar stoklanarak -20�C'de saklandı.

Fenotipik Testler ile Karbapenemaz Tayininin Yapılması

Karbapenemaz varlığını fenotipik olarak test etmek �zere KPC, MBL ve OXA-48 doğrulama kiti (Rosco Diagnostica, Danimarka) kullanıldı. Kontrol suşu olarak EuSCAPE tarafından g�nderilen OXA-48, KPC, NDM, VIM ve IMP pozitif K.pneumoniae izolatları kullanıldı. Bakteri izolatlarının taze k�lt�rlerinden hazırlanan bakteri s�spansiyonu McFarland 0.5'e ayarlanarak Mueller-Hinton agara yayıldı. Kit i�erisinde bulunan meropenem, meropenem + kloksasilin, meropenem + dipikolinik asit, meropenem + boronik asit ve temosilin diskleri ekili plaklara yerleştirildi. Plaklar bir gece 35�C'de ink�be edildi. İnk�basyon sonrası her disk i�in inhibisyon zon �apları �l��lerek meropenem inhibisyon zon �apı ile karşılaştırıldı. KPC, MBL ve OXA-48 doğrulama kiti değerlendirme kriterleri Tablo I'de g�sterildi.


Tablo I

Mikrodil�syon Y�ntemiyle İmipenem, Meropenem ve Ertapenem Minimum İnhibit�r Konsantrasyonlarının (Mik) Saptanması

Karbapenemaz ş�pheli izolatlarda imipenem, meropenem ve ertapenem MİK değerleri mikrodil�syon y�ntemiyle saptandı. Antibiyotik konsantrasyonları 128-0.06 �g/ml olacak şekilde ayarlandı. Kontrol suşu olarak E.coli ATCC 25922 kullanıldı. Sonu�lar EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) kriterlerine g�re değerlendirildi5. Meropenem ve imipenem MİK değerleri ≥ 2 �g/ml ve ertapenem MİK değeri ≥ 0.5 �g/ml diren�li olarak değerlendirildi. Karbapenemaz varlığı i�in tarama kriteri olarak EUCAST'ın �nerisi doğrultusunda MİK değeri meropenem ve ertapenem i�in > 0.12 �g/ml ve imipenem MİK değeri > 0.5 �g/ml olarak alındı.

Karbapenemazların molek�ler y�ntemle tayini

Merkezlerden g�nderilen karbapenemaz ş�pheli izolatlarda karbapenemaz varlığı, karbapenemaz genine �zg�l primer setleri kullanılarak multipleks polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) y�ntemiyle araştırıldı. Kontrol suşları olarak EuSCAPE tarafından g�nderilen OXA-48, KPC, NDM, VIM ve IMP pozitif K.pneumoniae izolatları kullanıldı. Kalıp DNA'nın hazırlanması i�in izolatlar bir gece 37�C'de Mueller Hinton buyyonda ink�be edildi. Bakteri s�spansiyonları 4000 rpm'de 10 dakika santrif�j edildi. ��kelti �zerine 1 ml Tris-EDTA (TE) tamponu eklenerek homojenize edildikten sonra tekrar 10000 rpm'de santrif�j edildi ve ��kelti �zerine 1 ml TE tamponu kondu. Bu yıkama işlemi beş kez tekrarlandı. Daha sonra ��kelti �zerine 100 �l TE tamponu eklenerek 30 dakika su banyosunda kaynatıldı. On dakika 14000 rpm'de santrif�j sonrası �st sıvı steril mikrosantrif�j t�p�ne aktarıldı. PCR, toplam 25 �l hacimde ger�ekleştirildi. Tepkime karışımı; steril distile su, 1x PCR tamponu, 0.2 mM dNTP, 2.5 mM MgCl2, 0.250U Taq polimeraz, her bir primer setinden 20 pmol ve 2.5 �l kalıp DNA olacak şekilde hazırlandı. Her izolat i�in KPC, NDM ve OXA-48 gen b�lgelerine �zg�l primer setleri kullanılarak TC-3000 (Techne Prime Thermal Cycler, İngiltere) cihazında 95�C'de 5 dakika ilk denat�rasyon aşamasının ardından, 95�C'de 45 saniye denat�rasyon, 60�C'de 45 saniye bağlanma ve 72�C'de 1 dakika uzama ile toplam 35 d�ng� ve son uzama olarak 72�C'de 8 dakika6 ve her izolat i�in IMP ve VIM gen b�lgelerine �zg�l primer setleri kullanılarak 94�C'de 5 dakika ilk denat�rasyon aşamasının ardından 94�C'de 30 saniye denat�rasyon, 52�C'de 40 saniye bağlanma ve 72�C'de 50 saniye uzama ile toplam 36 d�ng� ve son uzama olarak 72�C'de 5 dakika olmak �zere polimeraz zincir reaksiyonu ger�ekleştirildi7. Amplifiye edilen �r�nler agaroz jel elektroforezinde g�r�nt�lendi. Kullanılan primer dizileri ve bant b�y�kl�kleri Tablo II'de g�sterildi.


