Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2016; 50(2): 186-195

Kan Akımı Enfeksiyonu Etkeni Olan Kinolona Diren�li Escherichia coli ve
Klebsiella spp. İzolatlarında Plazmid Aracılı Kinolon Diren� Genlerinin Araştırılması

Investigation of Plasmid-Mediated Quinolone Resistance Genes in Quinolone-Resistant
Escherichia coli and Klebsiella spp. Isolates from Bloodstream Infections

Celal Kurtuluş BURUK, Hikmet �ZTEL OCAK, G�l�in BAYRAMOĞLU, Faruk AYDIN

Karadeniz Teknik �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Trabzon.

Karadeniz Technical University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Trabzon, Turkey.

�Z

Sepsiste en sık karşılaşılan gram-negatif fırsat�ı patojenlerden olan Escherichia coli ve Klebsiella t�rlerinin oluşturduğu enfeksiyonların tedavi se�eneklerinden biri de kinolonlardır. DNA sentezini bozarak etki g�steren kinolonlara karşı diren� giderek artmaktadır. Direncin yayılmasında plazmid aracılı kinolon diren� (plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR) genlerinin horizontal aktarımı �nemli rol oynamaktadır. PMQR genlerinin prevalansı ile ilgili �lkemize ait veriler olduk�a sınırlıdır. Bu �alışmada, kan k�lt�rlerinden izole edilen kinolona diren�li Escherichia coli ve Klebsiella spp. izolatlarında, bug�ne kadar PMQR genleri olarak tanımlanan qnrA, qnrB, qnrC, qnrS, qnrD, aac(6')-Ib-cr, qepA ve oqxAB'nin varlığının araştırılması ama�lanmıştır. �alışmaya Karadeniz Teknik �niversitesi Tıp Fak�ltesi Farabi Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Hasta Hizmetleri Laboratuvarı Bakteriyoloji Biriminde, Ocak 2012 - Ağustos 2013 tarihleri arasında 187 hastaya ait 193 kan �rneğinden �retilen 127 E. coli ve 66 Klebsiella spp. izolatından, fenotipik y�ntemlerle nalidiksik asit ve/veya siprofloksasin direnci tespit edilen izolatlar dahil edilmiştir. PMQR genlerinin varlığı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile araştırılmış; aac(6')-Ib-cr varyantının belirlenmesinde PCR sonrası restriksiyon par�a uzunluğu polimorfizmi (PCR-RFLP) y�ntemi kullanılmıştır. Pozitif bant i�eriği dizilenerek, daha �nce tanımlanmış diren� gen dizileri ile karşılaştırılmış ve doğrulanmıştır. �alışmamızda, E.coli izolatlarının %56.7'si (72/127) ve Klebsiella spp. izolatlarının %19.7'si (13/66) olmak �zere izolatların toplam %44'� (85/193) fenotipik olarak diren�li bulunmuştur. Diren�li 13 Klebsiella izolatından 11'i K.pneumonia, ikisi K.oxytoca'dır. Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL) �reten suşlarda, kinolon direncinin (50/80, %62.5), GSBL negatiflere (35/113, %30.9) g�re daha y�ksek olduğu saptanmıştır. Diren� gen prevalansları, kinolona diren�li E.coli ve Klebsiella spp. izolatlarında sırasıyla, qnrA, %1.4 ve %15.4; qnrB, %4.2 ve %61.5; qnrS, %1.4 ve %7.7; qepA, %1.4 (sadece E.coli);� aac(6')-1b-cr, %38.9 ve %92.3; ve oqxAB, %1.4 ve %84.6 olarak belirlenmiştir. qnrC ve qnrD genleri tespit edilmemiştir. Diren�li Klebsiella izolatlarında �oklu gen taşıyıcılığı E.coli'ye g�re daha sık g�zlemlenmiştir. Sonu� olarak, kinolona diren�li E.coli ve Klebsiella spp. kan izolatlarında, aktarılabilir genlerin dirence katkısının araştırıldığı bu �alışmada, b�lgesine hizmet veren �niversitemiz hastanesi izolatlarında PMQR genlerinin prevalanslarının �lkemiz verilerinden y�ksek olduğu saptanmıştır. Ayrıca, bu �alışma ile �lkemizde klinik �rneklerde ilk defa prevalansları sorgulanan genlerden qnrD geni saptanamazken, oqxAB genlerinin sıklıklarına ait ilk veriler sunulmuştur. Bununla birlikte oqxAB genlerinin genetik konumları, konjugasyon veya hibridizasyon y�ntemleri ile doğrulanmaya gereksinim g�stermektedir.

Anahtar s�zc�kler: Escherichia coli; Klebsiella t�rleri; kan k�lt�r�; plazmid aracılı kinolon diren� genleri.

