Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2016; 50(2): 205-214

Staphylococcus aureus'un Makrofajlar Tarafından Fagositozu �zerine Sigara Dumanı Ekstraktının Etkisi

Effect of Cigarette Smoke Extract on Phagocytosis of Staphylococcus aureus by Macrophages

Sibel AK1, Serdar Abidin G�RSES2, Bekir Engin ESER3

1 Zirve �niversitesi EBN Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Gaziantep.

1 Zirve University EBN School of Medicine, Department of Medical Microbiology, Gaziantep, Turkey.

2 Zirve �niversitesi EBN Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, Gaziantep.

2 Zirve University EBN School of Medicine, Department of Medical Biology, Gaziantep, Turkey.

3 Zirve �niversitesi EBN Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı, Gaziantep.

3 Zirve University EBN School of Medicine, Department of Medical Biochemistry, Gaziantep, Turkey.

�Z

Staphylococcus aureus, t�m d�nyada toplum ve hastane kaynaklı enfeksiyonlara neden olan �nemli patojenlerden biridir. S.aureus'a bağlı enfeksiyonlara karşı ilk basamak savunmada makrofajlar tarafından fagositozu �nemli rol oynamaktadır. Bununla birlikte yapılan �alışmalarda, sigara dumanının hem doğal hem de kazanılmış imm�n yanıt �zerine olumsuz etkileri olduğu belirlenmiştir. Bu �alışmanın amacı, sigara dumanı ekstraktının, makrofajların canlılığı ve S.aureus'u fagosite etme yeteneği �zerindeki etkisinin incelenmesidir. �alışmada, THP-1 h�cre dizisi (insan l�semik monosit h�cre k�lt�r�) kullanılmış ve h�creler PMA (phorbol myristate acetate) ile makrofajlara d�n�şt�r�ld�kten sonra, sigara dumanı ekstraktı (SDE)'nın %1, %5, %10, %25 ve %50 konsantrasyonlarına 2 ve 4 saat s�reyle maruz bırakılmıştır. Daha sonra propidium iyod�r ile boyanan h�crelerin canlılıkları akım sitometri cihazı ile incelenmiştir. SDE'nin S.aureus fagositozuna etkisini incelemek i�in ise iki farklı y�ntem kullanılmıştır. Bunlardan birincisi olan klasik bakteriyolojik y�ntemde; makrofajlar 2 saat s�reyle beş farklı konsantrasyonda SDE'ye maruz bırakıldıktan sonra 100 MOI (multiplicity of infection) S.aureus ile enfekte edilmiştir. Bir saat ink�basyondan sonra makrofajlar PBS-%0.1 Triton X-100 ile patlatılıp seri dil�syon yapılarak Luria-Bertani (LB) agara ekilmiş ve ertesi g�n koloni oluşturan birimler (CFU) sayılarak fagosite edilen bakteri sayısı belirlenmiştir. Fagositozun tespitinde kullanılan ikinci y�ntemde, SYBR� Green ile işaretli bakteriler kullanılarak akım sitometrisi ile analiz yapılmıştır. Bu y�ntemde �ncelikle, makrofajların enfekte olduklarını kontrol etmek i�in bakteriler SYBR� Green ile boyanmış ve enfeksiyon sonrası makrofajlar akım sitometri y�ntemiyle incelenmiştir. SDE'nin fagositoza etkisini tespit etmek i�in, makrofajlar %10 ve %50 SDE'ye maruz bırakıldıktan sonra SYBR� Green ile işaretli bakterilerle enfekte edilip, h�cre i�ine alınan bakteriler akım sitometri y�ntemiyle medyan floresan yoğunluk �l��lerek analiz edilmiştir. Y�zde 25 ve %50 SDE konsantrasyonlarında 2 saatlik maruziyet sonrası makrofaj h�cre �l�m� oranı sırasıyla, %24 ve %30 iken, 4 saatlik maruziyet sonrası sırasıyla %38 ve %51 d�zeyine �ıktığı g�zlenmiştir (p< 0.001). Y�zde 10 ve �zeri SDE konsantrasyonlarında 2 ve 4 saatlik maruziyetlerde h�cre �l�m�nde ortalama 1.5 kat artış saptanmıştır (p< 0.05). SYBR� Green ile işaretli S.aureus'un kullanıldığı enfeksiyonlarda h�crelerin %99.8'inin enfekte edildiği g�sterilmiştir. S.aureus'un makrofajlar tarafından fagositozunun %10 ve �zeri SDE konsantrasyonlarında azaldığı tespit edilmiştir (p< 0.0001). SYBR� Green ile işaretli S.aureus ile enfekte makrofajlarda SDE'nin %10 ve %50 olduğu durumlarda, fagosite edilen bakteri sayısını ifade eden h�cre i�indeki medyan floresan sinyalin, istatistiksel olarak anlamlı olmamakla birlikte azaldığı izlenmiştir. Sonu� olarak bulgularımız, SDE'nin makrofajlarda, konsantrasyona ve s�reye bağımlı olarak h�cre canlılığını ve S.aureus fagositozunu azalttığını ortaya koymuştur. Ayrıca, fagosite edilen bakterilerin akım sitometri y�ntemiyle analizinde, bakterilerin boyanması amacıyla SYBR� Green boyasının başarıyla kullanılabileceği kanısına varılmıştır.

