Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2017; 51(3): 220-235

Vankomisin ve Daptomisinin Koag�laz-Negatif Stafilokok İzolatlarının Oluşturduğu
Biyofilm �zerine İn Vitro Etkisi*

In Vitro Effect of Vancomycin and Daptomycin on Biofilm Formation of
Coagulase-Negative Staphylococci Strains

Duygu Nil�fer �CAL1, İştar DOLAP�I2, Zeynep GEN�T�RK3, Alper TEKELİ2

1 Sağlık Bilimleri �niversitesi, Dışkapı Yıldırım Beyazıt Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Tıbbi Mikrobiyoloji B�l�m�, Ankara.

1 University of Health Sciences, Diskapi Yildirim Beyazit Training and Research Hospital, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

2 Ankara �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

2 Ankara University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

3 Ankara �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Biyoistatistik Anabilim Dalı, Ankara.

3 Ankara University Faculty of Medicine, Department of Biostatistics, Ankara, Turkey.

* Bu �alışma, 12. Antimikrobik Kemoterapi G�nleri (1-3 Nisan 2016, İstanbul)'nde poster olarak sunulmuştur.

�Z

Koag�laz-negatif stafilokoklar (KNS)'ın etken olarak ilk sıralarda yer aldığı kan dolaşımı enfeksiyonları (KDE) ve �oğu santral ven�z kateter kullanımı ile ilişkili olan kateter ilişkili KDE (KİKDE), antibakteriyel ve destekleyici tedavilere rağmen morbidite ve mortalitenin �nemli nedenleri arasında yer almaktadır. Bu enfeksiyonların uygun tedavilerinin yapılması i�in etken mikroorganizmaların �zelliklerinin belirlenmesi �nemlidir. Bu �alışmada, KDE ve KİKDE etkeni olan KNS t�rlerinin biyofilm oluşturma �zelliklerinin g�sterilmesi, vankomisin ve daptomisin i�in planktonik formlardaki duyarlılıklarının belirlenmesi i�in minimum inhibit�r konsantrasyonu (MİK) ve biyofilm oluşturan sesil formlarının duyarlılıklarının belirlenmesi i�in minimum biyofilm eradike edici konsantrasyon (MBEK) değerlerinin saptanması ve in vitro olarak biyofilm oluşturan izolatlarla oluşan enfeksiyonlarda bu antibiyotiklerin etkinliklerinin ortaya konulması ama�lanmıştır. �alışmada kullanılan toplam 65 KNS izolatı konvansiyonel y�ntemlerle birlikte BD Phoenix (Becton Dickinson, ABD) ve Bruker Microflex MS (Bruker Daltonics, Bremen, Almanya) sistemleriyle tiplendirilmiştir. Metisilin direnci mecA geni varlığı PCR ile araştırılarak belirlenmiş, vankomisin ve daptomisin MİK değerleri sıvı mikrodil�syon y�ntemi (daptomisin i�in 25 ve 50 μg/ml Ca++ i�eren besiyerleri ile) ile saptanmıştır. Biyofilm oluşumunun ve MBEK değerlerinin tespitinde mikroplak y�ntemi kullanılmıştır. KNS t�rleri arasındaki klonal ilişki PFGE y�ntemi ile araştırılmıştır. Değerlendirilen 26'sı kateter kolonizanı; 28'i KİKDE etkeni ve 11'i KDE etkeni olan toplam 65 izolatın, 33'� Staphylococcus epidermidis, 16'sı Staphylococcus haemolyticus, 15'i Staphylococcus hominis, biri Staphylococcus capitis olarak tiplendirilmiştir. İzolatların %81.5'i metisiline diren�li olarak saptanırken, hepsi vankomisin (MİK= 0.125-4 μg/ml) ve daptomisine (25 μg/ml Ca++ i�eren besiyerinde MİK= 0.062-0.50 μg/ml; 50 μg/ml Ca++ i�eren besiyerinde ise MİK= 0.031-0.25 μg/ml) duyarlı bulunmuştur. Daptomisin i�in 50 μg/ml Ca++ i�eren besiyerinde MİK değerleri daha d�ş�k saptanmıştır (p< 0.001). Daptomisinin etkinliğinin, bu antibakteriyelin yapısında konformasyonel değişikliklere neden olan Ca++'nin fizyolojik seviyelerine bağlı olduğu bilinmektedir. �alışmamızda elde edilen bulguda daptomisinin etkinliğinin en iyi d�zeyde olması i�in y�ksek Ca++ d�zeylerine ihtiya� olduğu y�n�nde yorumlanmıştır. İzolatların tamamı [(12 (%18.5)'si zayıf, 35 (%53.8)'i orta, 18 (%27.7)'i g��l� pozitif)] biyofilm oluşturmuştur. Vankomisinin MBEK ve MBEK/MİK değerleri daptomisine g�re y�ksek saptanmıştır (p< 0.001). Kuvvetli biyofilm oluşturan izolatların MBEK ve MBEK/MİK değerlerinin daha y�ksek olduğu g�r�lm�şt�r (p< 0.05). �zellikle biyofilm oluşturan izolatlarla meydana gelen enfeksiyonlarda, sadece MİK değerinin saptanması planktonik formdaki bakterilerin duyarlılığını yansıttığından biyofilm ilişkili enfeksiyonların tedavisinde her zaman yeterli olmamaktadır. �alışmamızda elde edilen y�ksek MBEK değerleri, MİK ve MBEK değerleri arasındaki uyumsuzluk ve MBEK/MİK, MBEK50/MİK50 ve MBEK90/MİK90 oranlarının y�ksekliği bu �ng�r�y� desteklemektedir. Daptomisinin MBEK ve MBEK/MİK değerlerinin vankomisinin aynı değerlerine g�re daha d�ş�k saptanması, biyofilm ilişkili enfeksiyonların tedavisinde vankomisine g�re daha d�ş�k dozlarda etkin olabileceğini d�ş�nd�rm�şt�r.