ABSTRACT

One of the treatment options of Escherichia coli and Klebsiella spp. infections which are the most common opportunistic pathogens of gram-negative sepsis is quinolones. Resistance to quinolones which act by disrupting DNA synthesis has been increasing. Horizontal transfer of plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes play an important role in the spread of resistance. The data about the prevalence of PMQR genes in our country is quite limited. The aim of this study was to investigate the presence of known PMQR genes namely qnrA, qnrB, qnrC, qnrS, qnrD, aac(6')-Ib-cr, qepA and oqxAB amongst quinolone-resistant E. coli and Klebsiella spp. strains isolated from blood cultures. One hundred twenty seven E.coli and 66 Klebsiella isolates detected as nalidixic acid- and/or ciprofloxacin-resistant by phenotypical methods, from 193 blood samples of 187 patients admitted to Karadeniz Technical University, Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Bacteriology Unit of Patient Service Laboratory between January 2012 to August 2013 were included in the study. The presence of PMQR genes were investigated by polymerase chain reaction (PCR) and for the detection of aac(6')-Ib-cr variants PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was used. The positive bands were sequenced using the same primers, and aligned with formerly defined resistance gene sequences, and confirmed. In the study, 56.7% (72/127) of E.coli and 19.7% (13/66) of Klebsiella spp. isolates, with a total of 44% (85/193) of all the isolates were found to be phenotypically resistant to quinolones. Of the 13 resistant Klebsiella isolates, 11 were K.pneumoniae, and two were K.oxytoca. Extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing isolates showed higher resistance (50/80, 62.5%) to quinolones than the negative ones (35/113, 30.9%). The prevalence of quinolone resistance genes among resistant E. coli and Klebsiella spp. isolates was determined as qnrA, 1.4% and 15.4%; qnrB, 4.2% and 61.5%; qnrS, 1.4% and 7.7%; qepA, 1.4% (only E.coli);� aac(6')-1b-cr, 38.9% and 92.3%; and oqxAB, 1.4% and 84.6%, respectively. qnrC and qnrD genes were not detected. Carriage of multiple resistance genes were observed more frequently among resistant Klebsiella isolates than E.coli strains. As a result, in this study investigating the contribution of transferrable genes to quinolone resistance, prevalence of PMQR genes in quinolone-resistant and blood isolates of E.coli and Klebsiella in our university hospital serving the region were found to be higher than the current data reported from the other studies in our country. Furthermore, this study presented the initial data for the first time in our country on the prevalence of qnrD which was undetected, and the frequency of oqxAB gene in clinical samples. However, location of oqxAB gene needs to be confirmed by conjugation or hybridization methods.

Keywords: Escherichia coli; Klebsiella species; blood culture; plasmid-mediated quinolone resistance genes.

Geliş Tarihi (Received): 04.12.2015 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 12.02.2016

GİRİŞ

Escherichia coli ve Klebsiella t�rleri sepsiste en sık izole edilen gram-negatif bakterilerdendir1. Uygun antibiyoterapi ile mortalite oranlarının azaltılabilmesine karşın, antibiyotiklere direncin artması tedaviyi zorlaştırmaktadır2. Enterobacteriaceae ailesi �yelerine karşı etkinliği y�ksek olan ve tedavide sıklıkla kullanılan kinolon grubu antibiyotiklere karşı diren� artışı da �nemli bir problem olarak karşımıza �ıkmaktadır. DNA sentezini bozarak bakterisidal etki g�steren kinolonlara karşı diren�, kromozomal (DNA giraz ve/veya topoizomeraz IV'� kodlayan genlerde ya da dışa-atım pompalarının ekspresyonunu ve zar ge�irgenliğini d�zenleyen genlerde mutasyon oluşumu) veya plazmid aracılı (plazmid kaynaklı kinolon diren� [PMQR] genlerinin varlığı) olabilmektedir3,4.

PMQR, bakteriler arasında konjugasyon yoluyla horizontal ge�iş g�stererek acil bir klinik problem olmuştur. PMQR genlerinin aktarılabilirliğinin yanı sıra bir diğer �nemi, florokinolonun terap�tik seviyelerinin varlığında dahi, klinik olarak diren�li suşların ortaya �ıkma olasılığını artırmasıdır5,6. PMQR genlerinin tek başlarına varlıkları bakterilerde k���k minimal inhibit�r konsantrasyon (MİK) y�kselmesine neden olsa da Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) kriterlerine g�re hassas olarak yorumlanabilmektedir7. Bununla birlikte bu k���k değişimler hastada daha y�ksek d�zey dirence sahip mutantların se�imi i�in yeterli olmaktadır8. Kinolonlara direncin plazmidle ilişkili olabildiği, qnr genlerinin g�sterilmesiyle g�ndeme gelmiştir. Plazmidle aktarılan qnr genlerinin ilk tespitinden bug�ne kadar farklı alt tipler (qnrA, qnrB, qnrC, qnrS ve qnrD) tanımlanmıştır5. Qnr proteinleri, DNA giraz ve topoizomeraz IV'e bağlanarak bu enzimleri kinolonun inhibisyonundan korumaktadır9. Ayrıca plazmidle aktarılan kinolon atım pompa geni qepA, �oklu ila� direnci atım pompa geni oqxAB ve modifiye aminoglikozid asetil transferaz geni aac(6')-Ib-cr'nin tanımlanması ile PMQR genlerinin �nemi daha da artmıştır8,10.