Anahtar s�zc�kler: Staphylococcus aureus; makrofaj; fagositoz; sigara dumanı; akım sitometri y�ntemi; SYBR� Green.

ABSTRACT

Staphylococcus aureus is one of the most important pathogen that causes community acquired and nosocomial infections worldwide. Phagocytosis by macrophages plays an important role in the first line defense against infections caused by S.aureus. On the other hand, the conducted studies have indicated that cigarette smoke has negative effects on both innate and acquired immune responses. The aim of this study was to investigate the effects of cigarette smoke on macrophage viability and their capacity of S.aureus phagocytosis. For this purpose THP-1 cell lines (human leukemic monocyte cell culture) were used and after the differentiation of the cells with PMA (phorbol myristate acetate) treatment, the macrophages were exposed to cigarette smoke extract (CSE) for 2- and 4-hours at concentrations of 1%, 5%, 10%, 25%, and 50%. Afterwards, the cells were stained with propidium iodide and the viability of the cells was analyzed by a flow cytometer. Two different methods were used to investigate the effect of CSE on the phagocytosis of S.aureus. The first one was the classical bacteriological method, in which macrophages were exposed to CSE for 2 hours in five different concentrations and were infected with 100 MOI (multiplicity of infection) S.aureus. After 1 hour of incubation, macrophages were lysed with PBS-0.1% Triton X-100 and plated on Luria-Bertani (LB) agar following serial dilutions. Newly formed colonies were counted and the number of bacteria phagocytosed were evaluated as colony forming units (CFU). The second method for the detection of phagocytosis was flow cytometric analysis in which SYBR� Green-labeled bacteria were used. To confirm that the macrophages were infected, bacteria were stained with SYBR� Green and macrophages were analyzed following infection via flow cytometry. Macrophages were exposed to 10% and 50% CSE and infected with bacteria stained with SYBR� Green. The level of phagocytosis was analyzed by flow cytometry in terms of median fluorescence intensity. Macrophage death rate was 24% and 30% following 2-hour exposure to 25% and 50% CSE, respectively, while 4-hour exposure increased death rate to 38% and 51%, respectively (p< 0.001). At 10% and higher concentrations of CSE, cell death increased with an average of 1.5-fold between 2- and 4-hour exposures (p< 0.05). Macrophages were successfully infected (99.8%) with SYBR� Green-stained S.aureus. Phagocytosis of S.aureus by macrophages decreased significantly upon exposure to 10% or more CSE concentrations (p< 0.0001). Median fluorescence intensity, which indicates phagocytosed bacterial cell number, decreased with no statistical significance when macrophages exposed to 10% and 50% CSE were infected with SYBR� Green-stained S.aureus. The results of this study revealed that, macrophage viability and phagocytosis of S.aureus were reduced depending on CSE concentration and time of exposure. In addition, it was shown that, SYBR� Green dye is a proper stain for the flow cytometric analysis of bacteria that were phagocytosed by macrophages.

Keywords: Staphylococcus aureus; macrophage; phagocytosis; cigarette smoke; flow cytometry; SYBR� Green.

Geliş Tarihi (Received): 11.03.2016 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 09.04.2016

GİRİŞ

Staphylococcus aureus, toplum ve hastane kaynaklı pn�moni, yumuşak doku enfeksiyonları, osteomiyelit ve bakteriyemi gibi geniş yelpazede enfeksiyonlara neden olan yaygın gram-pozitif bakterilerden biridir1. S.aureus'a bağlı hastalıklara karşı doğal bağışıklığın ilk basamağında profesyonel fagositik h�crelerden olan makrofajlar etkin role sahiptirler2.