Tablo II

BULGULAR

Kasım 2013'den itibaren ilk 6 aylık s�re i�inde EuSCAPE projesi kapsamında T�rkiye'nin �eşitli b�lgelerinden belirlenen 18 merkezden, koordinat�r merkeze toplam 155 karbapenemaz ş�pheli K.pneumoniae (n= 134, %86.5) ve E.coli (n= 21, %13.5) izolatı g�nderilmiştir. Karbapenemaz varlığı ş�pheli 21 E.coli izolatının 19'unda (%90.5) ve 134 K.pneumoniae izolatının 124'�nde (%92.5) fenotipik y�ntemle karbapenemaz varlığı saptanmıştır. Uygulanan multipleks PCR analizi ile, fenotipik y�ntemle tespit edilen karbapenemaz varlığı doğrulanmıştır. Fenotipik test ile molek�ler y�ntemin karbapenemaz varlığını saptama a�ısından %100 uyumlu olduğu g�r�lm�şt�r. �alışılan 155 karbapenemaz ş�pheli izolatın 143'�nde (%92.3) genotipik olarak en az bir karbapenemaz geni saptanmıştır. Saptanan karbapenemaz enzimlerinin t�rlere g�re dağılımı Tablo III'de verilmiştir.


Tablo III

Onsekiz merkezden gelen karbapenemaz ş�pheli 155 izolattan en az bir karbapenemaz enzimi i�eren 143 izolatın 121'inde (%84.6) OXA-48 enzimi saptanmıştır. İkinci sıklıkta saptanan NDM enzimi, tek başına �zellikle G�neydoğu Anadolu B�lgesinde bulunan merkezlerden g�nderilen izolatlarda tespit edilmiştir. Tek başına VIM veya IMP i�eren izolatlar iki merkezden izole edilmişken, hi�bir izolatta KPC enzimi saptanmamıştır. Merkezlerden g�nderilen izolatlarda saptanan enzimlerin merkezlere g�re dağılımı Tablo IV'de verilmiştir.


Tablo IV

Karbapenemaz ş�phesi ile g�nderilen 155 izolatta mikrodil�syon y�ntemi ile imipenem, meropenem ve ertapenem MİK değerleri araştırılmış; sadece OXA-48 pozitif olan 121 izolatın 72'si (%59.5) imipeneme, 64'� (%52.9) meropeneme ve t�m� (%100) ertapeneme diren�li olarak bulunmuştur. EUCAST'ın karbapenemaz taraması i�in �ng�r�len sınır değerler a�ısından değerlendirildiğinde; 12 izolatın (%9.9) meropenem MİK değeri > 0.12 �g/ml'nin altında saptanmıştır. Buna karşılık MBL i�eren izolatların tamamı test edilen her �� antibiyotiğe de diren�li olarak bulunmuştur. OXA-48 pozitif 121 izolatın ve MBL pozitif bulunan 15 izolatın imipenem, meropenem ve ertapenem MİK değerlerinin dağılımı Sekil 1 ve 2'de g�sterilmiştir.


