Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2016; 50(4): 569-579

Melissa officinalis L., Mentha x piperita L. ve Ocimum basilicum L. (Lamiaceae) U�ucu Yağlarının
Acanthamoeba castellani Kist ve Trofozoitleri �zerine İn Vitro Etkisinin Araştırılması*

Investigation of the In Vitro Effects of Melissa officinalis L., Mentha x piperita L. and Ocimum basilicum L. (Lamiaceae) Essential Oils on the Cysts and Trophozoites of Acanthamoeba castellani

Ceren ERG�DEN1, Soykan �ZKO�1, Bintuğ �ZT�RK2, Song�l BAYRAM DELİBAŞ1

1 Dokuz Eyl�l �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı, İzmir.

1 Dokuz Eylul University Faculty of Medicine, Department of Parasitology, Izmir, Turkey.

2 Ege �niversitesi Eczacılık Fak�ltesi, Farmas�tik Botanik Anabilim Dalı, İzmir.

2 Ege University Faculty of Pharmacy, Department of Pharmaceutical Botany, Izmir, Turkey.

* Bu �alışma, birinci yazarın tez �alışması olarak ger�ekleştirilmiştir.

�Z

D�nyada yaygın olarak bulunan Acanthamoeba t�rleri, serbest yaşayan amipler olup, �zellikle kontakt lens kullananlarda ve min�r kornea travmalarında Acanthamoeba keratiti (AK) olarak bilinen ve k�rl�ğe yol a�abilen enfeksiyonlara neden olmaktadır. G�n�m�zde AK olgularının tedavisinde antifungaller ve antiseptiklerden yararlanılmakta, ancak tedavi s�resinin uzun olması ve buna bağlı yan etkilerin ortaya �ıkışı, kronik enfeksiyonlarda g�zlenen kist formlarının ila�lara diren�li oluşu gibi sorunların ortadan kaldırılması i�in alternatif ila�lara ihtiya� duyulmaktadır. Yapılan �alışmalar, bazı bitkisel ekstrelerin ve bitkisel kaynaklı u�ucu yağların Acanthamoeba spp. �zerine etkili olabileceğini g�stermektedir. Bu �alışmanın amacı, Lamiaceae ailesinde yer alan Mentha x piperita L. (nane), Melissa officinalis L. (oğulotu) ve Ocimum basilicum L. (fesleğen) bitkilerine ait u�ucu yağların Acanthamoeba castellanii kist ve trofozoitleri �zerindeki etkilerinin in vitro olarak araştırılmasıdır. �alışmada kullanılan A.castellanii T4 genotipi, �evreden en sık izole edilen, AK ve gran�lomat�z amibik ensefalite neden olabilen bir t�rd�r. Amibisidal aktivitenin belirlenmesinde, Neo-Clevenger tipi distilasyon d�zeneği ile elde edilen Mentha x priperita L., Melissa officinalis L. ve Ocimum basilicum L. u�ucu yağları kullanılmıştır. İn vitro deneyler 96 �ukurlu mikroplaklarda ger�ekleştirilmiş; u�ucu yağ dil�syonlarının �zerine kist ve trofozoit sol�syonu eklenerek, kistler i�in 40, 20, 10, 5, 2.5 ve 1.25 �g/ml'lik, trofozoitler i�in ise 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 ve 0.313 �g/ml'lik son konsantrasyonlar elde edilmiştir. Plaklar, 30oC'de 1, 6, 24, 48 ve 72 saat boyunca ink�be edilmiş ve bu s�reler sonunda amip formlarının canlılığı, tripan mavisi ile boyanarak ışık mikroskobu ile değerlendirilmiştir. �alışmada, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, her bir u�ucu yağın A.castellanii kist ve trofozoitleri �zerinde doza ve s�reye bağımlı olarak artan amibisidal etki g�sterdiği belirlenmiştir. Kullanılan u�ucu yağların etkinliği değerlendirildiğinde, kist ve trofozoit formları i�in en y�ksek letal etkinin Melissa officinalis ile oluştuğu, bunu Mentha x piperita ve Ocimum basilicum'un izlediği belirlenmiştir. �alışmamızda, A.castellanii kistlerinin u�ucu yağlara karşı duyarlılığı, beklendiği �zere trofozoitlerden daha d�ş�k bulunmuştur. Melissa officinalis ve Mentha x piperita u�ucu yağları i�in en y�ksek konsantrasyonda (40 �g/ml) %100 �ld�r�c� etkinin g�r�ld�ğ�, buna karşın Ocimum basilicum u�ucu yağının 72 saat sonunda ve en y�ksek konsantrasyonda (40 �g/ml) bile kistlerin ancak %63.3'�n� �ld�rebildiği saptanmıştır. Sonu� olarak, Acanthamoeba spp. kist ve trofozoitlerine karşı Mentha x piperita, Melissa officinalis ve Ocimum basilicum bitkilerinden elde edilen u�ucu yağ aktivitelerinin incelendiği bu ilk �alışmanın verileri, bu bitkilere ait u�ucu yağların Acanthamoeba spp. enfeksiyonlarının tedavisinde geliştirilebilecek yeni ve alternatif doğal �r�nler olabileceğini d�ş�nd�rmektedir.