Anahtar s�zc�kler: Koag�laz-negatif stafilokoklar; biyofilm; vankomisin; daptomisin; minimum biyofilm eradike edici konsantrasyon (MBEK).

ABSTRACT

Coagulase-negative staphylococci (CNS) are one of the primer agents of blood stream infections (BSI) and catheter-related bloodstream infections (CR-BSI) which are associated mostly with the usage of central venous catheters and, important causes of morbidity and mortality despite the usage of antibacterial and supportive treatment. It is important to determine the properties of these causative microorganisms in order to make appropriate treatment of such infections. The aims of our study� were to evaluate the biofilm formation of coagulase negative staphylococci (CNS) which were causative agents of bloodstream (BSI) and catheter related bloodstream infections (CR-BSI), to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of planktonic forms and minimal biofilm eradication concentration (MBEC) of sessile forms for vancomycin and daptomycin and to evaluate the efficacy of these antibiotics in infections with biofilm-forming isolates in vitro. A total of 65 CoNS (n= 26 catheter colonizers, n= 28 CR-BSI, n= 11 BSI agents) were identified by conventional methods and also with BD Phoenix (Becton Dickinson, USA) and Bruker Microflex MS (Bruker Daltonics, Germany) systems. Methicillin resistance was determined by the presence of mecA gene with PCR. MIC values of vancomycin and daptomycin were investigated by broth microdilution, for daptomycin medium containing 25 and 50 μg/ml Ca++ were used. Assessment of biofilm formation and detection of MBEC were determined by microplate method. The clonal relationship was investigated by the PFGE method. A total of 65 isolates; 26 catheter colonizers, 28 CR-BSI agents and 11 BSI agents were evaluated and� identified as Staphylococcus epidermidis (n= 33), Staphylococcus haemolyticus (n= 16), Staphylococcus hominis (n= 15), and Staphylococcus capitis (n= 1). 81.5% of the isolates were found to be methicillin resistant and all of them were found to be sensitive to vancomycin (MIC= 0.125-4 μg/ml) and daptomycin (MIC= 0.062-0.25 μg/ml in 25 μg/ml Ca++ and MIC= 0.031-0.50 μg/ml in 50 μg/ml Ca++ containing medium). MIC values were lower in medium containing 50 μg/ml Ca++ for daptomycin. As it is known that the efficacy of daptomycin depends on the physiological levels of Ca++, which causes conformational changes in the structure of these antibacterials. Our findings also suggested that high levels of Ca++ are needed to ensure the efficacy of daptomycin. All of the isolates produced biofilm at different strengths of positivity (n= 12/18.5% weak, n= 35/%53.8 moderate, n= 18/%27.7 strong). MBEC and MBEC/MIC values for vancomycin were found to be higher than daptomycin (p< 0.001). Strong biofilm producers had higher MBEC and MBEC/MIC, MBEC50/MIC50 ve MBEC90/MIC90 values (p< 0.05). Especially in infections with biofilm forming isolates, the detection of only MIC values are not always sufficient in the treatment of biofilm-related infections� as they reflect the sensitivity of planktonic bacteria. The inconsistency between the MIC and MBEC values and the high rates of MBEC/MIC found in our study supported this prediction.The lower detection of MBEC and MBEC/MIC values of daptomycin compared to the same values of vancomycin suggested that daptomycin might be effective at lower doses than vancomycin in the treatment of biofilm infections.

Keywords: Coagulase-negative staphylococci; biofilm; vancomycin; daptomycin; minimal biofilm eradication concentration (MBEC).

Geliş Tarihi (Received): 29.03.2017 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 24.06.2017

GİRİŞ

G�n�m�zde nozokomiyal enfeksiyon etkenleri arasında �nemli yeri olan heterojen bir grup olan koag�laz-negatif stafilokoklar (KNS), cilt y�zeylerinde kolonizasyonlarını, biyofilm oluşturmalarını, dokulara ve protez y�zeylerine adezyonlarını kolaylaştıran belirleyiciler ve imm�n sistemden sakınmayı i�eren �eşitli vir�lans fakt�rleri i�ermektedir1.

KNS'lerin etken olarak ilk sıralarda yer aldığı kan dolaşımı enfeksiyonları (KDE) ve kateter ilişkili enfeksiyonlar, antibakteriyel ve destekleyici tedavilere rağmen morbidite ve mortalitenin �nemli nedenlerindendir ve bu nedenle erken tanı ve uygun tedavilerinin yapılması �nemlidir2. Kateter ilişkili KDE (KİKDE)'nin �oğu santral ven�z kateter (SVK) kullanımı ile ilişkilidir ve sıklıkla yoğun bakım �nitelerinde takip edilen hastalarda g�r�lmektedir. KİKDE, ateş, �ş�me, titreme ve/veya hipotansiyon gibi enfeksiyon bulguları olan ve KDE'yi a�ıklayacak, kateter dışında bir odağı bulunmayan hastada, "kateter k�lt�r�nde (semikantitatif k�lt�rde > 15 kob veya kantitatif k�lt�rde > 103 kob) ve periferik kanda benzer biyotip ve antibiyotik duyarlılığına sahip mikroorganizmanın izole edilmesi" veya "aynı anda alınmış kantitatif kan k�lt�rlerinde, kateter i�i kan k�lt�r�ndeki �reme oranının periferik kan k�lt�r�ndekine g�re en az beş kat fazla olması" veya "aynı anda alınmış kateter i�i kan k�lt�r�nde, periferik kan k�lt�r�nden en az iki saat �nce �reme olması" şeklinde tanımlanmaktadır3,4.