Sekil 1

Sekil 2

TARTIŞMA

Enterobacteriaceae ailesi i�inde �zellikle K.pneumoniae ve E.coli izolatlarında karbapenemaz �reten izolatlar hızla artış g�stermektedir. Bu izolatların gerek yayılımının �nlenmesinde, gerekse oluşturdukları enfeksiyonların uygun tedavisinde, klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında karbapenemaz �reten izolatların tanımlanması �nem taşımaktadır. Karbapenemaz i�eren izolatlarda antibiyotik duyarlılıkları değişkenlik g�sterebilmektedir. Karbapenemaz yanında GSBL veya AmpC tipi enzim de i�eren izolatlarda MİK değerleri y�ksek saptanırken, bazı karbapenemazlar tek başlarına karbapenem MİK değerlerinde zayıf y�kselmelere yol a�abilmekte ve izolat karbapenemaz i�erdiği halde duyarlılık sınırları i�inde saptanabilmektedir. B�yle bir durumda bu tip izolatların g�zden ka�ırılması olasıdır. EUCAST kriterlerine g�re meropenem,� imipenem ve ertapenemin sınır değerleri sırasıyla 2 �g/ml, 2 �g/ml ve 0.5 �g/ml'dir. Karbapenemaz a�ısından tarama kriteri olarak ise meropenem, imipenem ve ertapenem MİK değerleri sırasıyla > 0.12 �g/ml, > 1 �g/ml ve > 0.12 �g/ml olan izolatlara doğrulama testlerinin yapılması �nerilmektedir8. Bu sınır değerlerin se�imi, karbapenemaz genini zayıf ifade eden ve bu nedenle duyarlılık sınırları i�inde kalan izolatların g�zden ka�ırılmaması i�in �ng�r�len değerlerdir.

EUCAST, karbapenemaz taraması i�in �zellikle meropenemi �nermektedir. Meropenemin� sınıf A tipi enzimler i�in taramada duyarlılığının �ok y�ksek olduğu saptanmıştır. Karbapenemaz taramasında ertapenem ve imipenemin bazı dezavantajları bulunmaktadır. Sınıf A karbapenemazlar i�inde bulunan KPC tipi enzimlerin dışında kalan diğer enzimler ertapeneme duyarlıdır. Bunun yanı sıra, ertapeneme diren� i�in izolatta bulunabilen AmpC veya GSBL ile birlikte porin kaybı yeterli olabilmektedir. Bu nedenle ertapenemin, karbapenemaz taramasında imipenem ve meropeneme g�re �zg�ll�ğ� d�ş�kt�r. İmipenem de taramada �nerilmeyen diğer bir karbapenemdir. Proteus, Serratia, Providencia ve Morganella izolatlarında karbapenemaz bulunmaksızın farklı mekanizmalar ile imipeneme diren� gelişmektedir9.

Gram-negatif basillerde bir�ok karbapenem hidrolizi yapan enzim tanımlanmış olsa da, en sık Ambler sınıf A (KPC tipi), sınıf B (VIM, NDM ve IMP tipi) ve sınıf D (OXA-48 benzeri) enzimler bu diren�ten sorumludur. Aynı zamanda plazmid kaynaklı sefalosporinazlardan Ambler sınıf C'de yer alan AmpC enzimlerinin de karbapenem hidrolizi yapabildikleri bilindiğinden, karbapenemaz taramasında bu enzimlerin de g�z �n�nde bulundurulması gerekmektedir8. Karbapenem hidrolizi yapan enzimler i�inde bulunan OXA-48 enzimi, ilk defa 2001 yılında �lkemizde bir K.pneumoniae izolatında saptanmıştır10. Uzun yıllar �lkemize �zg� bir enzim olarak kalan OXA-48, 2008 yılından itibaren bir�ok �lkede saptanmaya başlanmıştır. Sporadik olguların yanı sıra, bu enzimi taşıyan izolatlar ile Bel�ika, Fransa, Yunanistan, Hollanda ve İspanya'da salgınlar meydana gelmiştir11. OXA-48 enzimi; klavulanik asit, tazobaktam ve sulbaktam gibi beta-laktamaz inhibit�rleri ile inhibe olmayan, penisilinleri y�ksek d�zeyde, karbapenemleri d�ş�k d�zeyde hidroliz edebilen, geniş spektrumlu sefalosporinlere zayıf aktivite g�steren bir enzimdir. Bu enzimi i�eren izolatlarda saptanan d�ş�k MİK değerleri izolatların g�zden ka�masına ve bu nedenle direncin fark edilmeden yayılmasına neden olmaktadır12,13,14.