Anahtar s�zc�kler: Acanthamoeba; Melissa officinalis; Mentha x piperita; Ocimum basilicum; u�ucu yağ.

ABSTRACT

Acanthamoeba species are free living amoeba found widely all over the world. They are responsible for Acanthamoeba keratitis (AK), an infection which is especially seen in contact lens users and after minor corneal traumas, that may lead blindness. At present, antifungals and antiseptics are used for the treatment of AK cases, however, some problems such as long treatment periods and the occurrence of side effects, resistance of cyst forms against drugs, emphasize the need for new drugs. There are some published studies that pointed out the effectiveness of plant extracts and essential oils on Acanthamoeba spp. The aim of this study was to investigate the in vitro effects of essential oils of Mentha x piperita L. (peppermint), Melissa officinalis L. (lemon balm) and Ocimum basilicum L. (basil) belonging to Lamiaceae family, on the cysts and trophozoites of Acanthamoeba castellanii. The strain used in our study, namely A. castellanii T4 genotype, is the most frequently isolated amoeba from environment and also the causative agent of AK and granulomatous amebic encephalitis. For the determination of amebicidal activity, essential oils obtained from Mentha x priperita L., Melissa officinalis L. and Ocimum basilicum L. by Neo-Clevenger type of distillation apparatus have been used. In vitro experiments were performed by using 96-well microplates. Cyst and trophozoite solutions were added on the essential oil dilutions to obtain the last concentrations of 40, 20, 10, 5, 2.5 and 1.25 �g/ml for the cysts, and 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 and 0.313 �g/ml for the trophozoites. After the incubation of microplates at 30oC for 1, 6, 24, 48 and 72 hours, the viability of parasitic forms were evaluated under the light microscope followed by staining trypan blue. It was found that, each essential oil showed amebicidal effect on A.castellani cysts and trophozoites dependent on dosage and time, when compared with the control group, The maximum lethal effect occured with Melissa officinalis followed by Mentha x piperita and Ocimum basilicum, respectively. In our study, susceptibility of A.castellanii trophozoites to essential oils were more than the cysts, as expected. The essential oils of Melissa officinalis and Mentha x piperita showed 100% lethal effect at their highest concentrations whereas the essential oil of Ocimum basilicum showed only 63.3% lethal effect on cysts after 72 hours at the highest concentration (40 �g/mL). The results of this first study investigating the activities of essential oils extracted from Mentha x piperita, Melissa officinalis and Ocimum basilicum against Acanthamoeba spp. cysts and trophozoites, have suggested that, these essential oils could be potential novel and alternative natural products for the treatment of Acanthamoeba spp. infections.

Keywords: Acanthamoeba; Melissa officinalis; Mentha x piperita; Ocimum basilicum; essential oils.

Geliş Tarihi (Received): 31.05.2016 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 28.09.2016

GİRİŞ

Acanthamoeba t�rleri toprak, su ve hava gibi farklı ekolojik ortamlardan izole edilebilen ve bazı amfizoik t�rleriyle insanlarda hastalıklara yol a�an serbest yaşayan amiplerdir. �zellikle T4 genotipindeki suşlar, kontakt lens kullananlarda ve min�r kornea travmalarında Acanthamoeba keratiti (AK) olarak bilinen ve k�rl�ğe yol a�abilen enfeksiyonlara neden olmaktadır1,2. Acanthamoeba t�rlerinin, imm�n sistemi baskılanmış hastalarda kronik seyirli ve tedavi edilmediğinde �l�mc�l olabilen gran�lomat�z amibik ensefalit (GAE)'lere neden olabildiği de bilinmektedir. Bununla birlikte bazı artrit ve rinosin�zit olgularında, hatta k�tan�z apse ve nod�llerde de Acanthamoeba t�rlerinin etiyolojik ajan olarak tanımlandığı rapor edilmiştir3.