Sigara i�enlerin i�meyenlere g�re �eşitli bakteriyel enfeksiyonlara �nemli oranda daha fazla yatkın oldukları bilinmektedir3. Aktif i�icilerin yanı sıra, sigara dumanına maruz kalan pasif i�icilerde de imm�n sistem fonksiyonlarının etkilenmesi nedeniyle enfeksiyon hastalıklarına yakalanma riskinin y�ksek olduğunu g�steren �alışmalar mevcuttur4,5. Yapılan �alışmalarda sigaranın hem doğal hem de kazanılmış bağışıklık �zerine etkileri olduğu belirlenmiştir. H�moral imm�nitenin esasını oluşturan imm�noglobulin d�zeylerinin, sigara i�en kişilerde i�meyenlere oranla daha d�ş�k olduğu tespit edilmiştir6,7. Sigaranın, doğal �ld�r�c� h�creleri azalttığı, t�m�r nekrozis fakt�r, interl�kin (IL)-1 ve IL-8 gibi pro-inflamatuar sitokin ekspresyonunu �nlediği ve makrofaj i�erisinde nitrik oksit sentezini azalttığı tespit edilmiştir8,9,10. Buna karşın sigara dumanının, makrofaj h�cre k�lt�r�nde S.aureus fagositozu �zerine etkisi ile ilgili �alışmalar sınırlıdır. Bu �alışmada, stafilokok enfeksiyonlarına karşı imm�n yanıtın temel elemanlarından olan makrofajların fagositozu �zerine, sigara dumanının etkisinin incelenmesi ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

H�cre Hattı ve Bakteri Hazırlanması

Deneylerde h�cre k�lt�r� olarak THP-1 (insan l�semik monosit h�cre k�lt�r�) ATCC� TIB-202TM kullanıldı. Monosit h�crelerinin �oğaltılması ve makrofaj h�crelerine d�n�ş�m� i�in Dao ve arkadaşlarının11 uyguladıkları y�ntem kullanıldı.� H�creler, %10 fetal dana serumu (FCS) (Gibco�), 100 μg/ml penisilin-streptomisin (Gibco�) ve %1 sodyum piruvat eklenmiş RPMI 1640 (Gibco�) besiyerinde �oğaltıldı. THP-1 h�crelerini makrofaja d�n�şt�rmek i�in 6x105/ml h�cre 20 ng/ml PMA (Phorbol myristate acetate) ile birlikte 24 kuyucuklu plaklara ekilerek 20 saat 37�C'de ink�be edildikten sonra deneylerde kullanıldı.�

Makrofaj h�crelerinin enfeksiyonunda S.aureus ATCC 25923 kullanıldı. S.aureus suşu daha �nce kullanılmış olan metotta k���k değişiklikler yapılarak hazırlandı12. Kısaca, tek koloni bakteri bir gece �ncesinden Luria-Bertani (LB) buyyonda sallayıcı ink�bat�rde 18 saat s�resince 37�C'de ink�be edildi. Ertesi g�n bakteriler tekrar pasajlanarak optik dansitesi 600 nm (OD600) de �l��ld�. OD 1 değerindeki bakteri sayısı, seri dil�syonlar sonucu plaklara ekilip ertesi g�n sayılarak 1.8 x 109 �bakteri olarak hesaplandı.

Sigara Dumanı Ekstraktı (SDE) Hazırlanması

Sigara dumanı ekstraktı, 9 mg zifir, 0.7 mg nikotin, 10 mg karbon monoksit i�eren ticari sigaradan daha �nceden uygulanan metotta k���k modifikasyonlar yapılarak elde edildi13. Kısaca, SDE elde etmek i�in vakumlu pompa yardımı ile bir adet sigaranın dumanı 10 ml RPMI 1640 besiyeri i�erisinde ��z�ld�. Hazırlanan SDE 0.45 μm (EMD MilliporeTM) filtreden ge�irilerek sterilize edildi. Bu konsantrasyon %100 olarak kabul edilerek, elde edildikten sonra 30 dakika i�inde kullanıldı.

Konsantrasyon ve S�re Belirlenmesi

Deneylerde kullanılacak SDE konsantrasyon ve maruziyet s�resinin belirlenmesi i�in bir �n �alışma yapıldı. Bu ama�la, hazırlanan SDE %1, %5, %10, %25, %50, %75 ve %100 konsantrasyonlarda 4 ve 24 saat s�re makrofajlara uygulandı. Bu farklı doz ve s�relerde uygulanan SDE'nin makrofaj canlılığına etkisi propidium iyod�r (PI) kullanılarak akım sitometrisi ile analiz edildi. D�rt ve 24 saat SDE'ye maruz bırakıldığında değerlendirilen t�m konsantrasyonlar i�in 4. ve 24. saatte h�cre �l�m� a�ısından %50 �zeri konsantrasyonlarda %75 �zerinde h�cre �l�m� ger�ekleşmesi nedeniyle sonraki deneylerde %50 ve altındaki konsantrasyonlarda 2 ve 4 saat ink�basyon uygulandı (Tablo I).