Plazmid aracılı kinolon diren� genlerinin prevalansının takibi, hastanelerde diren� aktarımının �nlenmesi ve kinolon grubu antibiyotiklerin tedavi protokollerindeki yerine ışık tutması a�ısından �nemlidir. Bununla birlikte PMQR genlerini taşıyan suşların in vitro olarak kinolonlara duyarlı bulunabilmesi, fenotipik testlerle saptanamaması, tedavi protokollerinin uygulanmasında ve enfeksiyon kontrol �nlemlerinin alınmasında g��l�klere neden olmaktadır. PMQR genlerinin prevalansı ile ilgili d�nya genelinde bir�ok �alışma yapılmış olmakla birlikte, bu konu ile ilgili olarak �lkemize ait veriler olduk�a sınırlıdır6,8. �lke sağlık politikası planlayıcılarına sağlayacağı katkısının yanında hastanemizde izole edilen suşlarda diren� oranlarının bilinmesi, b�lgesel klinisyenlerin enfeksiyon kontrol�ndeki yaklaşımlarını etkileyebilecektir. Bu nedenle planlanan bu �alışmada, 2012-2013 yıllarında kan �rneklerinden izole edilen Escherichia coli ve Klebsiella spp. izolatlarında kinolon diren� oranlarının belirlenmesi, aktarılabilir kinolon diren� mekanizmalarından PMQR genleri olan qnrA, qnrB, qnrC, qnrS, qnrD, aac(6')-Ib-cr, qepA ve oqxAB varlığının araştırılması ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

Karadeniz Teknik �niversitesi Tıp Fak�ltesi (KT�TF) Klinik Araştırmalar Etik Kurul Başkanlığı'nın onayı ile (Protokol: 2013/175) ger�ekleştirilen bu �alışmaya, KT�TF Farabi Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Hasta Hizmetleri Laboratuvarı Bakteriyoloji Biriminde, Ocak 2012 - Ağustos 2013 tarihleri arasında 187 hastaya ait kan �rneklerinden izole edilen 193 Escherichia coli ve Klebsiella izolatları dahil edildi. Bu izolatlardan nalidiksik asit ve/veya siprofloksasin direnci tespit edilen 81 hastaya ait 85 izolat PMQR genlerinin araştırılması i�in kullanıldı. D�rt hastanın iki epizotu tespit edilmiş olup her epizotun ilk izolatı �alışmaya alındı11.

Laboratuvarımıza, kan k�lt�r vasatına inok�le edilmiş olarak g�nderilmiş olan kan �rnekleri, BACTEC 9240 otomatize k�lt�r sisteminde (Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, ABD) ink�be edildi. �reme sinyali izlenildiğinde kan k�lt�r vasatından alınan bir miktar �rnek %5 koyun kanlı agar, EMB agar ve �ikolatamsı agara inok�le edildi ve uygun koşullarda ink�be edildi12,13. Escherichia coli ve Klebsiella spp. (K.pneumoniae veya K.oxytoca) olarak tiplendirilen şuşların diren� paternleri NMIC/ID-55 panellerinin kullanıldığı BD Phoenix sisteminde MİK y�ntemiyle incelendi. CLSI kriterlerine g�re duyarlı, orta duyarlı ve diren�li olarak kategorize edildi7. Nalidiksik asit ve/veya siprofloksasine diren�li olarak saptanan suşlar, Kirby-Bauer metoduna g�re standart disk dif�zyon metodu ile tekrar test edilerek diren�leri CLSI kriterlerine g�re doğrulandı7. GSBL �retiminin fenotipik tespiti i�in kombine disk y�ntemi kullanıldı7. Suşlar DNA izolasyonu yapılıncaya kadar %15 gliserol (Riedel-de Ha�n AG, Almanya) i�eren triptik soy buyyon besiyerinde (Biolife, İtalya) -80�C'de saklandı.

PMQR genlerinin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) y�ntemiyle araştırılması i�in, izolatlardan kaynatma y�ntemiyle n�kleik asit izolasyonu yapıldı ve alikotlanarak kullanılıncaya kadar -80�C'de saklandı. Negatif kontrol olarak E.coli ATCC25922 ve K.pneumonia ATCC13883 suşları kullanıldı. �oban ve arkadaşlarının14 P. Nordmann'dan sağladığı qnrA (E.coli ref: 20), qnrB (K.pneumoniae ref: 15), qnrS (E.cloacae ref: 287) pozitif suşlar ve M. Wang'dan sağladığı qnrC pozitif plazmid (pHS11) pozitif kontrol olarak kullanıldı. qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, qnrS, qepA ve aac(6')-Ib genleri i�in birer; oqxAB dışa-atım pompa genleri i�in ise iki �ift primer kullanıldı15,16,17,18,19,20 (Tablo I).