G�n�m�zde Acanthamoeba enfeksiyonları i�in kesinleşmiş, standart tedavi uygulamaları bulunmamaktadır. AK i�in enfekte korneanın durumu, enfeksiyonun evresi, suşun patojenitesi ve klinisyen deneyimi gibi etmenler tedavide belirleyici olabilmektedir2. Parazitin kist formunun mevcut ila�lara �oğu zaman diren�li olması, agresif ve kombine ila� tedavilerini gerektirir. AK tedavisinde ilk se�enek, epitelyal debritmanı takiben polihekzametilen biguanid (%0.02'lik) ve klorheksidin (%0.02'lik) gibi katyonik antiseptikler ile propamidin izotionat gibi aromatik diamidin kombinasyonlarının topikal uygulanmasıdır. Bununla birlikte imidazol t�revi antifungaller ve neomisin gibi aminoglikozidler de AK kombine tedavilerinde tercih edilebilmektedir2,3. GAE ve diğer sistemik enfeksiyonların tedavisi i�in de tam bir konsensus bulunmamaktadır. Amphoterisin B, 5-flusitozin, s�lfadiazin, flukonazol gibi antimikrobiyaller en �ok tercih edilen ila�lar arasında sayılabilir2. AK tedavisinde, kombine ila�ların g�n i�inde sık aralıklarla uygulanma zorunluluğu ve reenfeksiyonları �nlemek i�in bir yıla kadar uzayan tedavi s�releri, hasta uyumunu zorlaştıran fakt�rlerdir. Uzayan tedavi s�re�lerinde, ilaca diren� gelişiminin yanı sıra biguanidlerin keratositler �zerine toksik etkisinin olması, tedavi başarısını azaltan diğer etkenlerdir4. Tedavideki bu t�r sorunlar nedeniyle, hem trofozoit hem de kistler �zerine etkili ve iyi tolere edilebilen ila� arayışları devam etmektedir. Hen�z standart bir tedavi şemasının olmayışı son yıllarda olduk�a pop�ler bir konu olan bitkisel kimyasallara y�nelimi artırmıştır5.

�lkemiz, farklı iklimsel koşulları ve jeomorfolojik yapısının getirdiği eşsiz coğrafi yerleşimi nedeniyle bitkisel �eşitlilik a�ısından Avrupa'nın en zengin �lkesi, d�nyanın ise �nde gelen zengin �lkeleri arasında yer almaktadır. �zellikle Lamiaceae ailesinde yer alan t�rler; analjezik, anti-inflamatuar ve diğer metabolik etkileri nedeniyle folklorik olarak sık�a kullanılan bitkilerdir. Bu grubun �yeleri, u�ucu yağlar ve diğer sekonder metabolitler bakımından zengin olmaları sebebiyle tıbbi değeri olduk�a y�ksek bitkilerdir6. Bu bitkilerden elde edilen u�ucu yağların h�cre membranlarından hızlı dif�zyonları nedeniyle antimikrobiyal etkinliklerinin, ekstrelere g�re daha fazla olabildiği belirtilmektedir7. Ayrıca u�ucu yağ bileşenlerinin ortamdaki besin maddelerinin alımını engelleyebildiği, h�cre zarının yapısını değiştirebildiği, n�kleer ve ribozomal seviyede enzim sentezini inhibe edebildiği ifade edilmiştir8. Yapılan �alışmalarda, Lamiaceae ailesine ait bitki ekstreleri ve u�ucu yağlarının antiprotozoal �zellikler g�sterebildiği saptanmış9; ancak şimdiye dek bu gruba ait u�ucu yağların Acanthamoeba t�rleri �zerine etkisinin incelendiği herhangi bir �alışmaya rastlanmamıştır. Bu �alışma, Lamiaceae ailesinde yer alan Mentha x piperita, Melissa officinalis ve Ocimum basilicum u�ucu yağlarının Acanthamoeba spp. kist ve trofozoitlerine karşı etkinliğinin araştırıldığı ilk �alışmadır.

GERE� ve Y�NTEM

U�ucu yağların eldesi

Organik k�lt�r yoluyla �retilen Mentha x piperita (nane), Melissa officinalis (oğulotu) ve Ocimum basilicum (fesleğen) bitkilerinin yapraklarında bulunan u�ucu yağlar, Ege �niversitesi Eczacılık Fak�ltesi Farmas�tik Botanik Anabilim Dalı'nda Avrupa Farmakopenisine uygun olarak Neo-Clevenger tipi distilasyon d�zeneği ile elde edildi. DMSO (Dimetils�lfoksit) i�inde homojenize edilerek 1 mg/ml stok konsantrasyonda ayarlanan u�ucu yağlar, kullanılıncaya kadar +4�C'de karanlıkta saklandı10. Test sol�syonları, kist deneyleri i�in PAS (Page's amoeba saline), trofozoit deneyleri i�in PYG (Peptone-Yeast Extract-Glucose) i�erisinde sulandırılarak hazırlandı. En y�ksek konsantrasyondaki DMSO oranı %2'yi ge�medi.

Acanthamoeba castellanii suşu

�alışmada, 2005 yılında Dokuz Eyl�l �niversitesi (DE�) Hastanesi'ne başvuran bir hastanın kornea kazıntısından elde edilen ve halen aksenik olarak DE� Tıp Fak�ltesi Parazitoloji Anabilim Dalı'nda s�rd�r�lmekte olan A.castellani suşu (Gen Bank no: EU266547) kullanıldı11. �alışma i�in gerekli etik onay DE� Girişimsel (İnvazif) Olmayan Araştırmalar Etik Kurulu Başkanlığı'ndan (Karar no: 2013/19-03) alındı.

