Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2016; 50(2): 266-277

Kist �rneklerinde Yeni Bir Tek T�p Multipleks Ger�ek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile
Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması

Detection of Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis in Cyst Samples Using a
Novel Single Tube Multiplex Real-Time Polymerase Chain Reaction

H�seyin CAN1, Tonay İNCEBOZ2, Ayşe CANER3, Esra ATALAY ŞAHAR3, Muhammet KARAKAVUK3,
Mert D�ŞKAYA3, Fehmi �ELEBİ4, Aysu DEĞİRMENCİ D�ŞKAYA3, Sultan G�L�E İZ5, Y�ksel G�R�Z3,
Metin KORKMAZ3

1 Ege �niversitesi Fen Fak�ltesi, Biyoloji B�l�m�, Molek�ler Biyoloji Anabilim Dalı, İzmir.

1 Ege University Faculty of Science, Department of Biology, Molecular Biology Section, Izmir, Turkey.

2 Dokuz Eyl�l �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Parazitoloji Anabilim Dalı, İzmir.

2 Dokuz Eyl�l University Faculty of Medicine, Department of Parasitology, Izmir, Turkey.

3 Ege �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Parazitoloji Anabilim Dalı, İzmir.

3 Ege University Faculty of Medicine, Department of Parasitology, Izmir, Turkey.

4 Sakarya �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Genel Cerrahi Anabilim Dalı, Sakarya.

4 Sakarya University Faculty of Medicine, Department of General Surgery, Sakarya, Turkey.

5 Ege �niversitesi M�hendislik Fak�ltesi, Biyom�hendislik B�l�m�, İzmir.

5 Ege University Faculty of Engineering, Department of Bioengineering, Izmir, Turkey

�Z

D�nyada ve �lkemizde Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in neden olduğu sırasıyla kistik ekinokokkoz (KE) ve alveolar ekinokokkoz (AE) �nemli helmint hastalıkları arasındadır. T�rkiye'de yapılan epidemiyolojik �alışmalar KE prevalansının 291-585/100.000 arasında olduğunu g�stermiştir. AE seroprevalansının da %3.5 oranında olduğu bildirilmiştir. KE ve AE tanısında klinik bulgular yanında genelde radyoloji (ultrason, bilgisayarlı tomografi, manyetik rezonans) ve serolojik y�ntemler kullanılmaktadır. Kesin tanı patolojik incelemeye dayalıdır. Hidatik kistlerin steril olması ya da protoskoleks i�ermemesi durumunda ise, patolojik tekniklerle E.granulosus ve E.multilocularis t�r ayrımında zorluklar yaşanmaktadır. Bu �alışmada, aynı test i�erisinde AE ve KE tanısının yapılmasına imkan verebilecek Echi S (5'-TTTATGAATATTGTGACCCTGAGAT-3') ve Echi A (5'-GGTCTTAACTCAACTCATGGAG-3') primerleri ve �� farklı prob; Anchor Ech (5'-GTTTGCCACCTCGATGTTGACTTAG-floresan-3'), Granulosus (5'-LC640-CTAAGGTTTTGGTGTAGTAATTGATATTTT-fosfat-3') ve Multilocularis (5'-LC705-CTGTGATCTTGGTGTAGTAGTTGAGATT-fosfat-3') kullanılarak, E.granulosus ve E.multilocularis mitokondriyal 12S rRNA genini hedefleyen yeni bir multipleks ger�ek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (M-RT-PCR) y�nteminin geliştirilmesi ama�lanmıştır. M-RT-PCR sırasında, E.granulosus (GenBank: AF297617.1) ve E.multilocularis (GenBank: NC_000928.2) mitokondriyal 12S rRNA gen b�lgelerini i�eren plazmidler pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. M-RT-PCR y�nteminin geliştirilmesinde ayrıca, patolojik olarak KE (n: 10) ve AE (n: 15) olduğu doğrulanmış hastalara ait kist �rneklerinin yanı sıra, negatif kontrol olarak sağlıklı insan DNA �rnekleri (n: 25) ve 12 farklı parazite (Taenia saginata, Hymenolepis nana, Trichuris trichiura, Fasciola hepatica, Enterobius vermicularis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis jirovecii, Trichomonas vaginalis, Cryptosporidium hominis, Strongyloides stercoralis, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax) ait DNA �rnekleri de �alışılmıştır. Testin analitik duyarlılığının saptanması i�in TOPO klonlama ile E.granulosus ve E.multilocularis pozitif kontrol plazmidleri oluşturulmuştur. Pozitif kontrol plazmidi, analitik duyarlılık ve �zg�ll�ğ�n belirlenmesi amacıyla her reaksiyonda 106-105-104-103-102-101-1 plazmid kopya olacak şekilde distile su ile sulandırılmıştır. �alışmamızın sonu�ları, testin pozitif kontrol plazmidi kullanılarak elde edilen analitik duyarlılığının, E.granulosus ve E.multilocularis i�in 1 plazmid kopya/�l �rnek olduğunu g�stermiştir. Testin 12 farklı parazite ait DNA �rneği ile �apraz reaksiyon vermemesi, analitik �zg�ll�ğ�n� ortaya koymuştur. Yirmibeş hastaya ait kist �rneğinde Echinococcus DNA varlığının g�sterilmesi ve t�r ayrımının yapılabilmesinin yanında, sağlıklı (negatif kontrol) insan DNA �rnekleri ile �apraz reaksiyon vermemesi, testin klinik duyarlılık ve �zg�ll�ğ�n�n %100 olduğunu g�stermiştir. Sonu� olarak, bu �alışmada geliştirilen M-RT-PCR y�nteminin, kist �rneklerinde ekinokokkoz tanısının konulmasına ek olarak, E.granulosus ve E.multilocularis'in ayırt edilmesinde duyarlı, �zg�l, hızlı ve g�venilir bir y�ntem olduğu tespit edilmiştir.�

Anahtar s�zc�kler: Echinococcus granulosus; Echinococcus multilocularis; multipleks ger�ek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu; mitokondriyal 12S rRNA.