Tablo I

Akım Sitometrisi ile H�cre Canlılığı Analizi

�n �alışma sonu�larına dayanarak SDE maruziyet s�resinin 2 ve 4 saat olmasına ve konsantrasyonların� %1, %5, %10 ve %50 olarak uygulanmasına karar verildi. Belirlenen doz ve ink�basyon sonrasında h�creler iki kez PBS ile yıkanarak �zerlerine 5 mM PBS-EDTA'dan 500 μl eklendi. Beş dakika sonra toplanan makrofaj h�crelerinin canlılığının tespiti i�in 0.1 mg/ml PI eklenerek 30 dakika oda ısısında ink�be edildi. İnk�basyonun ardından BD Accuri C6 akım sitometri cihazı (BD Biosciences, ABD) ile FL2 kanalında en az 10.000 h�cre incelendi. Veriler BD Accuri CFlow Software kullanılarak analiz edildi. PI pozitif h�creler �l� h�cre olarak değerlendirildi.

Enfeksiyon Modeli�

H�cre k�lt�r�nde S.aureus enfeksiyon modeli i�in, daha �nceden uygulanmış olan model kısmi modifikasyonlarla uygulandı14. Makrofaj h�creleri %1, %5, %10 ve %50 konsantrasyonlarda SDE'ye 2 ve 4 saat maruz bırakıldı. Daha sonra h�creler iki kez PBS ile yıkanarak %5 insan serumu eklendi. Makrofajların enfeksiyonu i�in 100 MOI (multiplicity of infection) olmak �zere her bir kuyucuğa 6 x 107 koloni oluşturan �nite (CFU) S.aureus eklendi15.

Bakteri Fagositozunun Tespiti

Bu ama�la iki farklı y�ntem kullanıldı.

a. Klasik Bakteriyolojik Y�ntem

S.aureus ile enfekte edilen makrofajlar bir saat 37�C'de ink�be edildikten sonra, h�creler �� kez PBS ile yıkanarak h�cre dışındaki bakteriler elimine edildi. Fagosite edilen bakteri sayısının belirlenmesi i�in PBS-%0.1 Triton X-100 ile makrofajlar patlatıldı. Makrofaj h�creleri i�ine alınan bakteri sayısını CFU olarak belirleyebilmek i�in patlatılan makrofaj h�crelerinin seri dil�syonu yapıldı ve LB agar plaklara ekilerek 37�C'de bir gece ink�be edildi. Ertesi g�n plaklarda koloni oluşturan birimler sayılarak fagosite edilen bakteri miktarı CFU olarak değerlendirildi.

b. Flow sitometri ile fagositoz analizi

Bu ama�la �ncelikle S.aureus 30 dakika 10 μg/ml SYBR� Green boyası ile karanlıkta ink�be edilerek işaretlendi. SYBR� Green boyasının bakteri canlılığına etkisi, boyalı bakterilerin seri dil�syonu sonucu LB agar plaklara ekilerek değerlendirildi. SYBR� Green boyasının bakteri canlılığına etki etmediği belirlendikten sonra, bu bakteriler ile yukarıda bahsedilen enfeksiyon deney d�zeneği kullanılarak makrofajlar enfekte edildi. Makrofaj h�crelerinin fagositoz yetenekleri akım sitometri cihazı kullanılarak alınan floresan sinyali (Medyan floresan yoğunluk; MFI) ile �l��ld�.

İstatistiksel analiz

T�m deneyler birbirinden bağımsız �� ayrı tekrar olarak �alışıldı. Verilerin istatistiksel analizi i�in GraphPad Prism 7 (Graphpad Software, ABD) programı kullanıldı. Deney gruplarının karşılaştırılmasında One-way Anova testi uygulandı. Gruplar arası karşılaştırmada post-hoc test olarak Tukey testi yapıldı. Analiz sonucu p< 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Değerler ortalama � standart hata olarak verildi.