Trofozoitler

Trofozoitler, 10 ml PYG [proteoz pepton %0.75 (w/v), maya �z�t� %0.75 (w/v) ve glukoz %1.5 (w/v)] besiyeri i�eren 25 cm2'lik k�lt�r şişelerinde, 30�C'de ink�be edilerek �retildi. Logaritmik �reme fazına (72-96 saat) ulaşan k�lt�r şişeleri buz �zerinde 3-5 dakika bekletilerek trofozoitlerin ayrılması sağlandı. Toplanan besiyeri, steril konik falkon t�plerine alındıktan sonra 750 rpm'de 10 dakika santrif�j edildi ve �st sıvı uzaklaştırıldı. Pellet �zerine steril PAS (12 mg NaCl, 0.4 mg MgSO4�7H2O, 0.4 mg CaCl2�2H2O, 14.2 mg Na2HPO4, 13.6 mg KHPO4, 100 ml steril distile suda) eklenerek iki kez yıkama işlemi ger�ekleştirildi. Dipteki pellet �zerine PYG besiyeri eklenerek son konsantrasyon 1.6x104 trofozoit/ml olacak şekilde ayarlandı.

Kistler

Acanthamoeba kistleri, trofozoitlerin, bakterisiz NNA (Non-nutrient agar) k�lt�r plaklarında, 35�C'de �� hafta ink�basyonu sonucu elde edildi. Kistlerin �retildiği NNA k�lt�r plaklarına 5-7 ml PAS sol�syonu eklenerek bist�ri yardımıyla y�zeyden dikkatli bir bi�imde kistler kaldırıldı ve 15 ml'lik falkon t�p�ne, pipet yardımı ile toplandı. Bu işlem plak y�zeyindeki t�m kistler kaldırılana kadar tekrarlandı. Falkon t�p� 2.000 rpm'de 5 dakika santrif�j edildi; �st sıvı atılarak kistlerin bulunduğu ��kelti PAS sol�syonu ile iki kere yıkandı ve kist konsantrasyonu, PAS i�inde 1.6x104 kist/ml olacak şekilde ayarlandı.

U�ucu yağların amibisidal aktivitelerinin belirlenmesi

T�m deneyler 96 �ukurlu h�cre k�lt�r� plaklarında (Corning Inc., ABD) ger�ekleştirildi. U�ucu yağ dil�syonları �zerine aynı miktarda (100 �l) kist ve trofozoit sol�syonu eklenerek, kistler i�in 40, 20, 10, 5, 2.5 ve 1.25 �g/ml'lik, trofozoitler i�in ise 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 ve 0.313 �g/ml'lik son konsantrasyonlar elde edildi. Plaklar, �zeri parafilm ile kapatıldıktan sonra 30oC'de 1, 6, 24, 48 ve 72 saat boyunca ink�be edildi. Aynı prosed�r DMSO i�eren (%2) ve i�ermeyen kist ve trofozoit kontrol �ukurları i�in de tekrarlandı. İnk�basyon s�relerinin sonunda, her �ukurdan alınan 50 �l parazit s�spansiyonu aynı miktarda %0.5'lik tripan mavisi ile karıştırıldı ve 10 dakika bekledikten sonra ışık mikroskobunda değerlendirildi12. T�m testler �� kez tekrarlandı ve her defasında canlı parazit ortalamaları hesaplandı.

İstatistiksel analiz

�alışma sonunda u�ucu yağların bitkiye, doza ve uygulama s�resine bağımlı etkisi "SPSS 15.0" istatistik programı kullanılarak değerlendirildi. Sonu�lar y�zde olarak ifade edilerek varyans analizi ile değerlendirildikten sonra Tukey testi ile karşılaştırıldı.

BULGULAR

U�ucu yağların trofozoitler �zerine amibisidal etkisi

�alışmamızda, Mentha x piperita, Melissa officinalis ve Ocimum basilicum u�ucu yağlarının, trofozoitler �zerindeki amibisidal etkilerinin doza ve zamana bağımlı olarak arttığı saptanmıştır (p< 0.05) (Şekil 1). Ocimum basilicum u�ucu yağının en y�ksek konsantrasyonda (10 �g/ml) 1. saatten itibaren, 5 �g/ml konsantrasyonda ise 24 saat ve sonrasında trofozoitlerin %100'�n� �ld�rd�ğ� izlenmiştir. Diğer konsantrasyonlarda %100 amibisidal etki olmamasına rağmen ink�basyon s�resiyle doğru orantılı olarak �ld�r�c� etkinin arttığı g�zlenmiştir. Mentha x piperita u�ucu yağı, trofozoitler �zerine en y�ksek konsantrasyonda 1. saatten itibaren etki g�stermiş ve t�m trofozoitleri �ld�rm�şt�r. 5 �g/ml konsantrasyonda ilk saatteki �ld�r�c� etki %80.75 iken, sonraki saatlerde �ld�r�c� etki %100 olarak saptanmıştır. 2.5 �g/ml konsantrasyonda saptanan amibisidal etki ise ilk saatte %43.48, 6. saatte %94.87 ve sonraki saatlerde %100 olmuştur. T�m trofozoitlerin �ld�ğ� en d�ş�k konsantrasyon ise 1.25 �g/ml'dir. En d�ş�k konsantrasyondaki bu etki sadece 72. saatin sonunda g�zlenmiştir.