Bu �alışmada, EuSCAPE projesi kapsamında, merkezimize g�nderilen karbapenemaz ş�pheli izolatlarda imipenem, meropenem ve ertapenem MİK değerleri araştırılmıştır. Metallo-beta-laktamaz (MBL) pozitif saptanan toplam 15 izolatın hepsi her �� karbapeneme de diren�li olarak saptanmıştır. Ancak karbapenemaz ş�phesi ile g�nderilen ve karbapenemaz enzimi a�ısından sadece OXA-48 i�eren 121 izolatta her �� karbapenem i�in alınan MİK değerlerinin olduk�a değişken olduğu g�zlenmiştir. İzolatların 49'u (%40.5) imipeneme ve 64'� (%47.1) meropeneme duyarlı olarak saptanırken, hi�bir izolat ertapeneme duyarlı bulunmamıştır. EUCAST tarama kriterleri a�ısından değerlendirildiğinde ise, OXA-48 pozitif 121 izolatın 12'sinin (%9.91) meropenem a�ısından tarama kriterinin (> 0.12 �g/ml) altında kaldığı belirlenmiştir. Bu sonu�lar g�z �n�ne alındığında, her ne kadar EUCAST tarafından taramada meropenem �neriliyor olsa da, OXA-48 i�eren izolatların yaklaşık 10'unun g�zden ka�ırılacağı g�r�lmektedir. Buna karşın �zg�ll�ğ� d�ş�k olmakla birlikte ertapenem MİK değerleri t�m OXA-48 i�eren izolatlarda tarama değeri olan > 0.12 �g/ml'nin �zerinde saptanmıştır. Bu nedenle, OXA-48'in �ok yaygın g�r�ld�ğ� �lkemizde karbapenemaz tarama kriteri olarak ertapenemin kullanılmasının daha uygun olacağı d�ş�n�lmektedir. Daha �nce yapılan bazı araştırmalar, bu �alışmadan �ıkan sonu�ları destekler niteliktedir. Kanada'dan yapılan bir �alışmada, OXA-48 i�eren izolatların meropenem ve imipeneme duyarlı olabileceği, bu nedenle de taramada ertapenemin kullanılması gerektiği belirtilmiştir15. Yapılan �ok merkezli bir �alışmada, �lkemizin de aralarında bulunduğu 10 �lkeden, 2001-2011 yılları arasında izole edilmiş OXA-48 pozitif K.pneumoniae ve E.coli izolatlarında imipenem, meropenem ve ertapenem MİK değerleri antibiyotik gradiyent test y�ntemi ile retrospektif olarak değerlendirilmiş, izolatların %34.1'i imipeneme, %33'� meropeneme ve %90.1'i ertapeneme diren�li bulunmuştur. Bu bulgular sonucunda, ertapenemin �zellikle OXA-48'in yaygın olarak bulunduğu b�lgelerde karbapenemaz a�ısından taramaya en uygun antibiyotik olduğu g�r�ş� elde edilmiştir11. Bel�ika'dan yapılan benzer bir �alışmada da, OXA-48 pozitif izolatların %40'ı imipeneme, %48'i meropeneme diren�li olarak saptanırken, t�m izolatların ertapeneme diren�li oldukları belirlenmiştir16. Ertapenem direnci, karbapenemaz taramasında en duyarlı g�sterge olmakla birlikte, karbapenemaz prevalansının d�ş�k olduğu b�lgelerde d�ş�k pozitif prediktif değere (PPV) sahiptir. EUCAST'ın �nerisine g�re, disk dif�zyon y�nteminin kullanıldığı durumlarda meropenem inhibisyon zonu < 25 mm olan izolatların karbapenemaz a�ısından taranması �nerilmektedir. Ancak bu kriterin uygulandığı bir �alışmada, OXA-48 pozitif 323 izolatın 80'i g�zden ka�ırılmıştır17. Bu nedenle EUCAST, �zellikle OXA-48'in yaygın olarak bulunduğu b�lgelerde, tarama kriteri olarak meropenem inhibisyon zonu < 27 mm olan izolatların taranmasını �nermektedir5. OXA-48'in yaygın olarak bulunduğu b�lgelerde, temosilin inhibisyon zonunun < 12 mm veya MİK değerinin > 128 mg/L olması, izolatta OXA-48'in bulunabileceğine dair kuvvetli bir g�sterge olarak karşımıza �ıkmaktadır17. Bizim �alışmamızda da, genotipik olarak OXA-48 varlığının doğrulandığı t�m izolatlarda Rosco diskleri ile yapılan fenotipik testlerde temosilin inhibisyon zonunun < 12 mm'nin altında olduğu belirlenmiştir. Ancak test 15 adet MBL (IMP, VIM ve/veya NDM) pozitif izolata uygulandığında, t�m izolatlarda meropenem diskinde belirlenen inhibisyon �apına g�re, meropenem ve dipikolinik asidin bulunduğu inhibisyon zon �apında 4 mm ve �zeri bir artış saptanmakla birlikte bu izolatlardan sekizinde temosilin inhibisyon zonunun < 12 mm olduğu g�zlenmiştir. Bu durumda temosilin direnci MBL'den kaynaklanabileceği gibi izolatta MBL yanında OXA-48'in de bulunabilme olasılığı vardır. Bu nedenle bu t�r izolatlarda mutlaka genotipik doğrulama yapılmalıdır. Yapılan molek�ler test sonucunda, bu izolatların sadece MBL i�erdiği saptanmıştır. Benzer şekilde yapılan bir �alışmada, DPA ile sinerji verdiği tespit edilen 31 adet MBL pozitif izolattan 20'si aynı zamanda temosilin direnci de g�stermiştir18.