Tablo I

Her gen amplifikasyonu i�in tekli PCR işlemi uygulandı. �alışılan t�m gen b�lgeleri i�in aynı karışım hazırlama protokol� ve termal d�ng� cihazı programı kullanıldı. T�m diren� gen amplifikasyonlarında reaksiyon karışımı standart olarak 50 �l'lik hacmin i�inde; 0.2 �M her bir primer, 0.2 mM her bir dNTP, 1.5 mM MgCl2, 1 U taq polimeraz enzimi ve 2 �l hedef DNA olacak şekilde hazırlandı. Reaksiyon t�p� otomatik termal d�ng� cihazına (Applied Biosystems� GeneAmp� PCR System 9700, ABD) yerleştirildi. Termal d�ng� cihaz ayarları Robicsek ve arkadaşları15 tarafından uygulanan protokol esas alınarak bantların net olması ve ekstra bant oluşmaması bağlamında modifiye edildi. Reaksiyonun sıcaklık ve zaman ayarları; 94�C'de 5 dk başlangı� denat�rasyonu sonrası, her d�ng� i�in 94�C'de 60 sn denat�rasyon, 55�C'de 60 sn primer birleşmesi, 72�C'de 60 sn polimerizasyon aşamalarını i�eren 30 d�ng� ve sonrasında 72�C'de 10 dk son uzama s�resi olarak d�zenlendi15. PCR �r�nlerinin varlığı %2'lik agaroz jel elektroforezini takiben ultraviyole il�minat�rde g�zlemlendi. Karar verilirken, 100 baz �ifti (b�) adımlı DNA belirteci (GelPilot 100 bp Ladder, Qiagen, Almanya) ve pozitif kontroller ile uyumları karşılaştırıldı. Kinolon direnci ile ilişkili aminoglikozid asetil transferaz geni aac(6')-Ib-cr'nin diğer aac(6')-Ib genlerinden ayırımı PCR sonrası restriksiyon par�a uzunluğu polimorfizmi (PCR-RFLP) y�ntemi ile yapıldı. Bunun i�in aac(6')-Ib pozitif �ıkan PCR �r�nleri (482 b�), 55�C'de 4 saat BseGI (Thermo Scientific, Litvanya) enzim kesimine tabi tutuldu. Kesim işlemi sonunda %2'lik agaroz jel elektroforezinde 206 ve 276 bazlık iki bant g�r�lmeyen (enzim kesim b�lgesi olmayan) �r�nler olarak cr varyantı olarak kaydedildi21. Her izolat i�in yukarıda belirtilen işlemler en az iki defa tekrarlanarak PMQR PCR pozitiflikleri doğrulandı.

PCR pozitif olarak belirlenen �r�nlerin i�eriklerini doğrulamak amacıyla aynı primerler kullanılarak dizileme yapıldı. Elde edilen DNA dizileri daha �nce tanımlanmış dizi verileriyle BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) programında araştırıldı, karşılaştırıldı ve doğrulandı (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?).

BULGULAR

�alışmaya dahil edilen 187 hastaya ait 193 E.coli ve Klebsiella izolatından, nalidiksik asit ve/veya siprofloksasin direnci tespit edilen 81 hastaya ait 85 izolatta (%44) PMQR genlerinin varlığı araştırılmıştır. Bu izolatların 72'si (%84.7) E.coli, 13'� (%15.3) Klebsiella spp. (11 K.pneumonia, 2 K.oxytoca) olarak tanımlanmıştır. İzolatların 13'� (%15.3) yoğun bakım, 42'si (%49.4) erişkin dahili b�l�m, 12'si (%14.1) cerrahi b�l�m ve 3'� (%3.5) pediatri servislerinde; 15'i (%17.6) ise acil polikliniklerinde takip edilen hastalardan izole edilmiştir. Erişkin dahili b�l�m servislerinden gelen �rneklerden �retilen 42 izolatın 22'sinin (toplam izolatların %25.9'u) kemik iliği transplant alıcılarına ait olduğu belirlenmiştir.

İzolatların t�m� (n= 193) dikkate alındığında, kinolon direnci E.coli (n= 72, %56.7) izolatlarında Klebsiella spp. (n= 13, %19.7) izolatlarına g�re daha y�ksek bulunmuştur (Tablo II). Kinolon direncinin, genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL) �reten izolatlarda (50/80, %62.5), GSBL negatiflere (35/113, %30.9) oranla daha y�ksek olduğu saptanmıştır.


Tablo II

Fenotipik olarak kinolon direncine sahip 85 izolatın 47'sinde (%55.3) plazmidle aktarılabilme potansiyeli olan en az bir diren� genine rastlanmış; qnrC ve qnrD genleri ise saptanmamıştır (Tablo III). aac(6')-Ib geni 30 E.coli ve 12 Klebsiella spp. suşunda pozitif bulunmuş ve PCR-RFLP sonucu 2 E.coli izolatı haricindekilerin cr varyantı olduğu tespit edilmiştir (Tablo III).