ABSTRACT

Cystic echinococcosis (CE) and alveolar echinococcosis (AE) caused by Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis, respectively, are important helminthic diseases worldwide as well as in our country. Epidemiological studies conducted in Turkey showed that the prevalence of CE is 291-585/100.000. It has also been showed that the seroprevalence of AE is 3.5%. For the diagnosis of CE and AE, radiological (ultrasonography, computed tomography, magnetic resonance) and serological methods, in addition to clinical findings, are being used. The definitive diagnosis relies on pathological examination When the hydatid cysts are sterile or does not contain protoscolex, problems may occur during pathological discrimination of E.granulosus and E.multilocularis species. In this study, we aimed to develop a novel multiplex real-time polymerase chain reaction (M-RT-PCR) targeting mitochondrial 12S rRNA gene of E.granulosus and E.multilocularis using Echi S (5'-TTTATGAATATTGTGACCCTGAGAT-3') and Echi A (5'-GGTCTTAACTCAACTCATGGAG-3') primers and three different probes; Anchor Ech (5'-GTTTGCCACCTCGATGTTGACTTAG-fluoroscein-3'), Granulosus (5'-LC640-CTAAGGTTTTGGTGTAGTAATTGATATTTT-phosphate-3') and Multilocularis (5'-LC705-CTGTGATCTTGGTGTAGTAGTTGAGATT-phosphate-3') that will enable the diagnosis of CE and AE in same assay. During M-RTR-PCR, plasmids containing E.granulosus (GenBank: AF297617.1) and E.multilocularis (GenBank: NC_000928.2) mitochondrial 12S rRNA regions were used as positive controls. Cysts samples of patients which were pathologically confirmed to be CE (n: 10) and AE (n: 15) and healthy human DNA samples (n: 25) as negative control as well as DNA samples of 12 different parasites (Taenia saginata, Hymenolepis nana, Trichuris trichiura, Fasciola hepatica, Enterobius vermicularis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis jirovecii, Trichomonas vaginalis, Cryptosporidium hominis, Strongyloides stercoralis, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax) were used to develop M-RT-PCR. E.granulosus and E.multilocularis control plasmids were constructed to detect analytic sensitivity of the test using TOPO cloning. Positive control plasmids were diluted to determine analytical sensitivity and specificity by distilled water at 106-105-104-103-102-101-1 plasmid copy of dilution in each reaction. According to the results, analytical sensitivity of the assay for E.granulosus and E.multilocularis was 1 copy plasmid/�l reaction. The non-existence of cross reactivity with 12 different parasites' DNA samples showed the analytical specificity of the assay. Displaying Echinococcus DNA in cyst samples among 25 patients and species discrimination as well as non-existence of cross reactivity with human DNA samples showed that the clinical sensitivity and specificity of the assay were 100%. As a result, the M-RT-PCR developed in the present study provided a sensitive, specific, rapid, and reliable method in the diagnosis of echinococcosis and the discrimination of E.granulosus and E.multilocularis from cyst samples.

Keywords: Echinococcus granulosus; Echinococcus multilocularis; multiplex real-time polymerase chain reaction; mitochondrial 12S rRNA.

Geliş Tarihi (Received): 17.01.2016 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 11.02.2016

GİRİŞ

Echinococcus t�rlerinin neden olduğu ekinokokkoz, d�nya genelinde en �nemli helmint hastalıklarından biridir. Son yapılan taksonomik d�zenlemede, Echinococcus cinsinin dokuz farklı t�r� olduğu kabul edilmiştir1. Bu t�rler arasında, Echinococcus granulosus, E.equinus, E.felidis, E.canadensis ve E.ortleppi kistik ekinokokkoza (KE); E.multilocularis ise alveolar ekinokokkoza (AE) neden olmaktadır. E.oligarthrus ve E.vogeli'nin polikistik ekinokokkoza (PE) yol a�tığı, E.shiquicus kistlerinin de PE ve KE ile benzerlik g�sterdiği fakat hen�z kesin bir zoonotik stat�s�n�n olmadığı rapor edilmiştir2. Molek�ler epidemiyolojik y�ntemlerle E.granulosus t�r� i�erisinde 10 farklı genotip (G1-G10) tanımlanmıştır3. Bu genotipler arasında bazıları t�r olarak değerlendirilerek G1-G3 E.granulosus sensu stricto,� G4 ve G5 sırasıyla, E.equinus ve E.ortleppi ve G6-G10 E.canadensis olarak isimlendirilmiştir4. İnsan ve hayvanlar i�in en �nemli ve yaygın olarak saptanan t�rlerin, E.granulosus sensu stricto ve E.multilocularis olduğu bildirilmiştir5. T�rkiye'de koyun suşu olarak adlandırılan G1 genotipi, insan dahil olmak �zere farklı hayvan t�rlerinde de saptanmıştır6.�

Yurdumuzda, E.granulosus kaynaklı KE hemen hemen b�t�n b�lgelerde g�r�l�rken, E.multilocularis'in etkeni olduğu AE sıklıkla Doğu Anadolu'da g�r�lmektedir7. T�rkiye'de insanlarda KE prevalansının genellikle cerrahi olgu kayıtlarından elde edildiği ve bu sonu�lara bağlı olarak 0.8-2/100.000 arasında olduğu bildirilmiştir8. KE prevalansını araştıran epidemiyolojik �alışmalarda da, prevalansın 291-585/100.000 arasında olduğu rapor edilmiştir7. T�rkiye'de, T.C. Sağlık Bakanlığı verilerine g�re 1975-1994 yılları arasında 40.242 olgu saptanmıştır. Yakın zamanda yapılan bir başka �alışmada ise, 1990-2005 yılları arasında 52.124 insan KE olgusu tespit edilmiştir. E.granulosus i�in kesin konak olan k�peklerde de prevalansın %0.32-%40 arasında olduğu bulunmuştur7,8,9. T�rkiye'de insanlarda g�r�len AE olgularına bakıldığında, 2000-2010 yılları arasında 162 AE olgusu tespit edilmiş; E.multilocularis antikor seroprevalansı ise %3.5 oranında saptanmıştır10. T�rkiye'de E.multilocularis i�in ana konak olan tilkilerde de E.multilocularis saptandığı bildirilmiştir11.

KE ve AE tanısında, klinik bulgular, radyoloji (ultrason, bilgisayarlı tomografi, manyetik rezonans) ve ELISA ile Western Blot gibi serolojik y�ntemler, cerrahi tedavi �ncesinde kullanılmaktadır12,13,14,15. Kesin tanı genellikle patolojik/histolojik incelemeye dayalı olup, �ıkartılan doku par�asına periyodik asit Schiff (PAS) boyası uygulanmaktadır16. Ancak bu y�ntemin bazı kısıtlamaları mevcuttur. Bu kısıtlamalardan birisi, �oğu zaman Echinococcus spp. kistlerinin steril olması ya da protoskoleks i�ermemesi ve bu sebeple de E.granulosus ve E.multilocularis arasında t�r ayrımının yapılamamasıdır16. Bu sorunun �stesinden gelebilmek i�in geleneksel y�ntemlere ek olarak, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) y�ntemi E.granulosus ve E.multilocularis t�rlerinin saptanmasında kullanılmaktadır. PCR y�ntemi sıklıkla drenaj ve biyopsi materyallerine uygulanmakta ve bu y�ntem giderek ekinokokkoz tanısında doğrulayıcı bir tanı aracı olarak kabul g�rmektedir5,17. PCR y�ntemlerinde; mitokondriyal NADH dehidrogenaz 1 (ND1), ND5, sitokrom b, sitokrom c oksidaz alt �nite 1 (COX1) ve 12S rRNA gibi gen b�lgeleri ekinokokkoz tanısında araştırılmaktadır2,5,16,18,19,20. Bu �alışmada, aynı test i�erisinde E.granulosus ve E.multilocularis saptanmasına olanak sağlayan mitokondriyal 12S rRNA genini hedefleyen yeni bir multipleks ger�ek zamanlı PCR y�nteminin geliştirilmesi ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

Kist �rnekleri

Testin geliştirilmesinde, AE veya KE tanısı patolojik olarak doğrulanmış opere hastalara ait 25 adet kist materyali (10 adet E.granulosus, 15 adet E.multilocularis) kullanıldı. Negatif kontrol olarak sağlıklı 25 kişiye ait DNA �rnekleri �alışıldı. �alışma i�in, Ege �niversitesi Tıp Fak�ltesi Araştırma Etik Kurulundan onay (13.07.2015 tarih ve 15-6.1/4 karar no) alındı.

TOPO Klonlama ile Pozitif Kontrol Plazmid Oluşturulması

E.granulosus (GenBank: AF297617.1) ve E. multilocularis (GenBank: NC_000928.2) mitokondriyal 12S rRNA geni i�erisindeki 199 baz �ift (b�)'lik kısmı i�eren plazmid kontrollerin oluşturulmasında E.granulosus ve E.multilocularis pozitif kist materyalleri kullanıldı. Pozitif kontrol plazmidi �retici firmanın (Invitrogen, ABD) protokol�ne g�re tarif edildiği gibi hazırlandı21.

�ncelikle E.granulosus mitokondriyal 12S rRNA ve E.multilocularis mitokondriyal 12S rRNA gen b�lgeleri �zg�l primerler kullanılarak tarif edildiği gibi izole edildi17,22. Kısaca; PCR reaksiyonunda genomik DNA (1-10 ng), her biri 0.5 �M primerler [Echi S (5'-TTTATGAATATTGTGACCCTGAGAT-3'; 25 nt) ve Echi A (5'-GGTCTTAACTCAACTCATGGAG-3'; 22 nt)], 1.25 U TaqDNA polimeraz (Fermentas, ABD), 0.2 mM dNTP ve 1 x TaqDNA polimeraz reaksiyon tamponu kullanılarak tarif edilen PCR protokol� ile izole edildi; 95�C'de 15 dk başlangı� denat�rasyonu sonrası, 30 sn 95�C, 30 sn 55�C ve 30 sn 72�C'lik 40 d�ng� ve son uzama basamağı 72�C'de 5 dk uygulandı. Her bir PCR reaksiyonunun i�erdiği DNA miktarı Nanodrop ile belirlendi ve daha sonra PCR �r�nleri agaroz jel elektroforezi ile g�r�nt�lendi. PCR �r�n� daha sonra PCR saflaştırma kiti (Qiagen, Almanya) ile �retici firmanın protokol�ne g�re saflaştırıldı.�

1 �l saflaştırılmış PCR �r�n�, 1 �l tuz sol�syonu, 1 �l pCRII-TOPO vekt�r ve 3 �l distile su karıştırılarak 20 dk oda sıcaklığında ink�be edildi. Sonrasında karışımdan 2 �l alınarak buz �st�nde DH5 h�creleri ile karıştırılıp 30 dk ink�basyona bırakıldı. İnk�basyon sonrası karışıma 42�C'de ısı şoku uygulanmış ve 250 �l SOC (s�per optimal katobolizer) besiyeri eklenip 225 rpm'de 37�C'de 1 saat ink�be edildi. Daha sonra h�creler, kanamisin i�eren LB-Agar plaklara ekilerek 37�C'de 1 g�n ink�be edildi. Oluşan kolonilerden tek koloni se�imi yapılarak kanamisin i�eren 3 ml'lik LB besiyerine aktarıldı ve 37�C'de 225 rpm ile 1 g�n s�resince ink�be edildi. Elde edilen sıvı kolonilerden plazmid ekstraksiyonu yapıldı. Plazmidler E.granulosus mitokondriyal 12S rRNA (GenBank no: AF297617) ve E.multilocularis mitokondriyal 12S rRNA (GenBank no: NC_000928) gen b�lgelerini i�eren pozitif kontrol olarak kullanıldı. Pozitif kontrol plazmidi, analitik duyarlılık ve �zg�ll�ğ�n belirlenmesi amacıyla her reaksiyonda 106-105-104-103-102-10-1 plazmid kopya olacak şekilde distile su ile sulandırıldı. Testte negatif kontrol olarak distile su kullanıldı.

Klinik �rneklerden DNA İzolasyonu

Kist dokusu �rneklerinden DNA ekstraksiyonu, kit ile �retici firmanın (Qiagen, Almanya) protokol� kullanılarak tarif edildiği gibi yapıldı. DNA ekstraksiyonu sırasında doku �rneklerini i�eren homojenattan 80 �l (ortalama 25 �g doku i�erir) kullanıldı. Bu homojenat �zerine 180 �l ATL tampon ve 20 �l proteinaz K ilave edilerek iyice karıştırıldı ve 56�C'de dokular tamamen eriyene kadar ink�be edildi. Eritilmiş doku �zerine 200 �l AL tampon ekledikten sonra iyice karıştırılıp 70�C'de 10 dk ink�basyona bırakıldı. İnk�basyon sonrası karışım i�erisine 200 �l etanol eklendi ve sonrasında bir kez daha iyice karıştırıldı. Elde edilen karışım, kollekt�r t�p �zerine oturtulmuş kite ait filtreye aktarılıp 8000xg'de 1 dk santrif�j edildi. Santrif�j sonrası s�z�len sıvıyı i�eren kollekt�r t�p atıldı ve filtreli t�pler temiz bir başka kollekt�r t�p i�ine yerleştirildi. Bundan sonra filtreli t�plere 500 �l AW1 yıkama tamponu ilave edilip, tekrar 8000xg'de 1 dk santrif�j edildi. Filtreli t�pler santrif�j sonrası temiz kollekt�r t�plerin i�ine yerleştirildi ve �zerine 500 �l AW2 yıkama tamponu ilave edildikten sonra 14000 x g'de 3 dk santrif�j edildi. Son olarak 14000 x g'de 1 dk daha santrif�j ile arta kalan yıkama tamponu uzaklaştırılıp filtreli t�p temiz bir 1.5 ml'lik ependorf i�ine yerleştirildi. Daha sonra 200 �l el�syon tamponu filtreli t�pe eklendi; 1 dk bekletildikten sonra t�pler 8000 x g'de 1 dk santrif�j edildi. Bu aşamadan sonra filtreli t�p atılarak, geride kalan DNA �rneği PCR �alışılıncaya kadar -20�C'de saklandı.

Multipleks Ger�ek Zamanlı PCR (M-RT-PCR)

Bu y�ntemde, E.granulosus ve E.multilocularis'e ait mitokondriyal 12S rRNA geni i�erisindeki 199 b� uzunluğundaki b�lge hedeflendi. Hedef genin �oğaltılmasında Echi S (5'-TTTATGAATATTGTGACCCTGAGAT-3'; 25 nt) ve Echi A (5'-GGTCTTAACTCAACTCATGGAG-3'; 22 nt) primerleri ve �� farklı prob; Anchor Ech (5'-GTTTGCCACCTCGATGTTGACTTAG-floresan-3'; 25 nt), Granulosus (5'-LC640-CTAAGGTTTTGGTGTAGTAATTGATATTTT-fosfat-3'; 30 nt) ve Multilocularis (5'-LC705-CTGTGATCTTGGTGTAGTAGTTGAGATT-fosfat-3'; 28 nt) (TIB MolBiol, Almanya) kullanıldı. Bu reaksiyon i�in, LightCycler� Fast Start DNA Master HybProbe kiti, primer ve problar, Tablo I'de verildiği miktarlarda karıştırıldı. �rneklere 1.5 LightCycler Real Time cihazında, Tablo II'de tarif edilen nicelik (quantification) ve erime eğrisi (melting curve) analizleri uygulandı.


Tablo I

Tablo II

�apraz Reaksiyon �rnekleri

M-RT-PCR testinin analitik �zg�ll�ğ�n�n belirlenmesinde; 12 farklı parazit (Taenia saginata, Hymenolepis nana, Trichuris trichiura, Fasciola hepatica, Enterobius vermicularis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis jirovecii, Trichomonas vaginalis, Cryptosporidium hominis, Strongyloides stercoralis, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax) ve insan �rneklerinden elde edilen DNA ekstraksiyon �rnekleri kullanıldı.