D�nyada karbapenemaz �reten enterik bakterilerin hızla artış g�stermesi, bu izolatların tanımlanmasında g�venilir fenotipik testlere olan ihtiyacı g�ndeme getirmiştir. Duyarlılık ve �zg�ll�ğ� y�ksek bir metodun bulunması, bu patojenler ile gelişen enfeksiyonların gerek tedavisinde gerekse yayılımının �nlenmesinde �nemlidir8. EUCAST son rehberinde, tarama kriterlerine uygun olan izolatlarda fenotipik değerlendirme y�ntemi olarak Rosco'nun KPC, MBL ve OXA-48 doğrulama kitininin kullanımını �nermektedir5. Yapılan bir�ok �alışmada, doğrulama testinin karbapenemazları tanımlamada genotipik testlere g�re duyarlılık ve �zg�ll�ğ� %95-100 arasında saptanmıştır1,8,19,20,21,22. Bizim �alışmamızda, karbapenemaz ş�phesiyle merkezimize g�nderilen toplam 155 klinik izolatta karbapenemaz varlığı genotipik y�ntemler ile araştırılmış, bu izolatlar aynı zamanda Rosco KPC, MBL ve OXA-48 doğrulama kiti ile de test edilmiştir. T�m izolatlarda tespit edilen fenotipik test sonu�larının, molek�ler y�ntemler ile elde edilen sonu�lar ile %100 uyumlu olduğu saptanmıştır. Ancak �lkemizde Rosco KPC, MBL ve OXA-48 doğrulama kiti bulunmamaktadır. Bu kitin eşdeğeri olan, �lkemizde temin edilebilen ve aynı prensibe dayanan farklı firmaların doğrulama kitleri mevcuttur. �lkemizde bu firmalara ait KPC, MBL ve OXA-48 doğrulama kitleri ile daha �nce yapılan bir �alışma bulunmadığından, bundan sonraki �alışmalarda bu kitlerin değerlendirilmesine y�nelik geniş �aplı araştırmalara ihtiya� vardır. Diğer yandan, gerek Rosco gerekse diğer bazı firmaların doğrulama testinde kullandıkları disklerin i�eriği bilinmektedir. Bu nedenle her merkez bu diskleri kendi imkanları ile hazırlayabilmektedir. İsve�'te yapılan bir �alışmada, genotipik olarak KPC, IMP, VIM veya OXA-48 olarak tanımlanmış izolatlarda, fenotipik test olarak kendi hazırladıkları diskleri kullanarak kombinasyon disk testi uygulanmış ve duyarlılık %100 ve �zg�ll�k %98 olarak saptanmıştır23.