Tablo III

PMQR genlerinden birinin bulunması, izolata karşı kinolonların MİK değerinin y�kselmesine neden olurken, birden fazlasının birikimi fenotipik diren�li suş olarak saptanmasına yol a�an etkenlerden biridir. Bu nedenle �nemsenen, �alışmamızda araştırılan diren� genlerinin izolatlarda birlikte bulunma durumlarına ait veriler Tablo IV'de sunulmuştur. E.coli suşlarında sadece qnrB ve aac(6')-Ib-cr birlikteliği g�r�l�rken, Klebsiella suşlarında diğer genlerin de birlikte olabildikleri saptanmıştır (Tablo IV).


Tablo IV

TARTIŞMA

E.coli ve Klebsiella t�rleri sepsisin en sık saptanan etkenlerinden olup, imm�n sistemi baskılanmış hasta sayısının artışı bu fırsat�ı patojenlerin enfeksiyonlara katkısını artırmaktadır1,2. Bu nedenle sepsis etkeni E.coli ve Klebsiella suşları, imm�n s�presif hastaların takip edildiği dahili b�l�m servislerinden g�nderilen kan k�lt�rlerinden daha sık izole edilmektedir22,23. �alışmamızın verileri de (%49.4) bu durumu desteklemektedir. Bu durum, doğal veya terap�tik ama�lı imm�n s�presif hasta artışının (AIDS hastaları ve transplantasyon hastalarındaki artışın sonucu olarak), �lkemizde de E.coli ve Klebsiella spp. enfeksiyonlarında artış olarak karşımıza �ıkacağını d�ş�nd�rmektedir. Buna paralel olarak tedavi se�eneklerinin de korunmuş olması �nemlidir. E.coli ve Klebsiella spp. enfeksiyonlarının, tedavi se�eneklerinden olan kinolonlara karşı direncinin belirlenmesi ve horizontal yayılımının takibi, kontrolleri a�ısından �nem arz etmektedir. Yapılan �alışmalarda, GSBL pozitif suşlarda fenotipik kinolon direncinin GSBL negatiflere g�re daha y�ksek olduğu rapor edilmiştir5,8,24. �alışmamıza ait bulgular da (%62.5'e karşı %30.9), b�lgemiz izolatlarının benzer nitelikte olduğunu g�stermektedir (Tablo II).

�lkemizde plazmid aracılı kinolon diren� genlerinden qnrA, qnrB, qnrS ve aaa(b)-1b-cr varlığı, ilk kez 2005 yılında Nazik ve arkadaşları25 tarafından g�sterilmiştir. Sonrasında yapılan �eşitli �alışmalarda, qnrA, qnrB ve qnrS genlerinin varlığı hakkında bilgiler artmaya başlamış, �evresel �rneklerde de bu genlerin varlıkları g�sterilmiştir26,27,28,29. �alışmamızda, fenotipik olarak kinolona diren�li izolatlarda, bug�ne kadar plazmid aracılığı ile kodlandığı ve aktarılabildiği g�sterilen genler araştırılmış, qnrC ve qnrD dışındakiler saptanmıştır (Tablo III). qnr gen pozitifliği %18.8 gibi y�ksek prevalansta bulunmuştur. �ktem ve arkadaşları27 bu oranı %5.4 olarak belirlemiştir. Verilerimiz, yapılan HİTİT-1 ve HİTİT-2 s�rveyans �alışmalarında30-33 belirlenen qnr prevalansından (sırasıyla, %6.4 ve %14.5) daha y�ksek olup, b�lgemizde qnr genlerinin kinolon direncine katkısının azımsanmayacak d�zeyde olduğunu g�stermektedir.

Aktepe ve arkadaşları21, kinolona diren�li 112 E.coli suşunun hi�birinde qnrA, qnrB, qnrS, qnrC ve qepA geni saptamazken, aac(6')-1b gen varlığını %59.8 oranında bulmuşlar ve tamamının aac(6')-1b-cr varyantı olduğunu g�stermişlerdir. �lkemizdeki HİTİT-1 s�rveyans �alışmasında aac(6')-Ib-cr geninin varlığının %32.4; HİTİT-2 �alışmasında ise %69.5 oranında y�ksek olduğu bulunmuştur30,31,32,33. Poirel ve arkadaşları34 T�rkiye'de farklı hastanelerde kandan izole edilen GSBL oluşturan E.coli ve K.pneumoniae suşlarında qnrA, qnrB, qnrS, aac(6')-Ib-cr genlerinin sıklığını araştırmışlar ve aac(6')-Ib-cr geninin GSBL oluşturan 50 izolatın 39'unda (%78) bulunduğunu g�stermişlerdir. �alışmamızda da aac(6')-Ib-cr geninin prevalansı diğer PMQR genlerinden daha sık olmak �zere %47.1 olarak bulunmuştur. Bu veri, aac(6')-Ib-cr'nin aktarılabilir kinolon direncine en sık katkı sağlayan gen olduğu fikrini desteklemektedir.