Stafilokoklarda metisilin direnci ciddi bir problem olarak karşımıza �ıkmakta ve metisiline diren�li stafilokokların etken olduğu �eşitli enfeksiyonların tedavisinde glikopeptidler ilk sırada kullanılan ajanlar olarak yer almaktadır5. Streptomyces orientalis'ten elde edilen vankomisin, bir h�cre duvarı bileşeni olan peptidoglikanın D-alanil-D-alanin ucuna bağlanarak transpeptidasyon basamağını inhibe ederek h�cre duvar sentezini engellemektedir6. Daptomisin ise Streptomyces roseosporus tarafından �retilen doğal siklik lipopeptittir ve KNS'lerin etken olduğu bakteriyemi, endokardit ve KİKDE tedavisinde iyi bir se�enek olarak kullanılmaktadır5,7-9.

�alışmamızda KDE ve KİKDE etkeni olan KNS izolatlarının biyofilm oluşturma �zelliklerinin ortaya konulması hedeflenmiştir. Sonrasında biyofilm oluşturan izolatlar se�ilerek vankomisin ve daptomisin ile karşı karşıya bırakılmıştır. İzolatların planktonik formlardaki duyarlılıklarının belirlenmesi amacıyla minimum inhibit�r konsantrasyonu (MİK) değerleri, biyofilm oluşturan sesil formlarının duyarlılıklarının belirlenmesi i�in ise minimum biyofilm eradike edici konsantrasyon (MBEK) değerleri saptanmıştır. B�ylece, in vitro olarak biyofilm oluşturan izolatlarla oluşan enfeksiyonlarda bu antibiyotiklerin etkinliklerinin ortaya konulması ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

Bu �alışma, Ankara �niversitesi Tıp Fak�ltesi Klinik Araştırmalar Etik Kurulu tarafından onaylandı (Karar no: 21-680-12).

Bakteri İzolatları� ve Tanımlanması

2012-2014 yılları arasında Ankara �niversitesi İbni Sina Hastanesi Merkez Laboratuvarı Bakteriyoloji birimine g�nderilen klinik �rneklerden izole edilen ve biyofilm oluşturduğu saptanan KNS'ler �alışmaya dahil edildi. �alışmamızda SVK ve periferik kan k�lt�rlerinden �retilen ve 26 (%40)'sı kateter kolonizanı, 28 (%43.1)'i KİKDE etkeni ve 11 (%16.9)'i KDE etkeni olarak tanımlanan toplam 65 KNS değerlendirildi.

SVK'lardan bakteri izolasyonunda %5'lik koyun kanlı agar, Eosin Methylene Blue (EMB) agar ve �ikolata agar besiyerleri kullanılarak, semikantitatif ve tam kantitatif k�lt�r y�ntemi uygulandı10. 24-48 saatlik ink�basyon sonunda semikantitatif y�ntemde ≥ 15 kob, tam kantitatif k�lt�r y�nteminde ise� ≥ 10� kob bakteri �remesi pozitif �reme olarak kabul edildi. Semikantitatif veya kantitatif k�lt�r sonucunda bakteri �remesi ve eşzamanlı alınan periferik kan k�lt�r�nde de aynı bakterinin izole edilmesi (�reme saatleri arasında farklar g�zetilerek) ve klinik olarak sepsis belirtilerinin bulunması durumunda izole edilen KNS; KİKDE etkeni olarak tanımlandı11. Eşlik eden klinik semptomlar yokken, semikantitatif veya kantitatif y�ntemle kateter ucu veya kateter hubundan yapılan ekimde bakteri �remesi, buna karşın periferik kan k�lt�r�nde �reme olmaması durumunda izole edilen KNS; kateter kolonizanı olarak değerlendirildi11.

Kan k�lt�rleri, BACTEC 9050 (Becton Dickinson, Maryland, ABD) otomatik kan k�lt�r� cihazında ink�be edildi, alarm veren şişelerden hazırlanan Gram boyalı preparatlar değerlendirildikten sonra %5'lik koyun kanlı agar, EMB ve �ikolata agar besiyerlerine ekim yapıldı. İki veya daha fazla sette aynı t�r �reme olması durumunda, klinik olarak ateş, titreme hipotansiyon bulgularından birinin varlığıyla birlikte izole edilen mikroorganizma etken olarak kabul edildi12.

İzolatların tiplendirilmesinde konvansiyonel y�ntemler ile birlikte BD Phoenix (Becton Dickinson, ABD) ve Bruker Microflex MS (Bruker Daltonics, Bremen, Almanya) otomatize sistemleri kullanıldı.

Metisilin Direncinin Belirlenmesi

Metisilin direncinin saptanmasında polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) y�ntemi ile mecA geni varlığı araştırıldı. Bu ama�la, DNA izolasyon kiti (Fermentas, Litvanya) kullanılarak, �retici firmanın �nerileri doğrultusunda ekstrakte edilen DNA'lar mecA �(F: 5'-GTA GAA ATG ACT GAA CGT CCG ATA A-3';� R: 5'-CCA ATT CCA CAT TGT TTC GGT CTA A-3') primerleri kullanılarak, Geha ve arkadaşlarının13 y�ntemi temel alınarak g�sterildi.