Karbapenemazların tanımlanmasında aynı zamanda MALDI-TOF veya spektrofotometrik y�ntemler de uygulanabilmektedir. Ancak bu t�r y�ntemleri uygulamak i�in ekipmana gerek duyulması nedeniyle kombinasyon sinerji testi rutin laboratuvarlarda uygulanabilecek pratik, g�venilir ve maliyeti d�ş�k bir testtir18.���

Karbapenemaz ş�phesi ile merkezimize g�nderilen toplam 155 klinik izolatın 143'�nde uygulanan molek�ler y�ntemle en az bir karbapenemaz enzimi belirlenmiştir. Bu izolatlarda en sık saptanan enzim, sınıf D karbapenemazlar i�inde yer alan OXA-48 enzimi (%84.6) olup, OXA-48 yaygın olarak t�m merkezlerde saptanmıştır. Daha �nce �lkemizde bu konuda yapılan �alışmalarda da, benzer şekilde her merkezden yaygın olarak OXA-48 enzimi bildirilmiştir24,25,26.

MBL grubunda bulunan VIM, IMP ve NDM enzimleri, daha �nce yapılan tek merkezli bazı yayınlarda araştırılmış ve genel olarak nadir saptandığı sonucuna varılmıştır27,28,29. Bizim �alışmamızda da 18 merkezden g�nderilen izolatlar arasında VIM ve IMP enziminin saptanma oranı, sırasıyla %2.8 ve %1.4 olarak bulunmuştur. NDM enzimi, �lkemizde ilk defa 2011 yılında İstanbul'da bir K.pneumoniae izolatında saptanmıştır30. Daha sonraki yıllarda, İstanbul26 ve Kayseri'den31 yapılmış tek merkezli �alışmalarda da NDM enziminin varlığı belirlenmiştir. Daha �nce yapılan �alışmalardan farklı olarak, bizim �alışmamızda NDM enziminin OXA-48'den sonra ikinci sıklıkta (%6.3) saptanan enzim olduğu belirlenmiştir. On sekiz merkezden g�nderilen izolatlar arasında tek başına NDM saptanan izolatların tamamı, G�neydoğu Anadolu B�lgesi'ndeki merkezlerden g�nderilen izolatlardır. NDM'nin bu b�lgede daha yaygın olarak g�r�lmesinin muhtemel nedenleri, b�lgede son zamanlarda artan g�� ve hijyenik koşullarda yaşanan problemler olabilir. Ayrıca NDM enzimi, diğer �alışmalarda olduğu gibi Marmara B�lgesi'nden iki merkezde de saptanmıştır. Marmara B�lgesi'nden bir merkezde OXA-48 enzimi ile birlikte, diğer merkezde ise bir izolatta OXA-48 ile birlikte, diğer bir izolatta ise VIM ile birlikte saptanmıştır. NDM enzimini bulunduran izolatlar diğer MBL'larla olduğu gibi daha y�ksek karbapenem MİK değerlerine sahiptir.

Sınıf A karbapenemaz grubunda bulunan KPC enzimi �lkemizde ilk defa 2014 yılında bir K.pneumoniae izolatında tanımlanmıştır32. Bizim �alışmamızda ise, 18 merkezden g�nderilen izolatların hi�birinde KPC enzimi varlığına rastlanmamıştır.

Sonu� olarak, T�rkiye'de 18 merkezden g�nderilen karbapenemaz ş�pheli izolatlar incelendiğinde; OXA-48 enziminin yaygın olarak saptandığı, NDM enziminin �zellikle G�neydoğu Anadolu B�lgesi'nde bulunan merkezlerde saptandığı, IMP ve VIM gibi enzimlere daha az sıklıkta rastlandığı ve KPC enziminin incelenen izolatların hi�birinde bulunmadığı g�r�lm�şt�r. OXA-48 enzimi i�eren izolatların bir�oğunun meropeneme duyarlı, ancak tamamının ertapeneme diren�li olması nedeniyle, karbapenemaz taramasında ertapenemin en uygun antibiyotik olduğu; karbapenemaz varlığının doğrulanması amacıyla uygulanan kombine disk sinerji testinin molek�ler y�ntem sonu�ları ile uyumlu bulunması nedeniyle ekipman ve maliyet gerektiren molek�ler y�ntemlerin uygulanamadığı merkezlerde sinerji tekniğine dayalı bu fenotipik y�ntemin g�venle kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.