Yeni keşfedilen PMQR pompası QepA'nın �lkemizdeki varlığı hakkında daha az bilgi mevcuttur. HİTİT-1 s�rveyans �alışmasında qepA geni bulunmamasına karşın, HİTİT-2'de �lkemizde iki E.coli izolatında qepA varlığı ilk kez rapor edilmiştir31,32,33. Nazik ve arkadaşları35, GSBL pozitif 61 adet �riner E.coli izolatını incelemişler ve qepA gen prevalansını %3.3 olarak bildirmişlerdir. Limoncu ve arkadaşları36 nalidiksik asit ve/veya siprofloksasine diren�li 106 E.coli izolatında qepA gen oranını %0.9 olarak tespit etmişlerdir. �alışmamızda benzer şekilde bir E.coli izolatında (%1.2) qepA genine rastlanmıştır.

�oklu ila� dışa-atım pompası olan OqxAB'nin, ilk kez 2009 yılında G�ney Kore'de klinik E.coli izolatında plazmid aracılı kodlandığı g�sterilmiştir37. Kim ve arkadaşları37 461 Enterobacteriaceae �yesinde oqxAB genlerini araştırmış ve bir (%0.4) E.coli izolatında plazmidik oqxAB genini saptamışlardır. Kromozomal oqxAB geni ise E.cloacae i�in %4.6 ve K.pneumoniae i�in %74.1 oranında tespit edilmiş; oqxAB genlerinin, K.pneumoniae'da daha �ok kromozomal olduğu ifade edilmiştir37. İspanya'da GSBL pozitif K.pneumoniae izolatlarında yapılan hibridizasyon deneyleri, oqxA'nın %16 ve oqxB'nin %13 oranında kromozom �zerinde ve b�y�k plazmidler �zerinde aynı anda mevcut olduğunu g�stermiştir38. Bu araştırıcılar, kromozomal ve/veya plazmidik oqxA ve oqxB prevalansının ise toplamda sırasıyla %76 ve %75 olduğunu belirtmişlerdir38. �alışmamızda, kinolon direncine neden olduğu bilinen oqxAB gen prevalansı, �lkemizde klinik �rneklerde ilk kez araştırılmış ve kinolona diren�li E.coli izolatlarının %1.4'�nde (1/72), Klebsiella spp. izolatlarının ise %84.6'sında (11/13) olmak �zere, toplam izolatların %14.1'inde (12/85) pozitif olarak bulunmuştur. Kim ve arkadaşlarının37 bulguları g�z �n�ne alındığında, E.coli izolatının muhtemelen plazmid aracılı, Klebsiella spp. izolatlarının ise muhtemelen kromozomal k�kenli oqxAB geni taşıdığı d�ş�n�lm�şt�r. E.coli izolatındaki oqxAB geninin olası plazmidik konumunun doğrulanması, horizontal yayılımı a�ısından �lkemize ait �nemli bir bulgu olacaktır.

PMQR proteinleri, tek başına nalidiksik asit direncine ve norfloksasin, siprofloksasin, levofloksasin gibi florokinolonların duyarlılığında azalmaya neden olmasına rağmen, kromozomal mutasyonların ve diren� genlerinin birlikteliği ile y�ksek d�zey kinolon direncine yol a�abilmektedir5,6,8,10. Literat�rde PMQR genlerinin birlikte olma prevalansları ile ilgili veri olduk�a sınırlıdır. Nazik ve arkadaşları35, aac(6')-1b-cr pozitif E.coli izolatlarında qnrA, qnrS ve qepA birlikteliğini rapor etmiştir. �alışmamızda da, qnr genlerinin birlikteliği saptanmazken; E.coli izolatlarında qnrB ve aac(6')-Ib'nin birlikte olabileceği g�r�lm�ş; ayrıca Klebsiella izolatlarında, yanına oqxAB'nin dahil olduğu ikili ve ��l� gen pozitiflikleri belirlenmiştir (Tablo IV).

Sonu� olarak bu �alışmada, kinolona diren�li E.coli ve Klebsiella spp. kan izolatlarında, aktarılabilir genlerin dirence katkısı araştırılmış ve diren� genlerinin prevalansı, bu bakteriler i�in sırasıyla; qnrA, %1.4 ve %15.4; qnrB, %4.2 ve %61.5; qnrS, %1.4 ve %7.7; qepA, %1.4 (sadece E.coli); aac(6')-1b-cr, %38.9 ve %92.3; oqxAB, %1.4 ve %84.6 olarak belirlenmiştir. Kinolona diren�li Klebsiella spp. izolatlarında E.coli'ye g�re hem diren� genlerinin oranları hem de diren� genlerinin birlikte olma olasılığı daha y�ksek bulunmuştur. Bu �alışma ile �lkemizde ilk defa klinik �rneklerde prevalansları sorgulanan genlerden qnrD geni saptanamazken, oqxAB genlerinin sıklıklarına ait ilk veriler sunulmuştur. Bununla birlikte, saptanan oqxAB genlerinin PMQR olarak sınıflandırılabilmeleri i�in bakteri kromozomu veya plazmid �zerindeki varlıkları konjugasyon veya hibridizasyon y�ntemleri ile belirlenmelidir. �alışma, genel bağlamda benzer �alışmalar ile karşılaştırıldığında, kinolon direncine katkı sağlayan aktarılabilir diren� genlerinden aac(6')-1b-cr'nin durağan g�r�n�m�ne karşın qnr tiplerinin artış trendinde olduğunu g�stermektedir.