Şekil 1

�alışmamızda, trofozoitler �zerine en etkili u�ucu yağın Melissa officinalis olduğu belirlenmiştir. Melissa officinalis u�ucu yağı i�in 5 �g/ml test dozunda 1. saatten itibaren %100 �ld�r�c� etkinin g�zlenmesinden dolayı, bu bitkide daha d�ş�k konsantrasyonlar (0.156-0.019 �g/ml) �alışılmıştır (Şekil 1B). Melissa officinalis u�ucu yağı i�in diğer iki bitkiden farklı olarak 1.25 ve 0.625 �g/ml konsantrasyonlarda dahi 24. saat ve sonrasında %100 �ld�r�c� etki g�zlenmiş; ancak daha d�ş�k konsantrasyonlarındaki farklılık, kontrol ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p< 0.05).

Mentha x piperita, Melissa officinalis ve Ocimum basilicum u�ucu yağlarının kendi test konsantrasyonları arasında aynı zaman dilimindeki etkileri değerlendirildiğinde, istatistiksel olarak anlamlı fark tespit edilmiştir (sırasıyla; p=0.000, p=0.000, p=0.000). Anlamlılığın hangi konsantrasyondan kaynaklandığına Tukey testi ile bakıldığında, Melissa officinalis i�in 0.313 �g/ml ve �zerindeki konsantrasyonlar arasında, Mentha x piperita i�in 2.5 �g/ml ve �zerindeki konsantrasyonlar arasında, Ocimum basilicum i�in ise sadece 5 �g/ml ile �zerindeki konsantrasyonlar arasında anlamlılık saptanmıştır (Şekil 1).

U�ucu yağların kistler �zerine amibisidal etkisi

Her bir u�ucu yağın, kistler �zerine amibisidal etkilerinin, doza ve zamana bağımlı olarak arttığı g�zlenmiştir (Şekil 2). Ancak bu etki, beklenildiği gibi, trofozoitler �zerine olan amibisidal etkiden daha d�ş�kt�r. Ocimum basilicum'un kistler �zerinde %100 �ld�r�c� etkisinin olmadığı saptanmış; 1. saatteki amibisidal etki %14.3 iken 72. saatte kistlerin sadece %63.3'�n�n �ld�ğ� izlenmiştir. Mentha x piperita u�ucu yağının, en y�ksek konsantrasyonda (40 �g/ml) kistler �zerine �ld�r�c� etkisi 1. saatte %25 iken 72. saatte %100 olarak tespit edilmiştir. En y�ksek konsantrasyondaki bu etki, Melissa officinalis i�in 1. saatte %17.1, 48. ve 72. saatlerde %100'd�r. Aynı zaman dilimindeki kistisidal �zellikler karşılaştırıldığında; Mentha x piperita test konsantrasyonları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır (p= 0.124). Ancak Melissa officinalis ve Ocimum basilicum u�ucu yağlarının her biri i�in, test konsantrasyonları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark g�zlenmiştir (sırasıyla; p= 0.000, p= 0.016). Anlamlılığın hangi konsantrasyondan kaynaklandığına Tukey testi ile bakıldığında; Melissa officinalis i�in 40 �g/ml konsantrasyon ile diğer t�m test konsantrasyonları arasında, Ocimum basilicum i�in ise sadece 2.5 ile 40 �g/ml arasında anlamlı farklılık saptanmıştır (Şekil 2).


Şekil 2

TARTIŞMA

Acanthamoeba spp. trofozoitlerinin, besince zengin, pH'nın n�tral olduğu durumlarda, uygun sıcaklık ve ozmolaritede canlılıklarını s�rd�rd�kleri bilinmektedir1. Diğer durumlarda ise, fiziksel ve kimyasal (dezenfektan, klor, antibiyotik gibi) ajanlara karşı diren�li, �ift tabakadan oluşan kist formuna d�n�şmektedirler13. Trofozoitler �zerine etkili olan ila�ların, dokudaki kist formlarına etkisinin daha az olması, kronik enfeksiyonların tedavisinde başarısızlığa neden olmaktadır. Bununla birlikte ila�ların uzun s�re kullanılması ila� direnci gelişmesine yol a�abilmekte, ayrıca hasta uyumunu g��leştirmektedir4. Tedavideki bu t�r sorunlar nedeniyle hem trofozoit hem de kistler �zerine etkili ve iyi tolere edilebilen ila� arayışları devam etmektedir.