Antibiyotik Duyarlılık Testleri

KNS izolatlarının antibiyotik duyarlılıklarının saptanmasında Kirby-Bauer disk dif�zyon y�ntemi kullanıldı. Amoksisilin-klavulanik asit (20/10 μg), eritromisin (15 μg), klindamisin (2 μg), rifampisin (5 μg), tetrasiklin (30 μg), gentamisin (10 μg), trimetoprim-s�lfametoksazol (1.25/23.75 μg), teikoplanin (30 μg) ve linezolid (30 μg) duyarlıkları araştırıldı. Zon �apları "Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)" �nerileri doğrultusunda değerlendirildi14.

Vankomisin ve Daptomisin Minimum İnhibit�r Konsantrasyonu (MİK) Değerlerinin Saptanması

Vankomisin (Sigma Aldrich, ABD)� ve daptomisin (Sigma Aldrich, ABD)� i�in sıvı mikrodil�syon y�ntemi ile MİK saptanması CLSI M27-A3 standartlarına g�re yapıldı15. Daptomisin i�in son konsantrasyonları 25 ve 50 �g/ml Ca++ olacak şekilde katyon ilave edilen iki ayrı Mueller-Hinton Buyyon (MHB) II� (BBLTM, Becton Dickinson, ABD) besiyeri kullanıldı. Kontrol suşu olarak Staphylococcus aureus ATCC 29213 kullanıldı. Hazırlanan mikroplaklar 35�C'de 24 saat s�re ile ink�be edildi ve ertesi g�n her sırada �remenin olmadığı ilk kuyucuk MİK değeri olarak belirlendi. Bu test her izolat i�in �� kez tekrarlandı.

Biyofilm Oluşumunun G�sterilmesi

İzolatların biyofilm oluşturma �zellikleri mikroplak y�ntemi ile kantitatif olarak g�sterildi. Bulanıklığı 0.5 McFarland (108 kob/ml) standardında ayarlanan bakteri s�spansiyonlarına, %1 glukoz ilave edildi 180 μl triptik soy buyyon i�eren d�z tabanlı mikroplak kuyucuklarına dağıtıldı ve 24 saat s�re ile 35�C'de ink�basyona bırakıldı. Ertesi g�n fosfat tamponlu tuz ��zeltisi ile yıkanarak tutunmayan bakteriler uzaklaştırıldı, plaklar kurutuldu ve metanol ile biyofilm oluşturan bakterilerin fiksasyonu sağlandı. Kristal viyole ile boyanan mikrokuyucuklara, %95'lik etanol konularak,� absorbansları spektrofotometrede 570 nm dalga boyunda okutuldu16. Sadece besiyeri i�eren kuyucukların optik dansitometrelerinin ortalaması alındı ve �� standart derivasyonu hesaplanarak cut-off (ODC) değeri belirlendi. OD ≤ Odc: negatif,� ODc < OD ≤ 2 x ODc: zayıf, 2 x ODc < OD ≤ 4 x ODc: orta ve 4 x ODc < OD: g��l� d�zeyde biyofilm oluşumu şeklinde yorumlandı16.

Minimum Biyofilm Eradike Edici Konsantrasyonu (MBEK)'nun Belirlenmesi

Biyofilm oluşturduğu g�sterilen izolatların hepsinde vankomisin ve daptomisinin MBEK değerleri belirlendi. İlk olarak izolatların 96 kuyucuklu d�z tabanlı mikroplaklarda biyofilm oluşturmaları sağlandı, sonrasında kuyucuklara azalan konsantrasyonlarda vankomisin ve daptomisin (128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 ve 0.125 �g/ml) ilave edildi. Plaklar 24. saat sonunda spektrofotometrede 570 nm dalga boyunda okutulmuş ve optik yoğunluklarına g�re değerlendirildi. Her sırada ODc değerinin altındaki değer veren ilk kuyucuktaki ila� konsantrasyonu, o ila� i�in MBEK değeri olarak belirlendi17. MBEK saptanmasında vankomisin i�in MHBII,� daptomisin i�in 50 �g/ml Ca++� i�eren MHBII kullanıldı15.

Biyofilm oluşumu g�sterilmesi ve MBEK hesaplanması deneylerinde pozitif kontrol olarak S.aureus ATCC 25923 ve Staphylococcus epidermidis ATCC 35984, negatif kontrol olarak S.aureus ATCC 29213 standart suşları, sterilite kontrol� i�in sadece besiyeri i�eren, bakteri ilave edilmemiş kuyucuklar kullanılmıştır. Her deney �� kez tekrarlanmış ve ortalamaları alınmıştır.

Değişken Alanlı Jel Elektroforezi� (Pulsed Field Gel Electrophoresis-PFGE)

KNS t�rleri arasındaki klonal ilişki Mulvey ve arkadaşlarının18 geliştirdiği y�ntem ile araştırıldı. Elde edilen DNA paternleri "Gene Directory Programme (Syngene, UK)" programı kullanılarak incelendi. İzolatlar arası ilişkinin değerlendirilmesinde; benzerlik indeksi "Dice" katsayısı, %1 tolerans değeri ve aritmetik ortalamalı ağırlıksız �ift grup y�ntemi (Unweighted Pair Group Method of Arithmetic Averages-UPGMA) y�ntemi kullanıldı19.