BULGULAR

�alışmamızda, 2 saat SDE maruziyeti sonunda %25 konsantrasyonda kontrole g�re h�cre �l�m�nde artış belirlenmiştir (p< 0.05). Konsantrasyon %50'ye �ıktığında kontrole g�re �l�m oranı daha da artmıştır (p< 0.01). Bu bulgular, SDE'nin makrofaj �l�m�n� uyardığını g�stermektedir (Şekil 1).


Şekil 1

İki saat SDE maruziyetinde 0, %1, %5, %10, %25 ve %50 konsantrasyonlar i�in h�cre �l�m oranları sırasıyla %9, %7.5, %11, %12, %20 ve %34 olarak tespit edilmiştir. H�cre �l�m oranları a�ısından, konsantrasyonlar kendi aralarında karşılaştırıldığında; %25 SDE'de daha d�ş�k konsantrasyonlara g�re anlamlı artış belirlenmiş (%20; p< 0.05); %50 SDE'de ise kendinden d�ş�k konsantrasyonlara g�re artışın daha da belirgin olduğu g�r�lm�şt�r (%34; p< 0.01). D�rt saat SDE maruziyeti sonunda, %10 konsantrasyonda kontrole g�re anlamlı h�cre �l�m� saptanmıştır (p< 0.05). Bu artış %25 ve 50'de daha da belirgin hale gelmiştir (p< 0.01). D�rt saat maruziyette SDE %10, 25 ve 50 konsantrasyonlar kendi aralarında karşılaştırıldığında, kendinden daha d�ş�k konsantrasyonlara g�re anlamlı artış tespit edilmiştir (p< 0.01). Aynı konsantrasyonda 2 ve 4 saatlik SDE maruziyetleri karşılaştırıldığında %10 ve %25 ile %50 konsantrasyonlara maruziyet s�resi arttık�a h�cre �l�m�nde anlamlı artış bulunmuştur (sırasıyla, p< 0.05, p< 0.01).

SDE'nin, h�cre �l�m� olmaksızın h�cresel fonksiyonlar �zerindeki etkisini belirlemek amacıyla ilk olarak yapılan klasik bakteriyolojik y�ntem i�in fagositoz deneyinde uygulanacak SDE s�resi 2 saat olarak belirlenmiştir. Bu y�ntemde fagosite edilen bakteri sayısı CFU olarak değerlendirildiğinde, SDE'ye 2 saat maruz kalan makrofajlarda, fagosite edilen bakteri sayısının doza bağımlı olarak değiştiği tespit edilmiştir. Fagosite edilen bakteri sayısının, kontrol h�crelerinde 6.5 x 107 iken, SDE %10, %25 ve %50'de sırasıyla 1 x 107, 1.5 x 107, 2 x 107 CFU değerlerine d�şt�ğ� g�zlenmiştir (p< 0.05). Bu bulgular, SDE'ye maruz kalan makrofajlarda S.aureus fagositozunun etkilendiğini g�stermektedir (Şekil 2).


Şekil 2

Enfekte edilen makrofajların sayısını tespit edebilmek i�in, SYBR� Green floresan boyalı S.aureus'lar literat�rde ilk defa bu �alışmada makrofajlar tarafından fagositozunda kullanılmıştır. SYBR� Green kullanılmadan S.aureus ile enfekte edilen makrofajlar dışarıda kalacak şekilde floresan ışık şiddetine g�re kapılama (R2) yapılmıştır (Şekil 3a) Daha sonra SYBR� Green ile işaretli S.aureus ile enfekte makrofajlar �l��ld�ğ�nde, makrofajların %99.8'inin kapılanan alan i�erisinde olduğu tespit edilmiştir (Şekil 3b). Bu veriler, SYBR� Green'in, makrofajların S.aureus fagositozunu g�stermede kullanılabileceğini ortaya koymuştur.


Şekil 3

S.aureus fagositozunun tespitinde kullandığımız ikinci y�ntemde, SYBR� Green ile işaretli bakterilerin h�cre i�ine alınmasının akım sitometri y�ntemiyle g�sterilmesinin ardından, SDE'nin S.aureus fagositozuna etkisinin araştırılması i�in makrofajlara %10 ve %50 konsantrasyonlarda SDE, iki saat uygulanmıştır. Makrofajlarda akım sitometrisi ile elde edilen MFI'ların, %10 ve %50 konsantrasyonlarda SDE uygulanan h�crelerde, kontrole oranla sırasıyla %2 ve %49 azaldığı saptanmış (p> 0.05); ayrıca daha az sayıda bakteri fagosite eden makrofaj sayısının arttığı g�zlenmiştir (Şekil 3c).