BULGULAR

Analitik Duyarlılık

Testin analitik duyarlılığının saptanmasında, pozitif kontrol plazmidleri her reaksiyon 106-105-104-103-102-10-1 kopya plazmid olacak şekilde sulandırılmıştır. E.granulosus nicelik testinden elde edilen sonu�lar, pozitif kontrol plazmid �rneklerinin 106-1 arası dil�syonda belirgin amplifikasyon eğrisi verdiğini 1 plazmid i�eren �rnekte d�ş�k miktarda floresan ışıma olduğunu g�stermiştir (Şekil 1A, okbaşı). E.granulosus pozitif plazmid kontrol ve klinik �rneklere ait erime eğrisi analizi sonu�ları incelendiğinde; 51-57�C ve 59-64�C arasında iki farklı Tm değeri g�zlenmiştir (Şekil 1B ve 1D). Pozitif kontrol plazmid �rneklerinin 106-105-104-103-102-10 dil�syonda benzer erime eğrisi verdiği, 1 plazmid i�eren �rnekte d�ş�k miktarda ışıma olduğu saptanmıştır (Şekil 1B, okbaşı). Distile su negatif kontrol �rneğinde herhangi bir ışıma saptanmamıştır. Bu sonu�lar, E.granulosus testinin saptama limitinin 1 kopya plazmid/�l �rnek olduğunu g�stermiştir.


Şekil 1

E.multilocularis sonu�ları incelendiğinde; nicelik testinde pozitif kontrol plazmid �rneklerinin 106-1 arası dil�syonlarda belirgin amplifikasyon eğrisi verdiği g�r�lm�şt�r (Şekil 2A). E.multilocularis plazmid pozitif kontrol ve klinik �rneklere ait erime eğrisi analizi sonu�ları incelendiğinde, Tm değerinin 67.3 � 1.5�C olduğu saptanmıştır. Pozitif kontrol plazmid �rneklerinin 106-1 arası dil�syonlarda benzer erime eğrisi verdiği g�zlenmiştir (Şekil 2B). Distile su negatif kontrol �rneğinde herhangi bir ışıma saptanmamıştır. Bu sonu�lar, E.multilocularis testinin saptama limitinin 1 kopya plazmid/�l �rnek olduğunu g�stermiştir.


Şekil 2

Analitik �zg�ll�k

�alışmada kullanılan primer ve probların �zg�ll�ğ�, BLAST analizi ile National Center for Biotechnology Information web sitesi (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) kullanılarak doğrulanmış ve �nemli bir eşleşme g�r�lmemiştir. Ayrıca 12 farklı parazite ait DNA �rnekleri kullanılarak ger�ekleştirilen M-RT-PCR testinde �apraz reaksiyon saptanmamıştır.

Klinik Duyarlılık ve �zg�ll�k

M-RT-PCR testi geliştirilmesinde kullanılan 25 adet kist �rneğinin 10'u E.granulosus, 15'i E.multilocularis saptanmış hastalara aittir. M-RT-PCR y�nteminden elde edilen sonu�ların nicelik analizi, her �rnekte Echinococcus varlığını g�stermiştir (Şekil 1C ve 2C). Erime eğrisi sonu�ları, bu �rneklerin 10'unun E.granulosus (Şekil 1D) ve 15'inin de E.ultilocularis (Şekil 2D) olduğunu g�stermiştir. AE hastalarında, kontrol plazmidlerinden ve hastalara ait kist �rneklerinden elde edilen erime eğrisi analizi değerleri benzer bulunmuştur. KE hastalarına ait �rneklerin erime eğrileri incelendiğinde; 8 �rneğe ait erime eğrisi, pozitif kontrol plazmidi erime eğrisine benzerken, iki �rneğin erime eğrisi farklılık g�stermiştir (Şekil 1D, okbaşı). Bunların farklı E.granulosus suşlarına ait olduğu d�ş�n�lm�şt�r. Ayrıca negatif kontrol olarak kullanılan insan DNA �rneklerinin (n: 25) hepsi negatif saptanmıştır. Bu sonu�lara g�re, bu �alışmada geliştirilen M-RT-PCR y�nteminin ekinokokkoz tanısında duyarlılık ve �zg�ll�ğ�n�n %100 olduğu belirlenmiştir.

TARTIŞMA

Son zamanlarda, insanların da dahil olduğu ara konaklardan elde edilen kist materyallerinde ve k�pek ya da tilki gibi kesin konaklardan elde edilen dışkı �rneklerinde ekinokokkoz tanısı i�in geleneksel y�ntemlere ek olarak molek�ler y�ntemler kullanılmaktadır5,17,18,19. Bu y�ntemler sayesinde ekinokokkoza neden olan Echinococcus t�r� kolaylıkla ayırt edilebilmektedir.� Bu �alışmada geliştirilen multipleks yaklaşım ile kombine edilmiş ger�ek zamanlı PCR tekniği, zamandan tasarruf sağladığı, maliyeti d�ş�rd�ğ�, duyarlılık ve �zg�ll�ğ� artırdığı ve kullanım kolaylığı sebebiyle tercih sebebi olmaktadır. Ayrıca, kapalı t�p sisteminin kullanımı ile, molek�ler tanıda �nemli problemler arasında yer alan kontaminasyon riskinin azaltılması da bir diğer avantajıdır. Buna ek olarak hibridizasyon probunun kullanılması ile elde edilen erime eğrisi analizi sonu�ları, t�r bazında ve hatta hedef gene bağlı aynı t�r�n farklı suşları arasında da ayrım imkanı sağlayabilmektedir. Ayrıca, tedavi �ncesi ve sonrasında parazite ait DNA miktar tayininin �l��m�ne olanak vererek tedavi etkinliğinin değerlendirilmesine de yardımcı olmaktadır23,24.�

Bu �alışmada geliştirilen multipleks ger�ek zamanlı PCR (M-RT-PCR) sayesinde, T�rkiye'de ve d�nyada, insanlarda ve hayvanlarda ciddi patolojilere neden olan ekinokokkoz tanısı sağlanırken, E.granulosus ve E.multilocularis ayrımı da aynı test i�erisinde eş zamanlı olarak yapılabilmiştir. Ayrıca testin analitik duyarlılık ve �zg�ll�ğ�n�n belirlenmesi i�in TOPO klonlama ile pozitif kontrol plazmidleri oluşturulmuştur. Testin saptama limitinin, E.granulosus ve E.multilocularis i�in 1 kopya plazmid/�l �rnek olduğu g�sterilmiş ve 12 farklı parazit ile �apraz reaksiyon vermediği de belirlenmiştir. Bu sonu�lara g�re, geliştirilen test, E.granulosus ve E.multilocularis'in sebep olduğu ekinokokkoz tanısını y�ksek duyarlılık ve �zg�ll�kle saptayabilmektedir. Testte ayrıca, �� hibridizasyon probunun kullanılmasıyla ger�ekleştirilen erime eğrisi analizi sonucuna g�re, E.granulosus i�in iki farklı Tm değeri 51-57�C ve 59-64�C arasında değişirken, E.multilocularis i�in Tm değerinin 67.3 � 1.5�C olduğu saptanmıştır. Erime ısısı değerlerinin farklı olması sayesinde de E.granulosus ve E.multilocularis aynı test i�inde ayırt edilebilmiştir. Geliştirilen M-RT-PCR y�ntemi, daha sonra E.granulosus ve E.multilocularis olduğu patolojik olarak g�sterilmiş 25 �rneğe ve negatif 25 insan DNA �rneğine uygulanmış ve %100 duyarlılık ve �zg�ll�kle ekinokokkoz tanısının yapıldığı tespit edilmiştir. Bunun yanında, patolojik olarak ayrımı yapılmış 25 kist �rneğinin erime eğrisi analizi incelenerek 10'unun E.granulosus ve 15'inin E.multilocularis olduğu g�sterilmiştir.

Georges ve arkadaşları17, karaciğer dışı yerleşimli iki ekinokokkoz olgusunun serolojik değerlendirmesinde, kesin sonu� alınamaması sebebiyle, kemik dokusu kaynaklı iki kist i�eriğinde E.granulosus ve E.multilocularis'e ait mitokondriyal 12S rRNA genini konvansiyonel PCR kullanarak araştırmış ve her iki olgunun da AE olduğunu saptamışlardır. Yakın zamanda yapılan bir konvansiyonel multipleks PCR �alışmasında da, E.granulosus, E.,multilocularis ve E.shiquicus'e ait sırasıyla ND1, ND5 ve COX1 genleri hedeflenmiştir5. Elde edilen bant b�y�kl�kleri, testin �zg�ll�ğ�n�n, diğer parazitlere ait DNA'lar kullanıldığında %100 olduğunu g�stermiştir. Aynı �alışmada, duyarlılığın araştırılması i�in protoskoleks ve yumurtadan elde edilen DNA �rnekleri kullanılmış; duyarlılığın E.granulosus ve E.shiquicus i�in 20 pg DNA, E.multilocularis i�in 10 pg DNA, E.granulosus i�in iki yumurta ve E.multilocularis i�in tek yumurta olduğu belirtilmiştir5. Schneider ve arkadaşlarının16 �alışmasında, histolojik olarak E.granulosus (n: 76) ve E.multilocularis (n: 4) saptanmış 80 hasta �rneği, mitokondriyal ND1 genini hedefleyen konvansiyonel PCR y�ntemi kullanılarak E.granulosus ve E.multilocularis t�rlerinin ayırt edilmesinde kullanılmıştır. Elde edilen sonu�lar, kullanılan PCR y�nteminin duyarlılık ve �zg�ll�ğ�n�n sırasıyla %85 ve %100 olduğunu g�stermiştir16.� Dybicz ve arkadaşları19 ise, hepatektomi yapılan KE ş�pheli 47 hastaya ait �rnekleri, direkt mikroskopi ve iki farklı mitokondriyal gen b�lgesini (ND1 ve COX1) hedefleyen konvansiyonel PCR ile incelemişler; 27 �rnekte (%57) direkt mikroskopi ile protoskoleks g�r�rken, PCR ile 30 �rnekte (%64) pozitiflik saptamışlardır. Arjantin'de yapılan başka bir �alışmada, bir hastadan alınan biyopsi �rneği skoleks i�ermemesine rağmen kist morfolojisi sebebiyle ekinokokkoz ile ilişkilendirilmiş ve serolojik testler ile de ekinokokkoz tanısı doğrulanmıştır20. Daha sonra aynı hastadan ameliyatla �ıkartılan karaciğer �rneğinin patoloji sonucu AE olarak bulunmuştur. Aynı �rneğe iki farklı mitokondriyal DNA b�lgesini (sitokrom b ve COX1) hedefleyen konvansiyonel PCR uygulanmış ve elde edilen sonu�lar, ilgin� şekilde etkenin E.multilocularis değil, insanda PE oluşturan E.vogeli olduğunu g�stermiştir20. Bu �alışmalar ekinokokkoza neden olan t�r�n belirlenmesi ve kist tipinin ortaya �ıkarılmasında patoloji ve seroloji gibi geleneksel y�ntemlere ek olarak molek�ler y�ntemlerin de kullanılması gerektiğini vurgulamaktadır.