İstatistiksel Analiz

Verilerin analizi SPSS for Windows 15 paket programında yapıldı. Tanımlayıcı istatistikler dağılımı normal olan değişkenler i�in ortalama � standart sapma, dağılımı normal olmayan değişkenler i�in median (min-maks) olarak g�sterildi.

Gruplar arasında ortalamalar y�n�nden farkın �nemliliği ANOVA (varyans analizi) testi ile ortanca değerler y�n�nden farkın �nemliliği Kruskal Wallis ile araştırıldı. Nominal değişkenler Pearson ki-kare veya Fisher Exact-testi ile değerlendirildi.� p< 0.05 i�in sonu�lar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

BULGULAR

�alışma kapsamındaki 65 KNS'nin; 26 (%40)'sı kateter kolonizanı, 28 (%43.1)'i KİKDE etkeni, 11 (%16.9)'i KDE etkeni olarak izole edilmiştir. İzolatların 33 (%50.8)'� S.epidermidis; 16 (%24.6)'sı Staphylococcus haemolyticus; 15 (%23.1)'i Staphylococcus hominis, 1 (%1.5)'i Staphylococcus capitis olarak tanımlanmıştır (Tablo I).


Tablo I

PCR y�ntemiyle izolatların %81.5'i (%38.5 S.epidermidis, %24.5 S.haemolyticus, %18.5 S.hominis) mecA pozitif, %18.5'i (%12.4 S.epidermidis, %4.6 S.hominis, %1.5 S.capitis) mecA negatif olarak saptanmıştır. Kateter kolonizanı olarak tespit edilen KNS'lerin %76.9 (20/26)'u; KİKDE etkeni olarak saptanan KNS'lerin %78.6 (22/28)'sı; KDE etkeni olarak saptanan KNS'lerin t�m�n�n mecA geni taşıdığı saptanmıştır (Tablo I).

S.epidermidis, S.haemolyticus, S.hominis ve S.capitis izolatlarının antibiyotik diren� oranları Tablo II'de g�sterilmiştir. �alışmadaki b�t�n izolatlar teikoplanin ve linezolide karşı duyarlı olarak saptanmıştır.


Tablo II

Sefoksitin diski ile diren� saptanan KNS suşları amoksisilin-klavulanik asite de diren�li olarak kabul edilmiştir14.

İzolatların biyofilm oluşturma kuvvetlerinin belirlenmesinde elde edilen cut-off değeri esas alınmış (ODC: 0.28) ve 12 (%18.5)'sinin zayıf, 35 (%53.8)'inin orta, 18 (%27.7)'inin g��l� pozitif biyofilm oluşturduğu bulunmuştur (Tablo III). İzolatların oluşturdukları biyofilm derecesi ile etken olarak tanımlandıkları klinik �rnek arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki kurulamamıştır (p> 0.05).


Tablo III

�alışmadaki izolatların t�m� vankomisin ve daptomisine duyarlı bulunmuştur. Vankomisin MİK değerleri 0.125-4 �g/ml, daptomisin MİK değerleri 25 �g/ml Ca++ i�eren besiyerinde 0.062-0.50 �g/ml, 50 �g/ml Ca++ i�eren besiyerinde ise 0.031-0.25 �g/ml arasında saptanmıştır.� 50 �g/ml Ca++ i�eren MHBII besiyerinde daptomisin i�in MİK değerleri daha d�ş�k bulunmuştur (p< 0.001). Daptomisin MİK değerlerinin saptanmasında CLSI �nerisi 50 �g/ml Ca++ i�eren MHBII besiyeri olduğundan ve sonu�larımız daha d�ş�k Ca++ konsantrasyonunda MİK değerinin d�şt�ğ�n� g�stermediğinden, daptomisin MBEK değerinin saptanmasında bu konsantrasyon ile �alışılmıştır.

MBEK değerinin saptanmasında kullanılacak ODC; her iki antibiyotik i�in ayrı ayrı (vankomisin i�in: 0.45; daptomisin i�in: 0.49) belirlenmiştir. İzolatların MBEK değerleri; vankomisin i�in 2-64 �g/ml, daptomisin i�in 0.062-1 �g/ml arasında saptanmıştır (Tablo IV). Biyofilm oluşturma g�c� y�ksek olan izolatlar i�in her iki antimikrobiyalin de MBEK değerlerinin daha y�ksek olduğu g�r�lm�şt�r (vankomisin i�in p= 0.05; daptomisin i�in p= 0.029).


Tablo IV

İzolatların biyofilm oluşturan formları ile sesil formlarının antibiyotiklere karşı duyarlılıklarındaki farklılıkları araştırmak i�in MBEK/MİK oranları değerlendirilmiştir. Vankomisin i�in MBEK/MİK değerleri 1-128; daptomisin i�in ise 1-16 arasında bulunmuştur (Şekil 1, 2). Vankomisinin MBEK/MİK değerleri, daptomisinin MBEK/MİK değerlerinden y�ksek olarak saptanmıştır (p< 0.001). Zayıf biyofilm oluşturan izolatlarda MBEK/MİK oranı d�ş�kken, kuvvetli biyofilm oluşturan izolatlarda bu oranın y�kseldiği g�r�lm�şt�r (vankomisin i�in p= 0.006; daptomisin i�in p= 0.049) (Şekil 1,2). KİKDE ve KDE etkenlerinde, kolonizan izolatlara g�re her iki antimikrobiyalin de MBEK/MİK oranlarının y�ksekliği anlamlı bulunmuştur (p< 0.05).