TARTIŞMA

�alışmamızın verileri, sigara dumanı maruziyetinin, makrofajların canlılığını doz ve s�re ile orantılı olarak azalttığını g�stermiştir. Aynı s�rede, artan dozlarda SDE'ye maruz bırakılan makrofajlarda, h�cre �l�m�n�n anlamlı oranda arttığı tespit edilmiş; benzer şekilde SDE konsantrasyonları sabit tutulup maruziyet s�resi uzatıldığında da makrofaj �l�mlerinin arttığı izlenmiştir. Yapılan �alışmalarda, sigara dumanının, bakteriyel enfeksiyonlarda ilk basamak savunmada rol alan epitel h�cresi, n�trofil ve keratinositler �zerine sitotoksik etkisi olduğu g�sterilmiştir10,16,17. Yang ve arkadaşları18, SDE'nin makrofaj canlılığına etkisini inceledikleri �alışmada, h�cre �l�m�n� tespit etmek i�in h�crelerden salınan LDH seviyesini �l�m�şlerdir. Bu araştırıcılar, LDH seviyesinin, %1 ve %2.5 SDE konsantrasyonlarında 24 saat s�re ile maruziyette değişmediğini, %5 SDE konsantrasyonunda ise anlamlı oranda arttığını bildirmişlerdir. Bizim �n �alışmamızda da, SDE'ye 24 saat maruziyette %1 ve �zeri konsantrasyonlarda h�cre �l�m�nde 2 kattan daha fazla artış, %25 ve �zeri konsantrasyonlarda ise h�crelerin tamamına yakınının �ld�ğ� akım sitometri y�ntemiyle tespit edilmiştir (Tablo I). Bu �n �alışma sonu�larımıza dayanarak, 24 saat ve %50 �zeri konsantrasyonlara maruziyet ile h�crelerin %90'ından fazlasının �lmesi nedeniyle, uzun s�re ve y�ksek konsantrasyonlar devam eden �alışmalarda kullanılmamıştır.

İmm�n yanıtta yer alan h�crelerin sayıca �okluğu kadar fonksiyonel olarak aktif olması da �nemlidir. Sigaranın, imm�n sistem h�crelerine olan sitotoksik etkisinin yanı sıra h�cresel fonksiyonlar �zerine de etkileri vardır. Phipps ve arkadaşları19, fareler �zerinde yaptıkları �alışmada, sigara i�irilen farelerde alveolar makrofaj sayısının i�meyenlere oranla 6 kat arttığı halde pulmoner enfeksiyonlara direncin azaldığını g�stermişlerdir. Makrofaj aktivasyonu belirte�lerinden biri olan fagositoz, bakterinin elimine edilmesinde doğal bağışıklığın �nemli işlevlerinden biridir20. Sigara dumanına maruz kalan makrofaj h�crelerinin, apoptotik n�trofil ve epitel h�crelerini fagosite edemedikleri daha �nceki �alışmalarda g�sterilmiştir13,21. Ayrıca SDE'nin, Haemophilus influenzae ve Streptococcus pneumoniae gibi farklı bakterilerin fagositozuna etkisinin incelendiği �alışmalarda, fagositozun azaldığı belirlenmiş; bu bozulmanın lateks boncukların fagositozunda ger�ekleşmediği, dolayısıyla fagositozdaki bozulmanın bakteriye �zg�l olduğu ortaya konulmuştur19,22. Bizim �alışmamızda, makrofajların S.aureus fagositozunu araştırmak i�in farklı iki y�ntem kullanılmıştır. Bunlardan ilki olan bakteriyolojik y�ntem; fagositik h�crelerin patlatılıp, fagosite edilen bakterilerin agar plaklarına ekilmesi ve ertesi g�n sayılması esasına dayanan klasik mikrobiyolojik y�ntemdir23. Bu y�ntem, pahalı ekipmanlar gerektirmemesi nedeniyle her laboratuvarda uygulanabilmesine karşın, �ok sayıda dil�syon yapılması, agar plaklara ekim ve ertesi g�n koloni sayımı ile uzun ve uğraştırıcı bir metottur. �alışmamızda klasik mikrobiyolojik y�ntemle baktığımızda, normal ortamdaki makrofaj h�crelerine enfeksiyon i�in ilave edilen S.aureus'un %83'� fagosite edilirken, sigara dumanına %10, %25 ve %50 konsantrasyonlarda maruz kalan h�crelerde fagositozun sırasıyla 6.2, 4.1 ve 3.4 kat azaldığı tespit edilmiştir (p< 0.05). İki saat uygulanan %10 SDE sonucu h�cre �l�m�nde anlamlı artış olmamasına rağmen, fagositoz 6.2 kat azalmıştır (p< 0.001). Bu durum, sigara dumanının makrofaj canlılığının etkilenmediği %10'luk konsantrasyonunun, makrofaj fonksiyonu �zerine olan direkt etkisi olarak yorumlanabilir.