Diğer taraftan, ekinokokkozun insanlara ve diğer hayvanlara bulaşmasında anahtar rol oynayan k�pek ve tilkilere ait dışkı �rneklerinde PCR y�ntemi kullanılarak tanı konulmaktadır18,24. Hayvanlara ait dışkı �rneklerinde E.multilocularis'in molek�ler y�ntemlerle saptanması i�in yapılan bir �alışmada, E.multilocularis pozitif dışkı �rneklerinde (n: 47) 12S rRNA genini hedefleyen multipleks ger�ek zamanlı iki turlu (nested) PCR y�ntemi geliştirilmiştir18. Bu testin duyarlılığının klasik iki turlu PCR'a g�re %30-38 oranında daha y�ksek olduğu bulunmuş; analitik duyarlılık ise 10 fg hedef DNA olarak saptanmıştır18. Aynı �alışmada, farklı konaklardan izole edilmiş E.multilocularis suşlarına erime eğrisi analizi uygulandığında farklı Tm değerleri elde edilmiş; k�pek, tibet tilkisi ve kırmızı tilkiden izole edilen suşlara ait Tm değerleri sırasıyla 38�C, 44.8�C ve 56�C olarak tespit edilmiştir18. Oines ve arkadaşları24, tilki dışkılarında E.multilocularis yumurtalarının saptanması i�in, mitokondriyal DNA'yı hedefleyen multipleks PCR ve �� farklı ger�ek zamanlı PCR (RT-PCR) y�ntemini karşılaştırmışlar ve dışkıdan E.multilocularis tanısında RT-PCR y�nteminin daha duyarlı olduğu bildirmişlerdir24.

Ger�ek zamanlı PCR işleminde amplifikasyon işlemine paralel olarak erime eğrisi analizi ile t�r ayrımı yapılabilirken, farklı bir yaklaşıma sahip olan konvansiyonel PCR işlemi sonrası RFLP (restriction fragment length polymorphism) testi ile de t�r ayrımı yapılabilmektedir. Şakalar ve arkadaşları25, formaldehit ile tespit edilmiş parafine g�m�l� histolojik olarak ekinokokkoz tanısı almış 11 adet kist materyalini (10 adet KE, 1 adet AE) kullanarak PCR-RFLP y�ntemiyle t�r ayrımı yapmışlardır. İlk olarak kist materyallerine mitokondriyal gen b�lgesini hedefleyen PCR y�ntemi uygulanmış, sonrasında TsoI, MboI, MboII ve AccI restriksiyon enzimleri kullanılarak PCR �r�nleri kesilmiştir. İşlem sonrası jelde y�r�t�len �r�nlerden elde edilen sonu�lar, kullanılan restriksiyon enzimlerinin E.granulosus ve E.multilocularis'i birbirinden ayırdığını g�stermiştir25.

Kist �rneklerinin yanı sıra serum ve idrar �rneklerine de PCR y�nteminin uygulanabileceği g�sterilmiştir. Chaya ve arkadaşlarının26 �alışmasında, 50 hastadan (25'i cerrahi ya da ultrason ile KE tanısı almış, 25'i negatif kontrol) serum ve idrar �rneği; opere edilen 10 hastadan da kist sıvısı �rnekleri alınmıştır. Kist sıvısı �rneklerinin t�m� (n: 10), antijen tespiti yapan ELISA ve NADH1 genini hedefleyen konvansiyonel PCR ile E.granulosus pozitif bulunmuştur. Ayrıca KE tanısı almış 25 hastaya ait serum �rneklerinin beşinde PCR ile E.granulosus pozitifliği tespit edilmiştir. İlgin� olarak, bu hastaların kistlerinin perfore olduğu bildirilmiştir. İdrar �rneklerinin (n: 25) hi�birinde ve kontrollere (n: 25) ait serum �rneklerinde PCR ile pozitiflik saptanmamıştır26. Araştırıcılar, �alışmanın sonunda, bozulmamış kiste sahip hastaların serum �rneklerinde PCR y�nteminin başarısız olduğunu, ancak perfore kisti olan hastaların serum �rneklerinde PCR y�ntemiyle ekinokokkoz tanısının yapılabileceğini ifade etmişlerdir26.

Sonu� olarak, ekinokokkoz ile ilgili yapılan �alışmalar incelendiğinde, gerek insanlarda tanı i�in gerekse hastalığın yayılmasında temel unsur olsan k�pek ve tilkilerde yapılan epidemiyolojik �alışmalar i�in daha etkin PCR y�ntemine ihtiya� olduğu g�r�lmektedir. Bu sebeple �eşitli PCR tekniklerinin geliştirilmesi devam etmektedir. Bu �alışmada geliştirilen M-RT-PCR testinin g�sterdiği analitik ve klinik duyarlılık ve �zg�ll�k değerleri, kist ve serumdan ekinokokkoz tanısını ve t�r ayrımını eş zamanlı olarak yapabilecek bir y�ntem olduğu ortaya koymaktadır.