KAYNAKLAR

  1. Nordmann P. Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae: overview of a major public health challenge. Med Mal Infect 2014; 44(2): 51-6.
  2. Canton R, Akova M, Carmeli Y, et al. Rapid evolution and spread of carbapenemases among Enterobacteriaceae in Europe. Clin Microbiol Infect 2012; 18(5): 413-31.
  3. Nordmann P, Dortet L, Poirel L. Carbapenem resistance in Enterobacteriaceae: here is the storm. Trends Mol Med 2012; 18(5): 263-72.
  4. Woodford N, Pike R, Meunier RL, Hill R, Hopkins KL. In vitro activity of temocillin against multidrug-resistant clinical isolates of Escherichia coli, Klebsiella spp. and Enterobacter spp., and evaluation of high-level temocillin resistance as a diagnostic marker for OXA-48 carbapenemase. J Antimicrob Chemother 2014; 69(2): 564-7.
  5. Leclercq R, Canton R, Brown DF, et al. EUCAST expert rules in antimicrobial susceptibility testing. Clin Microbiol Infect 2013; 19(2): 141-60.
  6. Doyle D, Peirano G, Lascols C, Lloyd T, Church DL, Pitout D. Laboratory detection of Enterobacteriaceae that produce carbapenemases. J Clin Microbiol 2012; 50(12): 3877-80.
  7. Ellington MJ, Kistler J, Livermore DM, Woodford N. Multiplex PCR for rapid detection of genes encoding acquired metallo-beta-lactamase. J Antimicrob Chemother 2007; 59(2): 321-2.
  8. Bartolini A, Frasson I, Cavallaro A, Richter SN, Palu G. Comparison of phenotypic methods for the detection of carbapenem non-susceptible Enterobacteriaceae. Gut Pathog 2014; 6:13.
  9. Willems E, Verhaegen J, Magerman K, Nys S, Cartuyvels R. Towards a phenotypic screening strategy for emerging beta-lactamases in Gram-negative bacilli. Int J Antimicrob Agents 2013; 41(2): 99-109.
  10. Poirel L, Heritier C, Tol�n V, Nordmann P. Emergence of oxacillinase-mediated resistance to imipenem in Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48(1): 15-22.
  11. Potron A, Poirel L, Rondinaud E, Nordmann P. Intercontinental spread of OXA-48 beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae over a 11-year period, 2001 to 2011. Euro Surveill 2013; 18(31). pii: 20549.
  12. Studentova V, Papagiannitsis CC, Izdebski R, et al. Detection of OXA-48-type carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in diagnostic laboratories can be enhanced by addition of bicarbonates to cultivation media or reaction buffers. Folia Microbiol 2015; 60(2): 119-29.
  13. Hansen F, Hammerum AM, Skov RL, Giske CG, Sundsfrjord A, Samuelsen O. Evaluation of Rosco Neo-Sensitabs for phenotypic detection and subgrouping of ESBL-, AmpC- and carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. APMIS 2012; 120(9): 724-32.
  14. Poirel L, Potron A, Nordmann P. OXA-48-like carbapenemases: the phantom menace. J Antimicrob Chemother 2012; 67(7): 1597-606.
  15. Ellis C, Chung C, Patel SN, Desjardins M, Melano RG, Toye B. OXA-48-like carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in Ottawa, Canada. Diagn Microbiol Infect Dis 2013; 76(3): 399-400.
  16. Glupczynski Y, Huang TD, Bouchahrouf W, et al. Rapid emergence and spread of OXA-48 producing carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates in Belgian hospitals. Int J Antimicrob Agents 2012; 39(2): 168-72.
  17. Huang TD, Poirel L, Bogaerts P, Berhin C, Nordmann P, Glupczynski Y. Temocillin and piperacillin/tazobactam resistance by disc diffusion as antimicrobial surrogate markers for the detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in geographical areas with a high prevalence of OXA-48 producers. J Antimicrob Chemother 2014; 69(2): 445-50.