Şekil 1

Şekil 2

İzolatların %50 ve %90'ının oluşturduğu biyofilmin eradike edilebilmesi i�in gerekli en d�ş�k ila� değeri ile (sırasıyla MBEK50 ve MBEK90) ile izolatların %50 ve %90'ının �lebilmesi i�in gerekli en d�ş�k ila� konsantrasyonunun (sırasıyla MİK50 ve MİK90) karşılaştırılması sonucunda, vankomisin i�in MBEK50 değerinin 1-8 kat, MBEK90 değerinin 1-16 kat; aynı değerlerin daptomisin i�in sırasıyla 0-4 kat ve 0-8 kat y�ksek olduğu saptanmıştır.

PFGE dendrogramları S.epidermidis i�in Şekil 3'te, S.haemolyticus i�in Şekil 4'te ve S.hominis i�in Şekil 5'te verilmiştir. Periferik kan k�lt�r�nden izole edilen bir S.epidermidis ve kateter kolonizanı bir S.hominis izolatı istenilen sayıda enzim kesim �r�n� vermediğinden değerlendirme dışı bırakılmıştır. PFGE sonu�ları yorumlandığında aynı hastaların SVK �rnekleri ve kanlarından KİKDE etkeni olarak izole edilen suşların %100 benzer patern oluşturduğu g�zlemlenmiş, diğer izolatlar arasında klonal ilişkinin olmadığı g�r�lm�şt�r.


Şekil 3

Şekil 4

Şekil 5

TARTIŞMA

KNS'lerin etken oldukları enfeksiyonların tedavilerinde klinik �rnekten izole edilen KNS'lerin t�rlerinin belirlenmesinin �nemli olduğu belirtilmektedir20-22. �alışmamızda kullanılan izolatların, 33 (%50.8)'� S.epidermidis, 16 (%24.6)'sı S.haemolyticus; 15 (%23.1)'i S.hominis ve biri (%1.5) S.capitis olarak tanımlanmıştır. �lkemizde yapılan �alışmalarda, klinik �rneklerden S.epidermidis izole edilme oranı %36-49 arasında bildirilmektedir20-22. İkinci ve ���nc� sıklıkta izole edilen KNS t�rlerini sırasıyla; G�zel ve arkadaşları20 %39 S.haemolyticus ve %5 S.hominis, �ift�i ve arkadaşları21 %42 S.hominis ve %9 S.haemolyticus olarak belirtmiştir. �alışmamızda sıralanan KNS t�rleri �lkemizde yapılan �alışmalarla uyumlu bulunmuştur.

Stafilokoklarda metisiline karşı gelişen diren�, oluşturdukları enfeksiyonların tedavisinde başarısızlığın en �nemli nedenlerinden biridir. �alışmamızda incelenen 65 KNS i�inde; kateter kolonizanı olanların %76.9 (20/26)'u; KİKDE etkeni olanların %78.6 (22/28)'sı; KDE etkeni olanların %100'� metisiline diren�li (mecA pozitif) olarak saptanmıştır. T�m KNS'lerde metisiline diren� oranı ise %81.5 olarak tespit edilmiştir. KNS'lerde metisiline diren� oranlarını G�zel ve arkadaşları20 %37.5, Akpaka ve arkadaşları23 %45.1, Khorsed ve arkadaşları24 %66.7, �ift�i ve arkadaşları21 %82.2 olarak bulmuşlardır. Yılmaz ve arkadaşları22 da metisiline diren� oranını, hastane enfeksiyonu etkeni olan KNS'lerde %100, hastane enfeksiyonu etkeni olmayan KNS'lerde %67 olarak saptamıştır. �alışmamızda elde edilen y�ksek metisiline diren� oranı; izolatlarımızın yarısından fazlasının enfeksiyon etkeni (%43.1 KİKDE, %16.9 KDE) olmasına bağlanmış ve son yıllarda KNS'lerde g�r�len metisiline diren� artışından kaynaklandığı d�ş�n�lm�şt�r. PFGE sonu�larına g�re izolatlar arasında klonal ilişkinin olmaması, bu bulguyu daha değerli kılmaktadır.

Metisiline diren�li stafilokok enfeksiyonlarında tedavide ilk se�enek glikopeptitler olduğu i�in �alışmamızda vankomisinin MİK ve MBEK değerleri �l��lm�şt�r5. İzolatların MİK değerleri 0.125-4 �g/ml arasında saptanarak, vankomisine duyarlı oldukları bulunmuştur. KNS'lerde vankomisin duyarlılığının �eşitli y�ntemler (gradiyent test, otomatize y�ntemler, sıvı mikrodil�syon) kullanılarak araştırıldığı bir�ok �alışmada da vankomisine diren�li KNS saptanmamıştır2,21,24.

Biyofilm ile ilişkili enfeksiyonlarda antibiyotiklerin �zellikle de vankomisin gibi b�y�k molek�l yapısına sahip olanların biyofilmin i�ine ge�işinin zorluğu nedeniyle tedavide g��l�klerle karşılaşılmaktadır. �alışmamızda vankomisinin MBEK değerlerindeki (2-64 �g/ml) y�kseklik bu bulguyu destekler nitelikte bulunmuştur. �eşitli �alışmalarda biyofilm ilişkili enfeksiyonlarda antibiyotiklere direncin 10-1000 kat arttığı g�sterilmiştir25-28.

