Yazdır

Kısa Bildiri/Short Communication
Mikrobiyol Bul 2016; 50(1): 152-158

Aydın'da İnsanlardan İzole Edilen Giardia intestinalis Suşlarının Genotiplendirilmesi*

Genotyping of Giardia intestinalis Strains Isolated From Humans in Aydin, Turkey

Sema ERTUĞ1, Hatice ERTABAKLAR1, Ser�in �ZLEM �ALIŞKAN2, Erdoğan MALATYALI1, B�lent BOZDOĞAN3

1 Adnan Menderes �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı, Aydın.

1 Adnan Menderes University Faculty of Medicine, Department of Medical Parasitology, Aydin, Turkey.

2 Adnan Menderes �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Biyofizik Anabilim Dalı, Aydın.

2 Adnan Menderes University Faculty of Medicine, Department of Biophysics, Aydin, Turkey.

3 Adnan Menderes �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Aydın.

3 Adnan Menderes University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Aydin, Turkey.

* Bu �alışma, Adnan Menderes �niversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir (TPF 07023).

�ZET

T�m d�nyada yaygın olarak bulunan Giardia intestinalis, insan ve diğer memelileri enfekte eden ince bağırsak yerleşimli kam�ılı bir protozoon parazittir. Parazitin g�n�m�ze kadar sekiz farklı genotipi tanımlanmış olup, bunlardan insanlarda enfeksiyon oluşturan zoonotik karakterli genotip A ve B'nin, d�ş�k konak �zg�ll�ğ�ne sahip olduğu bildirilmektedir. Yapılan �alışmalarda farklı genotipe sahip izolatların farklı patojenik ve klinik �zelliklere sahip oldukları ifade edilmektedir. Bu �alışmada Aydın'da saptanan G. intestinalis izolatlarının genotiplerinin belirlenmesi ama�lanmıştır. �alışma kapsamında, Ocak 2011 ve Aralık 2014 tarihleri arasında Adnan Menderes �niversitesi, Parazitoloji Laboratuvarına değişik polikliniklerden rutin parazitolojik inceleme i�in g�nderilen ve direkt mikroskobik inceleme sonucu G. intestinalis saptanan toplam 40 dışkı �rneği değerlendirilmiştir. Pozitif �rneklerden DNA izolasyonu ticari bir kit (QIAamp DNA Stool Mini Kit, Qiagen, Almanya) ile yapılmış, G. intestinalis'in 16S rRNA ve beta-giardin gen b�lgeleri polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile �oğaltılmış ve elde edilen amplikonlar dizilenmiştir. 16S rRNA gen b�lgesine y�nelik PCR ile 40 izolatın 11'inde (%27.5) ve beta-giardin gen b�lgesine y�nelik PCR ile 10'unda (%25) olmak �zere toplam 21 �rnekte beklenen boyutta bantlar g�r�lm�şt�r. Dizilenen 21 amplikonun 10'u (%47.6) referans diziler ile %98-100 benzerlik g�stermiş ve genotipleri belirlenebilmiştir. Genotiplerin dağılımı; A1 (n: 3), A2 (n: 3), A3 (n: 2) ve B (n: 2) şeklinde bulunmuştur. Elde edilen veriler ışığında insanlarda saptanan t�rlerin zoonotik olabileceği �ng�r�lmektedir. �lkemizde yapılan diğer �alışmalarda olduğu gibi, b�lgemizde de genotip A'ya (8/10) genotip B'den (2/10) daha fazla rastlanmıştır. Toplamda 40 izolattan 10'unun (%25) genotipi belirlenebilmiş; G.intestinalis genotiplerinin belirlenmesinde beta-giardin genine y�nelik dizi analizinin, 16S rRNA i�in olana g�re daha iyi sonu�lar verdiği g�zlenmiştir. Bu nedenle, iki gen b�lgesinin karşılaştırılmasına olanak sağlayan, �rnek sayısının fazla olduğu �alışmaların gerekli olduğu d�ş�n�lmektedir.