�alışmamızda kullandığımız ikinci y�ntem, floresan ile işaretli bakteriler kullanılarak akım sitometrisi ile fagositoz esasına dayanmaktadır23. Bu �alışmada, literat�rde ilk defa SYBR� Green floresan ile işaretli S.aureus kullanarak akım sitometrisi ile makrofaj h�crelerinde fagositoz araştırılmıştır. Mikrobiyolojik y�ntemde sadece h�cre i�inde canlı olan bakteriler tespit edilebilirken, akım sitometri y�nteminde kullanılan SYBR� Green, DNA'ya bağlandığı i�in, h�cre i�ine alınan canlı ve �l� t�m bakterileri tespit edebilmektedir. Pahalı bir ekipman gerektirmesine rağmen, uygulanma kolaylığı ve daha duyarlı sonu� vermesi a�ısından akım sitometrisi avantajlı bir y�ntemdir23. Makrofajların fagositoz yeteneğini �l�t�ğ�m�z akım sitometri y�nteminde, makrofajların %99.8'inin SYBR� Green ile işaretli S.aureus ile enfekte olduğu belirlenmiştir. Ayrıca makrofajlar tarafından fagosite edilen bakteri sayısının, SDE'nin %10 ve %50 konsantrasyonlarında azaldığı; �zellikle %50 konsantrasyonda daha az sayıda bakteri fagosite eden makrofaj sayısının arttığı tespit edilmiştir (Şekil 3). Klasik mikrobiyolojik y�ntemde fagosite edildikten sonra �len bakterileri tespit etme imkanı yok iken, akım sitometri y�ntemi hem canlı hem de �l� bakteriyi fagosite edildikten sonra g�sterebilmektedir. Bu durum �alışmamızda fagositozun tespitinde kullanılan iki y�ntem arasındaki oransal farkı a�ıklamaktadır.

Sigaranın, bakteriyel enfeksiyonlara karşı duyarlılığı artırması, imm�n sistem h�creleri �zerindeki etkilerinin yanında, bakteriyel vir�lans fakt�rlerini artırmasına da bağlı olabilir. McEachern ve arkadaşları24, SDE'ye maruz bırakılan metisiline diren�li S.aureus'un makrofajlar tarafından �ld�r�lmeye 4 kat daha diren�li olduğunu g�stermişlerdir. Bizim �alışmamızda, SDE'ye maruz bırakılan makrofajlar S.aureus tarafından enfekte edilmeden �nce SDE'den yıkanarak uzaklaştırıldıkları i�in S.aureus SDE'den etkilenmemiştir. Dolayısıyla fagositozdaki azalma oranı, bakteri kaynaklı olmayıp makrofaj kaynaklıdır. Sonu� olarak �alışmamızda, sigara dumanına maruziyette, doğal bağışıklıkta rol alan etkin h�crelerden olan makrofajların canlılığının ve �nemli enfeksiyon etkeni olan S.aureus'u fagosite etme yeteneklerinin zarar g�rd�ğ� belirlenmiştir. Bununla birlikte, bu etkilerin altta yatan molek�ler mekanizmalarının a�ıklığa kavuşturulabilmesi i�in ileri molek�ler �alışmalara ihtiya� vardır.