T�rkiye, farklı coğrafi �zellikleri nedeniyle bir�ok bitki t�r�n�n gen merkezi durumundadır. Bunların başında yer alan Lamiaceae ailesine ait bitki t�rlerinin antiprotozoal �zellikte sekonder metabolitler i�erdiklerini g�steren �alışmaların yanında, bazı t�rlerinin amibisidal aktiviteye sahip olduğu da bildirilmiştir14. �alışmamızda kullandığımız bitkilerin parazitler �zerindeki etkinliğinin incelendiği �eşitli �alışmalar mevcuttur. Bu �alışmalarda; Mentha x piperita'nın Giardia, Melissa officinalis'in Leishmania ve Trypanosoma, Ocimum basilicum'un ise Plasmodium t�rleri �zerindeki etkinliği g�sterilmiştir15-17.�

Bitkisel bileşiklerin Acanthamoeba spp. �zerine etkisini araştıran �alışmalarda, sıklıkla metanol ekstrelerinin kullanıldığı g�r�lmektedir. �lkemizde de, bitkisel �z�tlerin Acanthamoeba izolatları �zerine etkisini inceleyen farklı �alışmalar rapor edilmiştir. Yapılan �alışmalara bakıldığında, farklı bitki t�rlerinin farklı dozlarda ve farklı s�relerde Acanthamoeba spp. kist ve trofozoitleri �zerine etkisi saptanmıştır12,18,19. Bununla birlikte, �alışmada kullandığımız bitkilerden Melissa officinalis dışında hi�birinin Acanthamoeba t�rlerine karşı antiparazitik aktiviteleri incelenmemiştir. Sadece bir �alışmada, Melissa officinalis bitkisinin metanol ekstresinin, A. aktiviteye sahip olduğu da bildirilmiştir castellani trofozoit ve kistleri �zerine orta d�zeyde etkili olduğunu; 32 mg/ml konsantrasyon ve 72 saat sonunda trofozoitlerin %44.3'�n�, kistlerin ise %30'unu �ld�rd�ğ� rapor edilmiştir19.

�alışmamızda, A.castellanii kistlerinin u�ucu yağlara duyarlılığı, beklendiği �zere trofozoitlerden daha d�ş�k bulunmuştur. Melissa officinalis ve Mentha x piperita u�ucu yağları i�in en y�ksek konsantrasyonda %100 �ld�r�c� etkinin g�r�ld�ğ�, buna karşın Ocimum basilicum u�ucu yağının 72 saat sonunda ve en y�ksek konsantrasyonda bile kistlerin ancak %63.3'�n� �ld�rebildiği saptanmıştır. Diğer taraftan kullanılan u�ucu yağların hepsi, trofozoitlere karşı farklı konsantrasyonlarda ve s�relerde %100 amibisidal etki g�stermiştir.

Ekolojik k�lt�r yoluyla yetiştirilen bitkilerden elde edilen ve araştırma materyali olarak kullanılan u�ucu yağların, gaz kromatografisi ve k�tle spektrofotometresi analizleri ile belirlenen kimyasal i�erikleri daha �nce yayınlanmıştır. Buna g�re; Mentha x piperita u�ucu yağının ana bileşikleri %34.18 mentol, %29.87 p-menton, %6.27 1,8 sineol, %1.19 mentil asetat ve %3.9 mentofuran; Melissa officinalis u�ucu yağının ana bileşikleri %38.7 geranial, %27.59 neral, %11.78 sitronellal ve %4.30 -karyofillen; Ocimum basilicum u�ucu yağının ana bileşikleri ise %72.6 linalool, %6.98 1,8 sineol, %4.34 geraniol ve %2.32 �jenol olarak rapor edilmiştir10,20. �alışmamızda kullandığımız u�ucu yağ bileşenlerinin b�y�k kısmını monoterpenlerin oluşturduğu g�r�lmektedir. Monoterpenlerle parazitler arasındaki ilişkiye bakıldığında; Ocimum basilicum, O.canum ve Cymbopogon citratus bitkilerinin ana bileşeni olan linalool, 1,8-sineol ve geranial'in antimalaryal ve biyosit olarak21; Cinnamomum camphora bitkisinin u�ucu yağından elde edilen linalool�n de anti-şistosomal olarak kullanılabileceği d�ş�n�lm�şt�r22.

Monoterpenlerin protozoonların yağ metabolizmasını ve sterol sentezini bozduğu y�n�nde yapılmış �alışmalar da vardır21. Acanthamoeba t�rlerinin yağ metabolizmasında monoterpenlerin etkisi �zerine yapılmış bir �alışma olmamakla birlikte, mevalonat yolağında HMG-CoA red�ktaz inhibisyonunu ger�ekleştiren statinlerin, programlanmış h�cre �l�m�n� uyararak Acanthamoeba t�rleri �zerinde etkili olduğu saptanmıştır23. Bu sebeple, �alışmada kullandığımız u�ucu yağların ve i�erdikleri monoterpenlerin kaspaz aktivitesi �zerine etkisinin araştırılmasının yerinde olacağı kanısındayız. Ayrıca Acanthamoeba'larda ergosterol ve 7-dehidrostigmasterol, trofozoit ve kist safhalarının h�cre zarı yapısında bulunan ana steroller olarak rapor edilmiştir24. Kullandığımız u�ucu yağların kist ve trofozoitler �zerine etkileri, temel bileşenleri olan monoterpenlerin sterol sentezini inhibe ederek parazitin zar yapısını bozmaları ile ilişkili olabilir.���

Uzun s�reli ila� kullanımı, insan h�crelerine toksik etki g�sterebilmektedir. Benzer şekilde, bitkisel u�ucu yağlarda da toksik ya da yan etkiler g�r�lebilmektedir. Acanthamoeba spp. kist ve trofozoitleri i�in etkili bulunan u�ucu yağların memeli h�creleri �zerine sitotoksik etkileriyle ilgili farklı sonu�lar mevcuttur. Sauter ve arkadaşlarının25 �alışmasında, Pterocaulon polystachyum bitkisinden elde edilen u�ucu yağın trofozoitler �zerine etkili olduğu, aynı zamanda memeli h�creleri �zerinde de sitotoksik etki g�sterdiği bildirilmiştir. Bu araştırıcılar bir başka �alışmada, Piper hispidinervum bitkisinden elde edilen u�ucu yağın trofozoitler �zerine etkili olduğunu, ancak memeli h�creleri i�in sitotoksik etki g�stermediğini rapor etmişlerdir26. Escobar ve arkadaşları27, Kolombiya'da Lippia t�rlerinden elde ettikleri u�ucu yağ ve ana bileşenleri, Leishmania chagasi ve Trypanosoma cruzi parazitleri �zerinde, Vero ve THP-1 memeli h�cre k�lt�rlerini kullanarak test etmişlerdir. Bu araştırıcılar, �alışmamızda en etkili u�ucu yağ olarak saptadığımız Melissa officinalis'in ana bileşenleri olan geranial ve neralinin bu �alışmada da ana bileşenler olduğunu ve T.cruzi epimastigotları, h�cre i�i amastigotlar ve L.chagasi promastigotları �zerine etkili olurken, memeli h�creleri �zerine sitotoksik etki g�stermediğini bildirmişlerdir27. Brezilya'da yapılan bir �alışmada da, bizim �alışmamızda kullandığımız Ocimum basilicum u�ucu yağının %72.6'sını oluşturan linalool�n de anti-leyşmanyal �zellikte olduğu ve memeli h�crelerine karşı sitotoksik etkisinin olmadığı saptanmıştır28.

Ana bileşenleri başka �alışmalarda memeli h�creleri �zerinde denenmiş ve sitotoksik olmadığı saptanmış olmakla birlikte, bizim �alışmamızın en b�y�k kısıtlaması, u�ucu yağların keratositler ve/veya memeli h�creleri �zerine olan toksisitesinin değerlendirilememiş olmasıdır. Zira u�ucu yağların i�eriğinde bulunan daha az miktardaki bileşenlerin antagonist etkilerinin olabileceği g�z ardı edilemez. Bu maddelerin klinik etkinliğinin test edilmesinden �nce, memeli h�creleri �zerindeki sitotoksite deneylerinin in vitro ve in vivo şartlarda mutlaka değerlendirilmesi gerekmektedir. �alışmada kullandığımız A.castellanii T4 genotipinin AK oluşumuna sebep olan başlıca t�rler arasında olduğu bilinmektedir. Bu nedenle elde edilen sonu�ların AK tedavisiyle ilgili �alışmalara ışık tutacağını, tedavinin yanı sıra yeni kontakt lens saklama sol�syonlarının �retiminde kullanılabileceğini d�ş�nmekteyiz. Bu ama�la, kistler �zerinde �ld�r�c� etkisini daha y�ksek bulduğumuz Melissa officinalis ve Mentha x piperita u�ucu yağlarının umut verici olduğu kanısındayız.