Anahtar s�zc�kler: Giardia intestinalis; genotiplendirme; beta-giardin; T�rkiye.

ABSTRACT

Giardia intestinalis which is a flagellate, intestinal protozoon of humans and a variety of mammalian species, shows worldwide distribution. To date, eight genotypes of the parasite have been identified. Among these genotypes, assemblage A and B have zoonotic characteristics with low host specificity, thus they are responsible for the human infections. The aim of this study was to identify G.intestinalis genotypes in Aydin, located in Aegean region of Turkey. A total of 40 stool samples that were found positive for G.intestinalis by direct microscopic examination, from Adnan Menderes University, Research and Training Hospital, Parasitology Laboratory from January 2011 to December 2014 were included in the study. DNA isolation from stool samples performed with commercial kit (QIAamp DNA Stool Mini Kit, Qiagen, Germany) followed by polymerase chain reaction (PCR) for G.intestinalis 16S rRNA and beta-giardin genes and then the amplicons were sequenced. Out of 40 isolates 11 (27.5%) were positive with 16S rRNA PCR and 10 (25%) were positive with beta-giardin PCR. Of 21 sequenced amplicons, 10 (47.6%) of them showed 98%-100% similarity with reference sequences and their genotypes could be identified. The distribution of genotypes were as follows: cluster A1 (n: 3), cluster A2 (n: 3), cluster A3 (n: 2) and assemblage B (n: 2). In the light of our results the isolates detected in humans might be zoonotic origin. In accordance with the previous reports in Turkey, assemblage A (8/10) was more common than assemblage B (2/10). In the present study, 10 (25%) out of 40 isolates could be genotyped and sequencing of beta-giardin gene yielded more effective results than sequencing of 16S rRNA for the determination of assemblages. The present study indicated that, there is a need for prospective studies with extended number of cases allowing the comparison of the two genes used for G.intestinalis genotyping.

Keywords: Giardia intestinalis; genotyping; beta-giardin; Turkey.

Geliş Tarihi (Received): 09.06.2015 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 29.10.2015

GİRİŞ

Giardia, kuşlar, s�r�ngenler, memeliler ve insanlarda g�r�lebilen gastointestinal yerleşimli, kam�ılı bir protozoon parazittir. İnsanda enfeksiyona neden olan tek t�r G.intestinalis olup zoonotik ge�işin de m�mk�n olduğu bildirilmiştir. Kozmopolit bir dağılım g�steren G.intestinalis, gelişmekte olan �lkelerde daha yaygın g�r�lmekte ve bu �lkelerde �nemli bir �ocukluk �ağı ishal etkeni olarak bildirilmektedir1. �lkemizde son yıllarda yapılan bir �alışmada, G.intestinalis yaygınlığının %2.6 ile %15.6 arasında değiştiği rapor edilmiştir2. Aydın'da yapılan �alışmalarda ise parazit pozitifliği oranları %1.7-15.5 arasında değişmektedir3,4.

Yapılan araştırmalar, G.intestinalis'in en az sekiz adet genotipten (assemblage A-H) oluştuğunu ortaya koymuştur. Bunlardan genotip A ve B, insanda enfeksiyona neden olan zoonotik karakterli genotipler olarak bildirilmiştir5. Genotip tayini, farklı molek�ler y�ntemlerle [enzim elektroforez paternleri, iki turlu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)-restriksiyon par�a uzunluğu polimorfizmi (RFLP), ger�ek zamanlı PCR ve glutamat dehidrogenaz, beta-giardin, uzama fakt�r�-1 alfa, trioz fosfat izomeraz ve 16S rRNA genlerinin dizi analizleri] yapılabilmektedir6. Beta-giardin gen dizisine g�re genotip A 3 (A1-3), genotip B ise 4 (B1-4) alt gruba ayrılmaktadır7. Genotiplerde g�r�len farklılığın; parazitin fenotipi, metabolizması, biyokimyası, in vitro/in vivo �oğalma hızı, ila� duyarlılığı, besiyeri pH tercihi, G.intestinalis virusuna duyarlılığı ve enfeksiyonların kliniğinde etkili olduğu ifade edilmektedir8. Ayrıca gruplar arasında kromozom sayısının ve b�y�kl�ğ�n�n de farklılık g�sterdiği bildirilmiştir9. Buna karşın, konak �zg�ll�ğ�n� belirleyen genetik fakt�rler hen�z tam olarak aydınlatılamamıştır10. Bu �alışmada, laboratuvarımızda saptanan G.intestinalis suşlarının genotiplendirilmesi ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