KAYNAKLAR

  1. Sancak B. Staphylococcus aureus and antibiotic resistance. Mikrobiyol Bul 2011; 45(3): 565-76.
  2. Foster TJ. Immune evasion by staphylococci. Nat Rev Microbiol 2005; 3(12): 948-58.
  3. Bagaitkar J, Demuth DR, Scott DA. Tobacco use increases susceptibility to bacterial infection. Tob Induc Dis 2008; 4:12.
  4. Erdem E, Karako� F. Sigara dumanı maruziyetinin prenatal ve erken �ocukluk imm�n sistemi �zerine etkileri. Turkiye Klinikleri J Allergy-Special Topics 2009; 2(2): 1-6.
  5. Arvas A, Baş V, G�r E. S�t �ocukluğu d�neminde edilgen sigara i�iminin alt solunum yolu enfeksiyonu gelişimine etkisi. Turk Pediatri Ars 2009; 44(1): 12-7.
  6. Arcavi L, Benowitz NL. Cigarette smoking and infection. Arch Intern Med 2004; 164(20): 2206-16.
  7. Deveci F, Turgut T, Akbulut H, Kırkıl G, Muz MH. Kronik obstr�ktif akciğer hastalığı olan ve sigara i�en sağlıklı olgularda serum imm�nglobulin d�zeyleri. Solunum Hastalıkları Derg 2002; 13(4): 246-55.
  8. Tollerud DJ, Clark JW, Brown LM, et al. Association of cigarette smoking with decreased numbers of circulating natural killer cells. Am Rev Respir Dis 1989; 139(1): 194-8.
  9. Chen H, Cowan MJ, Hasday JD, Vogel SN, Medvedev AE. Tobacco smoking inhibits expression of proinflammatory cytokines and activation of IL-1R-associated kinase, p38, and NF-kappaB in alveolar macrophages stimulated with TLR2 and TLR4 agonists. J Immunol 2007; 179(9): 6097-106.
  10. Guzik K, Skret J, Smagur J, et al. Cigarette smoke-exposed neutrophils die unconventionally but are rapidly phagocytosed by macrophages. Cell Death Dis 2011; 2: e131.
  11. Dao DN, Kremer L, Gu�rardel Y, et al. Mycobacterium tuberculosis lipomannan induces apoptosis and interleukin-12 production in macrophages. Infect Immun 2004; 72(4): 2067-74.
  12. Chang YC, Yang CY, Sun RL, Cheng YF, Kao WC, Yang PC. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep 2013; 3: 1863.
  13. Hodge S, Hodge G, Ahern J, Jersmann H, Holmes M, Reynolds PN. Smoking alters alveolar macrophage recognition and phagocytic ability: implications in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Cell Mol Biol 2007; 37(6): 748-55.
  14. Guldas N, Bayrakal V, Bahar IH. Evaluation of the relationship between microenvironment and biofilm and coagulase responses of Staphylococcus aureus strains under the effect of gentamicin. Mikrobiyol Bul 2013; 47(1): 19-26.
  15. Bouchard DS, Rault L, Berkova N, Le Loir Y, Even S. Inhibition of Staphylococcus aureus invasion into bovine mammary epithelial cells by contact with live Lactobacillus casei. Appl Environ Microbiol 2013; 79(3): 877-85.
  16. Kode A, Yang SR, Rahman I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respir Res 2006; 7:132.
  17. Cervellati F, Muresan XM, Sticozzi C, et al. Comparative effects between electronic and cigarette smoke in human keratinocytes and epithelial lung cells. Toxicol In Vitro 2014; 28(5): 999-1005.
  18. Yang SR, Chida AS, Bauter MR, et al. Cigarette smoke induces proinflammatory cytokine release by activation of NF-kappaB and posttranslational modifications of histone deacetylase in macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006; 291(1): L46-57.
  19. Phipps JC, Aronoff DM, Curtis JL, Goel D, O'Brien E, Mancuso P. Cigarette smoke exposure impairs pulmonary bacterial clearance and alveolar macrophage complement-mediated phagocytosis of Streptococcus pneumoniae. Infect� Immun 2010; 78(3): 1214-20.
  20. Flannagan RS, Heit B, Heinrichs DE. Antimicrobial mechanisms of macrophages and the immune evasion strategies of Staphylococcus aureus. Pathogens 2015; 4(4): 826-68.
  21. Noda N, Matsumoto K, Fukuyama S, et al. Cigarette smoke impairs phagocytosis of apoptotic neutrophils by alveolar macrophages via inhibition of the histone deacetylase/Rac/CD9 pathways. Int Immunol 2013; 25(11): 643-50.
  22. Mart�-Lliteras P, Regueiro V, Morey P, et al. Nontypeable Haemophilus influenzae clearance by alveolar macrophages is impaired by exposure to cigarette smoke. Infect Immun 2009; 77(10): 4232-42.
  23. Hampton MB, Winterbourn CC. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J Immunol Methods 1999; 232(1-2): 15-22.
  24. McEachern EK, Hwang JH, Sladewski KM, et al. Analysis of the effects of cigarette smoke on staphylococcal virulence phenotypes. Infect Immun 2015; 83(6): 2443-52.

İletişim (Correspondence):

Yrd. Do�. Dr. Sibel Ak,

Zirve �niversitesi EBN Tıp Fak�ltesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

Kızılhisar Kamp�s� 27260, Şahinbey, Gaziantep, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 342 211 6666,

E-posta (E-mail): sibel.ak@zirve.edu.tr

Yazdır