Biyofilm oluşturan izolatlarla meydana gelen enfeksiyonlarda daptomisinin daha iyi bir tercih olabileceğini bildiren bazı �alışmalardan29,30 yola �ıkılarak ayrıca �alışmamızdaki y�ksek vankomisin MBEK ve MBEK/MİK değerlerine dayanılarak daptomisin i�in de MİK ve MBEK �l��mleri yapılmıştır. Daptomisinin etkinliğinin, bu antimikrobiyalin yapısında konformasyonel değişikliklere neden olan Ca++'nin fizyolojik seviyelerinin varlığına bağlı olduğu bildirilmiştir31. Bu nedenle daptomisin i�in MİK değerinin belirlenmesinde değişik Ca++ oranı (25 ve 50 �g/ml) i�eren MHBII besiyerleri kullanılmıştır. İzolatlarımızın t�m� daptomisine duyarlı bulunmakla birlikte,50 μg/ml Ca++ i�eren MHBII besiyerinde MİK değerleri daha d�ş�k bulunmuştur (p< 0.001). Bu bulgu daptomisinin etkinliğinin en iyi d�zeyde olması i�in y�ksek Ca++ d�zeylerine ihtiya� olduğu y�n�nde yorumlanmıştır.

�alışmamızdaki izolatların 12 (%18.5)'sinin zayıf, 35 (%53.8)'inin orta, 18 (%27.7)'inin g��l�� olmak �zere tamamının biyofilm oluşturduğu tespit edilmiştir. SVK �rneklerinden izole edilen 82 KNS'nin biyofilm oluşturma �zelliklerinin incelendiği bir �alışmada; %20.7'sinin biyofilm oluşturmadığı, %20.7'sinin g��l�, %29.3'�n�n orta ve %29.3'�n�n zayıf biyofilm oluşturduğu saptanmış ve kateter ilişkili enfeksiyon ile karşılaşıldığında biyofilm oluşumundan ş�phelenmek gerektiği vurgulanmıştır17.

�alışmamızda g��l� biyofilm oluşturan izolatların, zayıf biyofilm oluşturanlara g�re her iki antibiyotik i�in de MBEK değerlerinin daha y�ksek olduğu g�r�lm�şt�r (vankomisin i�in p= 0.05; daptomisin i�in p= 0.029). MBEK/MİK oranları vankomisin i�in 1-128; daptomisin i�in 1-16 değerleri arasında bulunarak, vankomisin MBEK/MİK değerlerinin daptomisininkinden y�ksek olduğu saptanmıştır (p< 0.001). Literat�rde bulgularımızı destekler nitelikte biyofilm oluşumu ile MBEK değeri arasında benzer sonu�lar elde eden ve vankomisinin MBEK/MİK oranının d�ş�k olduğunu g�steren �alışmalar yer almaktadır17,32. �alışmamızda her iki ila� i�in de MBEK50 ve MBEK90 değerlerinin MİK50 ve MİK90 değerleri ile karşılaştırılması sonucunda da aynı bulgular elde edilmiştir.

MBEK ya da MBEK/MİK oranının g��l� biyofilm �reten izolatlarda daha y�ksek değerlerde bulunması, bu izolatlarda biyofilm tabakasının kalınlığı nedeniyle vankomisin dif�zyonunun daha zor olmasıyla a�ıklanmaktadır17. Stafilokokların oluşturduğu biyofilmlerdeki bakteri miktarını vankomisin ve linezolidin azalttığı, ancak bu antimikrobiyallerin y�ksek konsantrasyonlarda uygulanmasına rağmen, biyofilm oluşumunu tamamen �nleyemediklerini g�steren �alışmalar da bulunmaktadır28,33.

S.aureus ve S.epidermidis izolatlarında; linezolid, vankomisin, kinupristin/dalfopristinin MİK ve MBEK değerlerinin karşılaştırıldığı El-Azizi ve arkadaşlarının34 �alışmasında; biyofilm i�indeki bakterilerin plaktonik ve biyofilmden kopan bakterilere kıyasla antimikrobiyallere karşı daha fazla diren�li olduğu bulunmuştur. Kinupristin/dalfopristin biyofilmden kopan bakterilere karşı en etkili antibiyotik olarak bulunurken, vankomisin 500 ve 1000 μg/ml gibi y�ksek dozlarda uygulandığında metisiline diren�li S.aureus (MRSA) ve  S.epidermidis  biyofilmlerine etki g�sterirken, metisiline duyarlı S.aureus (MSSA)'ların oluşturduğu biyofilmlere karşı etkili olmamıştır34.

�alışmamızdaki izolatların tamamı vankomisin ve daptomisine duyarlıdır ancak her iki antibiyotiğinde MBEK değerlerindeki y�kseklik dikkat �ekicidir. Bulgularımız ile uyumlu olarak, antimikrobiyallerin hem S.aureus hem de S.epidermidis'in yol a�tığı 24 saatlik biyofilm �zerine etkili olabilmesi i�in planktonik formdaki bakterileri �ld�ren dil�syonların, hem daptomisin hem de vankomisin i�in 1-4 kat artırılması gerektiği bildirilmektedir7. �zellikle daptomisinin S.epidermidis'in oluşturduğu kalın biyofilm tabakasından hızla penetre olması nedeniyle, biyofilm oluşumunun g�r�lmesinin y�ksek muhtemel olduğu katetere bağlı enfeksiyonlarda değerlendirilmesi gerektiği bildirilmektedir35.