  18. van Dijk K, Voets GM, Scharringa J, et al. A disc diffusion assay for detection of class A, B and OXA-48 carbapenemases in Enterobacteriaceae using phenyl boronic acid, dipicolinic acid and temocillin. Clin Microbiol Infect 2014; 20(4): 345-9.
  19. Navarro-San Francisco C, Mora-Rillo M, Romero-Gomez MP, et al. Bacteraemia due to OXA-48-carbapenemase-producing Enterobacteriaceae: a major clinical challenge. Clin Microbiol Infect 2013; 19(2): E72-9.
  20. Doyle D, Peirano G, Lascols C, Lloyd T, Church DL, Pitout JD. Laboratory detection of Enterobacteriaceae that produce carbapenemases. J Clin Microbiol 2012; 50(12): 3877-80.
  21. Ambretti S, Gaibani P, Berlingeri A, et al. Evaluation of phenotypic and genotypic approaches for the detection of class A and class B carbapenemases in Enterobacteriaceae. Microb Drug Resist 2013; 19(3): 212-5.
  22. Miriagou V, Tzelepi E, Kotsakis SD, Daikos GL, Casals JB, Tzouvelekis LS. Combined disc methods for the detection of KPC- and/or VIM-positive Klebsiella pneumoniae: improving reliability for the double carbapenemase producers. Clin Microbiol Infect 2013; 19(9): E412-5.
  23. Giske CG, Gezelius L, Samuelsen O, Warner M, Sunsfjord A, Woodford N. A sensitive and specific phenotypic assay for detection of metallo-beta-lactamases and KPC in Klebsiella pneumoniae with the use of meropenem disks supplemented with aminophenylboronic acid, dipicolinic acid and cloxacillin. Clin Microbiol Infect 2011; 17(4): 552-6.
  24. Balkan I, Ayg�n G, Aydın S, et al. Blood stream infections due to OXA-48-like����� carbapenemases-producing Enterobacteriaceae: treatment and survival. Int J Infect Dis 2014; 26(9): 51-6.
  25. Nazik H, Aydın S, Albayrak R, et al. Detection and spread of OXA-48-producing Klebsiella oxytoca isolates in Istanbul, Turkey. Southeast Asian J Trop Med Public Health 2014; 45(1): 123-9.
  26. Poirel L, Yilmaz M, Istanbullu A, et al. Spread of NDM-1 producing Enterobacteriaceae in a neonatal intensive care unit in Istanbul, Turkey. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58(5): 2929-33.
  27. Peirano G, Lascols C, Hackel M, Hoban DJ, Pitout JD. Molecular epidemiology of Enterobacteriaceae that produce VIMs and IMPs from the SMART surveillance program. Diagn Microbiol Infect Dis 2014; 78(3): 277-81.
  28. Yıldırım I, Ceyhan M, G�r D, Mugnaioli C, Rossolini GM. First detection of VIM-1 type metallo-beta-lactamase in a multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae clinical isolate from Turkey also producing the CTX-M-15 extended-spectrum beta-lactamase. J Chemother 2007; 19(4): 467-8.
  29. Aktas Z, Bal C, Midilli K, Poirel L, Nordmann P. First IMP-1 producing Klebsiella pneumoniae isolate in Turkey. Clin Microbiol Infect 2006; 12(7): 695-6.
  30. Poirel L, Ozdamar M, Ocampo-Sosa AA, Turkoglu S, �zer UG, Nordmann P. NDM-1-producing Klebsiella pneumoniae now in Turkey. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56(5): 2784-5.
  31. Alp E, Per�in D, Colakoğlu S, et al. Molecular characterization of carbapenemase-resistant Klebsiella pneumoniae in a tertiary university hospital in Turkey. J Hosp Infect 2013; 84(2): 178-80.
  32. Labarca J, Poirel L, Ozdamar M, Turkoglu S, Hakko E, Nordmann P. KPC-producing Klebsiella pneumoniae, finally targeting Turkey. New Microbes New Infect 2014; 2(2): 50-1.

İletişim (Correspondence):

Uzm. Dr. Aslı �akar,

Hacettepe �niversitesi Tıp Fak�ltesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim� Dalı,

06100 Sıhhiye, Ankara, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 312 305 1560,

E-posta (E-mail): acakarunsal@yahoo.com

Yazdır