KAYNAKLAR

  1. Mu�oz P, Cruz AF, Rodr�guez-Cr�ixems M, Bouza E. Gram-negative bloodstream infections. Int J Antimicrob Agents 2008; 32 (Suppl 1): S10-4.
  2. Huh K, Kim J, Cho SY, et al. Continuous increase of the antimicrobial resistance among gram-negative pathogens causing bacteremia: a nationwide surveillance study by the Korean Network for Study on Infectious Diseases (KONSID). Diagn Microbiol Infect Dis 2013; 76(4): 477-82.
  3. Hooper DC, Strahilevitz J. Quinolones, pp: 487-510. In: Mandell GL, Bennett, Dolin R (eds), Principles and Practice of Infectious Diseases. 2010, 7th ed. Churchill Livingstone, Philadelphia.
  4. Aldred KJ, Kerns RJ, Osheroff N. Mechanism of quinolone action and resistance. Biochemistry 2014; 53(10): 1565-74.
  5. Rodr�guez-Mart�nez JM, Cano ME, Velasco C, Mart�nez-Mart�nez L, Pascual A. Plasmid-mediated quinolone resistance: an update. J Infect Chemother 2011; 17(2): 149-82.
  6. Nazik H, �ngen B. T�rkiye'de plazmit aracılı kinolon direnci. ANKEM Derg 2010; 24(1): 46-54.
  7. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Twenty-Third Informational Supplement, M100-S23, 2013. CLSI, Wayne, PA.
  8. Strahilevitz J, Jacoby GA, Hooper DC, Robicsek A. Plasmid-mediated quinolone resistance: a multifaceted threat. Clin Microbiol Rev 2009; 22(4): 664-89.
  9. Jacoby GA. Mechanisms of resistance to quinolones. Clin Infect Dis 2005; 41(2): 120-6.
  10. Briales A, Rodr�guez-Mart�nez JM, Velasco C, et al. Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants qnr and aac(6')-Ib-cr in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae producing extended-spectrum -lactamases in Spain. Int J Antimicrob Agents 2012; 39(5): 431-4.
  11. Asmundsd�ttir LR, Erlendsd�ttir H, G�slad�ttir AL, Gottfredsson M. Molecular epidemiology of late recurrent candidaemia: a population-based study in Iceland. Clin Microbiol Infect 2012; 18(2): 195-201.
  12. Şenses Z. Bakteriyolojik �rneklerin toplanması, taşınması ve işleme alınması, s. 291-333. Başustaoğlu A, Kubar A, Yıldıran ŞT, Tany�ksel M (�ev.ed.), Klinik Mikrobiyoloji (Manual of Clinical Microbiology). 2009, 9. Baskı. Atlas Kitap�ılık, Ankara.
  13. Nolte FS, Williams JM, Jerris RC, et al. Multicenter clinical evaluation of a continuous monitoring blood culture system using fluorescent-sensor technology (BACTEC 9240). J Clin Microbiol 1993; 31(3): 552-7.
  14. �oban AY, Nohut OK, Tanrıverdi �aycı Y, et al. Investigation of plasmid-mediated quinolone resistance determinants in Enterobacteriaceae: a multicenter study. Mikrobiyol Bul 2012; 46(3): 366-74.
  15. Robicsek A, Strahilevitz J, Sahm DF, Jacoby GA, Hooper DC. qnr prevalence in ceftazidime-resistant Enterobacteriaceae isolates from the United States. Antimicrob Agents Chemother 2006; 50(8): 2872-4.
  16. Kim HB, Park CH, Kim CJ, Kim EC, Jacoby GA, Hooper DC. Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants over a 9-year period. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53(2): 639-45.
  17. Cavaco LM, Hasman H, Xia S, Aarestrup FM. qnrD, a novel gene conferring transferable quinolone resistance in Salmonella enterica serovar Kentucky and Bovismorbificans strains of human origin. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53(2): 603-8.
  18. Yamane K, Wachino J, Suzuki S, Arakawa Y. Plasmid-mediated qepA gene among Escherichia coli clinical isolates from Japan. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52(4): 1564-6.
  19. Park CH, Robicsek A, Jacoby GA, Sahm D, Hooper DC. Prevalence in the United States of aac(6')Ib-cr encoding a ciprofloxacin-modifying enzyme. Antimicrob Agents Chemother 2006; 50(11): 3953-5.
  20. Liu BT, Wang XM, Liao XP, et al. Plasmid-mediated quinolone resistance determinants oqxAB and aac(6')-Ib-cr and extended-spectrum -lactamase gene blaCTX-M-24 co-located on the same plasmid in one Escherichia coli strain from China. J Antimicrob Chemother 2011; 66(7): 1638-58.
  21. Aktepe OC, Aşık G, Cetinkol Y, Bi�men M, G�lay Z. Investigation of plasmid-mediated quinolone resistance in Escherichia coli strains. Mikrobiyol Bul 2012; 46(1): 9-16.