KAYNAKLAR

  1. Nakao M, Lavikainen A, Yanagida T, Ito A. Phylogenetic systematics of the genus Echinococcus (Cestoda: Taeniidae). Int J Parasitol 2013; 43(12-13): 1017-29.
  2. Ma J, Wang H, Lin G, et al. Molecular identification of Echinococcus species from eastern and southern Qinghai, China, based on the mitochondrial cox1 gene. Parasitol Res 2012; 111(1): 179-84.
  3. Zhang T, Yang D, Zeng Z, et al. Genetic characterization of human-derived hydatid cysts of Echinococcus granulosus sensu lato in Heilongjiang Province and the first report of G7 genotype of E. canadensis in humans in China. PLoS One 2014; 9(10): e109059.
  4. Altıntas N, �ztatlıcı M, Altıntas N, �nver A, Sakarya A. Molecular analysis of cattle isolates of Echinococcus granulosus in Manisa Province of Turkey. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2013; 19(3): 455-9.
  5. Liu CN, Lou ZZ, Li L, et al. Discrimination between E. granulosus sensu stricto, E. multilocularis and E. shiquicus using a multiplex PCR assay. PLoS Negl Trop Dis 2015; 9(9): e0004084.
  6. Utuk AE, Simsek S, Koroglu E, McManus DP. Molecular genetic characterization of different isolates of Echinococcus granulosus in east and southeast regions of Turkey. Acta Trop 2008; 107(2): 192-4.
  7. Altintas N. Past to present: echinococcosis in Turkey. Acta Trop 2003; 85(2): 105-12.
  8. Merdivenci A, Aydınlıoğlu K. Hydatidosis (Hydatid Disease). Istanbul University, Cerrahpasa School of Medicine Publications, vol. 2972. 1982, Istanbul.
  9. Sn�bel V, Altintas N, D'Amelio S, et al. Cystic echinococcosis in Turkey: genetic variability and first record of the pig strain (G7) in the country. Parasitol Res 2009; 105(1): 145-54.
  10. Miman O, Yazar S. Alveolar echinococcosis in Turkey: in the light of the literature. Turkiye Parazitol Derg 2012; 36(2): 116-20.
  11. Merdivenci, A. T�rkiye'de tilkide Alveococcus multilocularis olgusu ve yurdumuzda Alveococcus (alveolar kist)'in epidemiyolojisi ve epizootolojisi. Turk Hidatid Derg 1965; 1: 6-29.
  12. Kilimcioğlu AA, Girginkardeşler N, Korkmaz M, et al. A mass screening survey of cystic echinococcosis by ultrasonography, Western blotting, and ELISA among university students in Manisa, Turkey. Acta Trop 2013; 128(3): 578-83.
  13. Pektaş B, Altıntaş N, Akpolat N, Gottstein B. Evaluation of the diagnostic value of the ELISA tests developed by using EgHF, Em2 and EmII/3-10 antigens in the serological diagnosis of alveolar echinococcosis. Mikrobiyol Bul 2014; 48(3): 461-8.
  14. G�reser AS, �zcan O, �z�nel L, Boyacıoğlu Zİ, Taylan �zkan A. Evaluation of the radiological, biochemical and serological parameters of patients prediagnosed as cystic echinococcosis in �orum, Turkey. Mikrobiyol Bul 2015; 49(2): 231-9.
  15. Korkmaz M, Inceboz T, Celebi F, Babaoglu A, Uner A. Use of two sensitive and specific immunoblot markers, em70 and em90, for diagnosis of alveolar echinococcosis. J Clin Microbiol 2004; 42(7): 3350-2.
  16. Schneider R, Gollackner B, Edel B, et al. Development of a new PCR protocol for the detection of species and genotypes (strains) of Echinococcus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Int J Parasitol 2008; 38(8-9): 1065-71.
  17. Georges S, Villard O, Filisetti D, et al. Usefulness of PCR analysis for diagnosis of alveolar echinococcosis with unusual localizations: two case studies. J Clin Microbiol 2004; 42(12): 5954-6.
  18. Dinkel A, Kern S, Brinker A, et al. A real-time multiplex-nested PCR system for coprological diagnosis of Echinococcus multilocularis and host species. Parasitol Res 2011; 109(2): 493-8.
  19. Dybicz M, Gierczak A, Dabrowska J, Rdzanek L, Michałowicz B. Molecular diagnosis of cystic echinococcosis in humans from central Poland. Parasitol Int 2013; 62(4): 364-7.
  20. Grenouillet F, Frider B, Alvarez Rodriguez J, et al. Molecular diagnosis of polycystic echinococcosis due to Echinococcus vogeli in a Paraguayan immigrant in Argentina. J Clin Microbiol 2013; 51(9): 3151-3.
  21. Arcenas RC, Uhl JR, Buckwalter SP, et al. A real-time polymerase chain reaction assay for detection of Pneumocystis from bronchoalveolar lavage fluid. Diagn Microbiol Infect Dis. 2006; 54(3): 169-75.
  22. Stefanic S, Shaikenov BS, Deplazes P, Dinkel A, Torgerson PR, Mathis A. Polymerase chain reaction for detection of patent infections of Echinococcus granulosus ("sheep strain") in naturally infected dogs. Parasitol Res 2004; 92(4): 347-51.
  23. D�skaya M, Caner A, Degirmenci A, et al. Degree and frequency of inhibition in a routine real-time PCR detecting Pneumocystis jirovecii for the diagnosis of Pneumocystis pneumonia in Turkey. J Med Microbiol 2011; 60(Pt 7): 937-44.
  24. Oines O, Isaksson M, Hagstr�m �, Tavornpanich S, Davidson RK. Laboratory assessment of sensitive molecular tools for detection of low levels of Echinococcus multilocularis-eggs in fox (Vulpes vulpes) faeces. Parasit Vectors 2014; 7: 246.
  25. Şakalar �, Kuk S, Erensoy A, et al. Molecular discrimination of Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis by sequencing and a new PCR-RFLP method with the potential use for other Echinococcus species. Turk J Med Sci 2014; 44(5): 741-8.
  26. Chaya D, Parija SC. Performance of polymerase chain reaction for the diagnosis of cystic echinococcosis using serum, urine, and cyst fluid samples. Trop Parasitol 2014; 4(1): 43-6.

İletişim (Correspondence):

Do�. Dr. Mert D�şkaya,

Ege �niversitesi Tıp Fak�ltesi,

Parazitoloji Anabilim Dalı,

35100 Bornova, İzmir, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 232 390 4734,

E-posta (E-mail): mert.doskaya@ege.edu.tr

Yazdır