�alışmaya, Ocak 2011-Aralık 2014 tarihleri arasında, Adnan Menderes �niversitesi, Parazitoloji Laboratuvarında direkt mikroskobik inceleme sonucu G.intestinalis saptanan toplam 40 dışkı �rneği alındı. �rnekler 1.5 ml'lik mikrosantrif�j t�plerinde herhangi bir fiksatif eklenmeden -20�C'de saklandı.

�rneklerden DNA izolasyonu, QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Almanya) ile �retici firmanın �nerileri doğrultusunda yapıldı. G.intestinalis 16S rRNA geninin 292 baz �ift (b�)'lik kısmı RH11 (5'-CATCCGGTCGATCCTGCC-3') ve RH4 (5'-AGTCGAACCCTGATTCTCCGCCCAGG-3') primerleri ile �oğaltıldı. PCR reaksiyonu 30 �l hacimde; 2 mmol MgCl2 (Fermentas), 0.2 mmol dNTP (Fermentas), 0.4 pmol her bir primer, 0.3 U Taq polimeraz (Fermentas), 1x Taq tamponu (NH4)2SO4 (Fermentas) olacak şekilde hazırlandı. Amplifikasyon işlemi, ısı d�ng� cihazında (TC-312, Techne), �n denat�rasyon 96�C'de 2 dk, 25 d�ng� (96�C'de 20 sn, 59�C'de 20 sn ve 72�C'de 30 sn), son uzama 72�C'de 7 dk olacak şekilde ger�ekleştirildi. G.intestinalis beta-giardin geninin 753 b�'lik kısmı G7 (5'-AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC-3') ve G759 (5'-GAGGCCGCCCTGGATCTT CGAGACGAC-3') primerleri 16S rRNA'da olduğu gibi hazırlandı. Amplifikasyon işlemi, �n denat�rasyon 94�C'de 5 dk, 35 d�ng� (94�C'de 30 sn, 65�C'de 30 sn ve 72�C'de 60 sn), son uzama 72�C'de 7 dk olacak şekilde uygulandı. Reaksiyonların sonunda elde edilen PCR �r�nlerinden 10 �l alınarak SYBR Safe (Invitrogen) ve 50 b�'lik belirte� (Fermentas) ile %1.5 agaroz jelde y�r�t�lerek g�r�nt�lendi.

PCR sonucu elde edilen amplikonlar, dizilenmek �zere Macrogen Inc. (G�ney Kore) firmasına g�nderildi. �alışmamızda elde edilen diziler 16S rRNA ve beta-giardin referans dizileri ile Clustal X kullanılarak karşılaştırıldı11. Beta-giardin geni i�in referansların GenBank erişim numaraları ve genotipleri; AY258617(A1), AY072723(A2), AY072725 (B1) ve AY072726 (B2) şeklinde idi. Ayrıca, Portland-1 (M54878) dizisi de 16S rRNA i�in referans olarak kullanıldı.��

BULGULAR

�alışılan G.intestinalis pozitif 40 dışkı �rneğinden 16S rRNA gen b�lgesine y�nelik PCR ile �rneklerin 11'inde (%27.5), beta-giardin gen b�lgesine y�nelik PCR ile 10'unda (%25) beklenen boyutta (sırasıyla 292 ve 753 b�) bantlar g�zlenmiştir. Bu �rneklerin tamamında sadece tek y�ntemle pozitif sonu� alınmıştır. Beta-giardin geni �oğaltılan �rnekler ile 16S rRNA geni �oğaltılan �rnekler farklı olup, her iki gen b�lgesinin de �oğaltıldığı izolat bulunmamaktadır.