KAYNAKLAR

  1. Khan NA. Acanthamoeba: biology and increasing importance in human health. FEMS Microbiol Rev 2006; 30(4): 564-95.
  2. Lorenzo-Morales J, Khan NA, Walochnik J. An update on Acanthamoeba keratitis: diagnosis, pathogenesis and treatment. Parasite 2015; 22:10.
  3. Visvesvara GS. Amebic meningoencephalitides and keratitis: challenges in diagnosis and treatment. Curr Opin Infect Dis 2010; 23(6): 590-4.
  4. Lee JE, Oum BS, Choi HY, Yu HS, Lee JS. Cysticidal effect on Acanthamoeba and toxicity on human keratocytes by polyhexamethylene biguanide and chlorhexidine. Cornea 2007; 26(6): 736-41.
  5. Derda M, Hadaś E, Thiem B. Plant extracts as natural amoebicidal agents. Parasitol Res 2009; 104(3): 705-8.
  6. G�rdal B, K�lt�r S. An ethnobotanical study of medicinal plants in Marmaris (Muğla, Turkey). J Ethnopharmacol 2013; 146(1): 113-26.
  7. Evren M, Tekg�ler B. U�ucu yağların antimikrobiyel �zellikleri. Elektronik Mikrobiyoloji Derg 2011; 9(3): 28-40.
  8. Bo�ović M, Pirolli A, Ragno R. Mentha suaveolens Ehrh. (Lamiaceae) essential oil and its main constituent piperitenone oxide: biological activities and chemistry. Molecules 2015; 20(5): 8605-33.
  9. Anthony J-P, Fyfe L, Smith H. Plant active components-a resource for antiparasitic agents? Trends Parasitol 2005; 21(10):462-8.
  10. Esetlili B�, �obanoğlu �, Tepecik M, �zt�rk B, Ana� D. Organik şartlarda yetiştirilen nanenin (Mentha x piperita L.) verim, besin maddesi ve u�ucu yağ i�eriği. Uludağ �ni Ziraat Fak�ltesi Derg 2015; 29(1): 29-36.
  11. Ozkoc S, Tuncay S, Bayram Delibas S, et al. Identification of Acanthamoeba genotype T4 and Paravahlkampfia sp. from two clinical samples. J Med Microbiol 2008; 57(Pt 3): 392-6.
  12. Polat ZA, Vural A, Tepe B, �etin A. In vitro amoebicidal activity of four Allium species on Acanthamoeba castellanii and their cytotoxic potentials on corneal cells. Parasitol Res 2007; 101(2): 397-402.
  13. Bowers B, Korn ED. The fine structure of Acanthamoeba castellanii. J Cell Biol 2014; 41(4):786-805.
  14. Monzote L, Alarc�n O, Setzer WN. Antiprotozoal activity of essential oils. Agriculturae Conspectus Scientificus 2012; 77(4):167-75.
  15. Vidal F, Vidal JC, Gadelha APR, Lopes CS, et al. Giardia lamblia: the effects of extracts and fractions from Mentha x piperita Lin. (Lamiaceae) on trophozoites. Exp Parasitol 2007; 115(1): 25-31.
  16. Mikus J, Harkenthal M, Steverding D, Reichling J. In vitro effect of essential oils and isolated mono- and sesquiterpenes on Leishmania major and Trypanosoma brucei. Planta Med 2000; 66(4): 366-8.
  17. Inbaneson SJ, Ravikumar S, Suganthi P. In vitro antiplasmodial effect of ethanolic extracts of traditional medicinal plant Ocimum species against Plasmodium falciparum. Asian Pac J Trop Med 2012; 5(2): 103-6.
  18. Tepe B, Malatyali E, Degerli S, Berk S. In vitro amoebicidal activities of Teucrium polium and T. chamaedrys on Acanthamoeba castellanii trophozoites and cysts. Parasitol Res 2012; 110(5): 1773-8.
  19. Malatyali E, Tepe B, Degerli S, Berk S. In vitro amoebicidal activities of Satureja cuneifolia and Melissa officinalis on Acanthamoeba castellanii cysts and trophozoites. Parasitol Res 2012; 110(6): 2175-80.
  20. Tepecik M, Esetlili B�, �obanoğlu �, �i�ekli M, �zt�rk B, Ana� D. Effects of conventional and organic fertilizers on plant nutrition and essential oil components of basil. Fresenius Environmental Bulletin 2015; 23(5): 1159-65.
  21. Akono Ntonga P, Baldovini N, Mouray E, Mambu L, Belong P, Grellier P. Activity of Ocimum basilicum, Ocimum canum, and Cymbopogon citratus essential oils against Plasmodium falciparum and mature-stage larvae of Anopheles funestus s.s. Parasite 2014; 21:33.
  22. Yang F, Long E, Wen J, et al. Linalool, derived from Cinnamomum camphora (L.) Presl leaf extracts, possesses molluscicidal activity against Oncomelania hupensis and inhibits infection of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 2014; 7:407.
  23. Mart�n-Navarro CM, L�pez-Arencibia A, Sifaoui I, et al. Statins and voriconazole induce programmed cell death in Acanthamoeba castellanii. Antimicrob Agents Chemother 2015; 59(5): 2817-24.
  24. Smith FR, Korn ED. 7-Dehydrostigmasterol and ergosterol: major sterols of an amoeba. J Lipid Res 1968; 9(4): 405-8.
  25. Sauter IP, dos Santos JC, Apel MA, et al. Amoebicidal activity and chemical composition of Pterocaulon polystachyum (Asteraceae) essential oil. Parasitol Res 2011; 109(5): 1367-71.
  26. Sauter IP, Rossa GE, Lucas AM, et al. Chemical composition and amoebicidal activity of Piper hispidinervum (Piperaceae) essential oil. Industrial Crops and Products 2012; 40: 292-5.
  27. Escobar P, Milena Leal S, Herrera LV, Martinez JR, Stashenko E. Chemical composition and antiprotozoal activities of Colombian Lippia spp essential oils and their major components. Mem Inst Oswaldo Cruz 2010; 105(2): 184-90.
  28. do Socorro S Rosa Mdo S, Mendon�a-Filho RR, Bizzo HR, et al. Antileishmanial activity of a linalool-rich essential oil from Croton cajucara. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47(6): 1895-901.

İletişim (Correspondence):

Ceren Erg�den,

Dokuz Eyl�l �niversitesi Tıp Fak�ltesi,

Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı,

35340 Bal�ova, İzmir, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 232 412 4548,

E-posta (E-mail): cerenerguden@hotmail.com

Yazdır