  22. Wisplinghoff H, Bischoff T, Tallent SM, Seifert H, Wenzel RP, Edmond MB. Nosocomial bloodstream infections in US Hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis 2004; 39(3): 309-17.
  23. Lautenbach E, Fishman NO, Bilker WB, et al. Risk factors for fluoroquinolone resistance in nosocomial Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae infections. Arch Intern Med 2002; 162(21): 2469-77.
  24. St�renburg E, Mack D. Extended-spectrum beta-lactamases: implications for the clinical microbiology laboratory, therapy, and infection control. J Infect 2003; 47(4): 273-95.
  25. Nazik H, Poirel L, Nordmann P. Further identification of plasmid-mediated quinolone resistance determinant in Enterobacteriaceae in Turkey. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49(5): 2146-7.
  26. Avsaroglu MD, Helmuth R, Junker E, et al. Plasmid-mediated quinolone resistance conferred by qnrS1 in Salmonella enterica serovar Virchow isolated from Turkish food of avian origin. J Antimicrob Chemother 2007; 60(5): 1146-50.
  27. �ktem IMA, Bi�men M, G�lay Z. Kan k�lt�rlerinden soyutlanan Enterobacteriaceae izolatlarında plazmit ile ilişkili kinolon direnci genlerinin saptanması. 8. Antimikrobik ve Kemoterapi G�nleri, 2-4 Nisan 2008, İstanbul. Program ve �zet Kitabı, s: 28, P57.
  28. Ozgumus OB, Sandalli C, Sevim A, Celik-Sevim E, Sivri N. Class 1 and class 2 integrons and plasmid-mediated antibiotic resistance in coliforms isolated from ten rivers in Northern Turkey. J Microbiol 2009; 47(1): 19-27.
  29. Onuk EE, Tanrıverdi �aycı Y, �oban AY, et al. Detection of the first qnrS gene positivity in aquatic Aeromonas spp. isolates in Turkey. Mikrobiyol Bul 2015; 49(1): 114-23.
  30. Gulay Z, Bicmen M, Gur D. Prevalence and diversity of plasmid-mediated quinolone resistance genes in extended-spectrum beta-lactamase positive Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae: first report of qepA from Turkey. Clin Microbiol Infect 2010; 16 (Issue Supplement s2): S193, P763.
  31. G�lay Z. Enterobacteriaceae �yelerinde diren� epidemiyolojisi. Antimikrobik Kemoterapi Laboratuvar Uygulamaları ve Yenilikler. G�lhane Mikrobiyoloji G�nleri, 20-22 Nisan 2010, İstanbul. http://www.tmc-online.org/userfiles/file/gulhane_gunleri_sunumlar/Zeynep_Gulay.pdf
  32. Oktem IM, Gulay Z, Bicmen M, Gur D; HITIT Project Study Group. qnrA prevalence in extended-spectrum beta-lactamase-positive Enterobacteriaceae isolates from Turkey. Jpn J Infect Dis 2008; 61(1): 13-7.
  33. Gur D, Hascelik G, Aydin N, et al. Antimicrobial resistance in gram-negative hospital isolates: results of the Turkish HITIT-2 Surveillance Study of 2007. J Chemother 2009; 21(4): 383-9.
  34. Poirel L, G�r D, Minarini L, Arslan U, Nordmann P. Molecular epidemiology of plasmid-mediated quinolone resistance determinants in extended spectrum beta-lactamase producing E.coli and K.pneumoniae isolates from Turkey. 18th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 19-22 April 2008, Barcelona. Abstract Book, p. 1527.
  35. Nazik H, Bekt�re B, �ngen B, et al. Plasmid-mediated quinolone resistance genes in Escherichia coli urinary isolates from two teaching hospitals in Turkey: coexistence of TEM, SHV, CTX-M and VEB-1 type -lactamases. Trop J Pharm Res 2011; 10(3): 325-33.
  36. Hoşg�r-Limoncu M, Era� B, Yurtman AN, Aydemir S. Plasmid-mediated quinolone resistance mechanisms in ESBL positive Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae strains at a tertiary-care hospital in Turkey. J Chemother 2012; 24(3): 144-9.
  37. Kim HB, Wang M, Park CH, Kim EC, Jacoby GA, Hooper DC. OqxAB encoding a multidrug efflux pump in human clinical isolates of Enterobacteriaceae. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53(8): 3582-4.
  38. Rodr�guez-Mart�nez JM, D�az de Alba P, Briales A, et al. Contribution of OqxAB efflux pumps to quinolone resistance in extended-spectrum--lactamase-producing Klebsiella pneumoniae. J Antimicrob Chemother 2013; 68(1): 68-73.

İletişim (Correspondence):

Do�. Dr. Celal Kurtuluş Buruk,

Karadeniz Teknik �niversitesi Tıp Fak�ltesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

61080, Trabzon, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 462 377 5124,

E-posta (E-mail): kburuk@ktu.edu.tr

Yazdır