16S rRNA PCR pozitif 11 �rneğe ait dizilerden 3'�n�n (%18) GenBank'dakilerle %99 benzerlik g�sterdiği saptanmıştır. Bu �rnekler referans diziler ile karşılaştırıldığında A1 olarak tanımlanmış; ayrıca her �� �rnekte de 272. bazdan sonra bir "guanin"in fazla olduğu g�zlenmiştir (Tablo I). Bu dizi GenBank'a g�nderilmiş ve erişim numarası alınmıştır (KR297232). Diğer 7 diziden bazıları G.intestinalis'e �zg� olmadığı i�in, bazıları da dizi kalitesinin d�ş�k olması nedeniyle değerlendirilememiştir.


Tablo I

Beta-giardin PCR ile bant g�r�len 10 �rneğe ait diziler GenBank'daki verilerle karşılaştırıldığında 7'sinin farklı G.intestinalis suşları ile %98-100 arasında benzerlik g�sterdiği saptanmıştır. Geriye kalan 3 �rnek de dizi kalitesinin d�ş�k olması nedeniyle değerlendirilememiştir. �alışmamızda elde edilen 7 dizinin referanslar ile karşılaştırılması sonucu 3'� A2, 2'si A3 ve 2'si B olarak saptanmıştır (Tablo II ve III). Diziler GenBank'a g�nderilmiş ve erişim numaraları alınmıştır (KR297233, KR297234).


Tablo II

Tablo III

TARTIŞMA

Giardia intestinalis kompleksinden genotip A ve B, insanlarda ve bazı memelilerde enfeksiyon oluşturabilen zoonotik karakterli genotiplerdir6. �alışmamızda, dizi analizi yapılabilen 10 izolattan sekizi genotip A, ikisi de genotip B olarak saptanmıştır. Ayrıca genotip A izolatları kendi i�inde A1 (n: 3), A2 (n: 3) ve A3 (n: 2) olarak gruplandırılmıştır. Ancak genotip B i�in benzer bir gruplandırma yapmak m�mk�n olmamıştır. D�nya genelindeki araştırmalar değerlendirildiğinde, genotip B'nin daha yaygın (%60-69) olduğu g�r�lmektedir12,13. Ancak T�rkiye'de PCR-RFLP y�ntemiyle ve beta-giardin geni dizilenerek yapılan araştırmalarda, �alışmamızda olduğu gibi genotip A'nın B'den daha yaygın olduğu saptanmıştır14,15,16. İnsanlardaki farklı genotipler ile enfektivite ve enfeksiyonun kliniği arasındaki ilişkinin irdelendiği �alışmalarda olduk�a farklı sonu�lar elde edilmektedir. Aydın ve arkadaşları17, semptomlu olgularda genotip A'nın, semptomsuz olgularda ise genotip B'nin anlamlı şekilde y�ksek g�r�ld�ğ�n� bildirmiştir. Balcıoğlu ve arkadaşları14, enfekte 63 olgunun 54'�nde genotip A (%70.4), dokuzunda (%29.6) ise genotip B'yi saptamışlar; genotip B'nin kadınlarda daha sık g�r�ld�ğ�n�, karın ağrısı ve diyare ile ilişkili olduğunu belirtmişlerdir. Bu araştırıcılar ayrıca, �� izolata ait tpi gen dizisi de tanımlamışlardır14. Kocaeli'nde �ocuk yaş grubunda yapılan bir araştırmada, 22 izolatın 11'i (%50) genotip A, yedisi (%31.8) genotip B ve d�rd� karışık genotip (AB) olarak bulunmuştur16. Aynı araştırmada, yaş ile karışık genotiple enfekte olgular arasında anlamlı bir ilişki bulunurken, diğer genotiplerde benzer bir ilişkinin bulunmadığı da ifade edilmiştir16.�

Dışkıda bulunan inhibit�rlerin PCR'de negatif sonu�lar alınmasına neden olduğu vurgulanmaktadır18. Buna ek olarak, Değerli ve arkadaşları15, kist duvarı nedeniyle G.intestinalis kistlerinin par�alanmasının trofozoitlere g�re daha zor olduğunu ve yalnızca kist g�r�len dışkı �rneklerinden PCR ile sonu� alamadıklarını bildirmişlerdir. Babei ve arkadaşlarının19, dışkıdan farklı izolasyon kitlerini karşılaştırdıkları bir �alışmada, bizim �alışmamızda da kullanılan QIAamp Stool Mini Kit'in diğerlerine g�re daha duyarlı olduğu saptanmış; ayrıca izolasyon �ncesi yapılacak bazı modifikasyonlarla da başarı oranının artırılabileceği belirtilmiştir. �alışmamızda da direkt mikroskopi ile G.intestinalis saptanan 40 dışkı �rneğinin 11'inde (%27.5) 16S rRNA PCR ile, 10'unda (%25) ise beta-giardin PCR ile beklenen boyutta bantlar g�zlenmiştir. �rneklerin b�y�k kısmında PCR ile bant saptanamamasında, yukarıda ifade edilen sorunların rol oynayabileceği d�ş�n�lm�şt�r.

�alışmamızda 16S rRNA PCR ile elde edilen amplikonların %30'u, beta-giardin PCR ile elde edilen amplikonların %70'inin genotipi belirlenebilmiştir. 16S rRNA PCR ile genotipi belirlenemeyen dizilerde birden fazla amplifikasyona bağlı olabilecek arka planlar g�r�lm�şt�r. 16S rRNA geni bakterilerde de bulunduğu i�in G.intestinalis'e �zg� genin dışında diziler elde edildiği d�ş�n�lmektedir. Ancak beta-giardin geni hedef alındığında başarı şansının daha y�ksek olduğu izlenmiştir. Bu gen bakterilerde bulunmadığı i�in 16S rRNA PCR'dakine benzer bir durumun olmaması bu y�nteme avantaj sağlamaktadır. �alışmamızda genotiplendirilebilen �rnek sayısının az olması her ne kadar �alışmamızın kısıtlılığı olarak d�ş�n�lse de, bu �alışma konuyla ilgili T�rkiye'de yapılan az sayıdaki �alışmalardan biridir. Ayrıca ilimize ait ilk sonu�ları i�eren bu �alışmanın ilerideki �alışmalara ışık tutacağını d�ş�nmekteyiz. Sonu� olarak �alışmamızın verileri, �lkemizdeki diğer b�lgelerde olduğu gibi Aydın'da da genotip A'nın baskın olduğunu g�stermektedir. Araştırmamızda genotipi belirlenebilen izolat sayısının d�ş�k olması, parazitin DNA izolasyonunda yeni yaklaşımlara olan ihtiyacı ortaya koymaktadır.

KAYNAKLAR

  1. Muhsen K, Levine MM. A systematic review and meta-analysis of the association between Giardia lamblia and endemic pediatric diarrhea in developing countries. Clin Infect Dis� 2012; 55(4): 271-93.
  2. Bayram Y, Parlak M, �ıkman A. Van B�lge Eğitim ve Araştırma Hastanesi'nde Giardia intestinalis ve Entamoeba histolytica/dispar prevalansı: D�rt yıllık izlem. Dicle Med J 2013; 40(1): 40-4.
  3. Kapdağlı A, Ertabaklar H, Yaman S, Ertuğ S. Adnan Menderes �niversitesi Tıp Fak�ltesi Parazitoloji laboratuarına 2002 yılında başvuran olgulardaki bağırsak parazitlerinin değerlendirilmesi. Turkiye Parazitol Derg 2003; 27(4): 31-4.
  4. Yazici V,�Siriken F, Ertabaklar H, Ertuğ S. Investigation of intestinal parasites in food workers in hospitals in Aydin, Turkey. Turkiye Parazitol Derg 2007; 31(2): 136-8.
  5. Monis PT, Caccio SM, Thompson RC. Variation in Giardia: towards a taxonomic revision of the genus. Trends Parasitol 2009; 25(2): 93-100.
  6. Feng Y, Xiao L. Zoonotic potential and molecular epidemiology of Giardia species and giardiasis. Clin Microbiol Rev 2011; 24(1): 110-40.
  7. Caccio SM, De Giacomo M, Pozio E. Sequence analysis of the beta-giardin gene and development of a polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism assay to genotype Giardia duodenalis cysts from human faecal samples. Int J Parasitol 2002; 32(8): 1023-30.
  8. Thompson RC, Monis PT. Variation in Giardia: implications for taxonomy and epidemiology. Adv Parasitol 2004; 58: 69-137.
  9. Tumova P, Hofstetrova K, Nohynkova E, Hovorka O, Kral J. Cytogenetic evidence for diversity of two nuclei within a single diplomonad cell of Giardia. Chromosoma 2007; 116(1): 65-78.
  10. Jerlstrom-Hultqvist J, Franzen O, Ankarklev J, et al. Genome analysis and comparative genomics of a Giardia intestinalis assemblage E isolate. BMC Genomics 2010; 11: 543.
  11. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG. The Clustal_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res� 1997; 25(24): 4876-82.
  12. Caccio SM, Ryan U. Molecular epidemiology of giardiasis. Mol Biochem Parasitol 2008; 160(2): 75-80.
  13. Tak V, Mirdha BR, Yadav P, Vyas P, Makharia GK, Bhatnagar S. Molecular characterisation of Giardia intestinalis assemblages from human isolates at a tertiary care centre of India. Indian J Med Microbiol 2014; 32(1): 19-25.
  14. Balcıoğlu C, Kurt O, Sevil N, et al. Genotyping of Giardia lamblia in a cohort of Turkish patients: A search for a relationship between symptoms and genotypes. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2012; 18 (Suppl A): 125-31.
  15. Değerli S, Değerli N, Celiksoz A, �z�elik S. Genotyping of Giardia intestinalis isolated from people living in Sivas, Turkey. Turk J Med Sci 2012; 42(1): 1268-72.
  16. Tamer GS, Kasap M, Er DK. Genotyping and phylogenetic analysis of Giardia duodenalis isolates from Turkish children. Med Sci Monit 2015; 21: 526-32.
  17. Aydın AF, Beşirbellioğlu BA, Avcı IY, Tany�ksel M, Araz E, Pahsa A. Classification of Giardia duodenalis parasites in Turkey into groups A and B using restriction fragment length polymorphism. Diagn Microbiol Infect Dis 2004; 50(2): 147-51.
  18. Jiang J, Alderisio KA, Singh A, Xiao L. Development of procedures for direct extraction of Cryptosporidium DNA from water concentrates and for relief of PCR inhibitors. Appl Environ Microbiol 2005; 71(3): 1135-41.
  19. Babaei Z, Oormazdi H, Rezaie S, Rezaeian M, Razmjou E. Giardia intestinalis: DNA extraction approaches to improve PCR results. Exp Parasitol 2011; 128(2): 159-62.

İletişim (Correspondence):

Prof. Dr. Sema Ertuğ,

Adnan Menderes �niversitesi Tıp Fak�ltesi,

Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı,

09010 Aydın, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 256 212 1850,

E-posta (E-mail): sertug@adu.edu.tr

Yazdır