Sonu� olarak, enfeksiyon tanısı ile birlikte genellikle ampirik tedaviye başlandığından ampirik tedavide kullanılacak uygun antibiyotiğe karar verilmesi �nem taşımaktadır. Bu antibiyotiğin se�ilmesinde; kateter ilişkili enfeksiyona sebep olan etken ve bu etkenin vir�lans �zellikleriyle birlikte antibiyotik diren� profili hastalığın prognozunu belirleyen en �nemli unsurlar olmaktadır. �alışmamızda kullanılan antibiyotiklerin MBEK/MİK oranlarının y�ksekliği dikkat �ekici bir bulgudur. Bu sonuca g�re biyofilm ilişkili enfeksiyonlarda, mikroorganizmanın duyarlılığını saptamak a�ısından sadece MİK değeri saptanmasının her zaman yeterli olamayacağı ve tedavide daha y�ksek dozlara �ıkılmasının gerektiği s�ylenebilir. Buna bağlı olarak, MBEK/MİK oranlarının vankomisine g�re daha d�ş�k olması nedeniyle, biyofilm oluşturan KNS izolatlarının etken olduğu kateter ilişkili enfeksiyonlarda daptomisinin iyi bir tercih olacağı d�ş�n�lebilir.

KAYNAKLAR

  1. Otto M. Staphylococcus epidermidis-the �accidental' pathogen. Nat Rev Microbiol 2009; 7(8): 555-67.
  2. Doğruman Al F, Ak�a G, Sipahi B, Sultan N. Kan �rneklerinden soyutlanan stafilokok suşlarının antibiyotiklere diren� durumları. ANKEM Derg 2005; 19(1): 14-6.
  3. Mermel LA, Allon M, Bouza E, et al. Clinical practice guidelines for the diagnosis and management of intravascular catheter-related infection: 2009 update by the Infectious Disease Society of America. Clin Infect Dis 2009; 49(1): 1-45.
  4. Beekmann SE, Henderson DK. Infections caused by percutaneous intravascular devices, pp: 3347-62. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds), Principles and Practice of Infectious Diseases. 2005, 6th ed. Churchill-Livingstone Inc, Philadelphia.
  5. Yen HW, Yang WC, Tarng DC, et al. Daptomycin antibiotic lock therapy for hemodialysis patients with Gram-positive bloodstream infections following use of tunneled, cuffed hemodialysis catheters: retrospective single center analysis. Hemodial Int 2016; 20(2): 315-20.
  6. Shorr AF. Epidemiology of staphylococcal resistance. Clin Infect Dis 2007; 45(Suppl 3): 171-6.
  7. Gkentzi D, Kolyva S, Spiliopoulou I, Marangos M, Dimitriou G. Treatment options for persistent coagulase negative staphylococcal bacteremia in neonates. Curr Pediatr Rev 2016; 12(3): 199-208.
  8. Ishiekwene C, Ghitan M, Kuhn-Basti M, Chapnick E, Lin YS. Staphylococcus lugdunensis endocarditis with destruction of the ventricular septum and multiple native valves.� ID Cases 2016; 22(7): 14-5.
  9. Moise PA, North D, Steenbergen JN, Sakoulas G. Susceptibility relationship between vancomycin and daptomycin in Staphylococcus aureus: facts and assumptions. Lancet Infect Dis 2009; 9(10): 617-24.
  10. Maki DG, Weise CE, Sarafin HW. A semiquantitative culture method for identifying intravenous catheter related infection. N Engl J Med1977; 296(23): 105-9.
  11. O'Grady NP, Alexander M, Burns LA, et al. Guidelines for the prevention of intravascular catheter-related infections. Am J Infect Control 2011; 39(4 Suppl 1): S1-34.
  12. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).Principles and procedures for blood cultures; approved guideline. CLSI document M47-A., 2007,Wayne, USA.
  13. Geha DJ, Uhl JR, Gustaferro CA, Persing DH. Multiplex PCR for identification of methicillin-resistant staphylococci in the clinical laboratory. J Clin Microbiol1994; 32(7): 1768-72.
  14. Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement, CLSI Document M100-S25, 2015, Wayne, USA.
  15. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for Dilution Antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard- 10th edition,M07-A10, 2015,Wayne,USA.
  16. Zmantar T, Kouidhi B, Miladi H, et al. A microtiterplate assay for Staphylococcus aureus biofilm quantification at various pH levels and hydrogen peroxide supplementation. New Microbiol 2010; 33(2): 137-45.
  17. Antunes AL, Bonfanti JW, Perez LR, et al. High vancomycin resistance among biofilms produced by staphylococcus species isolated from central venous catheters. Mem Inst Oswaldo Cruz 2011; 106(1): 51-5.
  18. Mulvey MR, Chui L, Ismail J, et al. Development of a Canadian standardized protocol for subtyping methicillin-resistant Staphylococcus aureus using pulsed-field gel electrophoresis. J Clin Microbiol 2001; 39(10): 3481-5.
  19. Tekeli A, Koyuncu E, Dolap�ı İ, Akın AA, Karahan ZC. Ankara �niversitesi Hastanesinde 2002-2005 yılları arasında kan k�lt�rlerinden izole edilen metisiline diren�li Staphylococcus aureus suşlarının molek�ler �zellikleri. Mikrobiyol Bul  2009; 43(1): 1-10.
  20. G�zel-Tun�can �, Tozlu-Keten D, Dizbay M, Şenol E. Febril n�tropenik hastalardan kateterle ilişkili kan dolaşımı infeksiyonu etkeni olarak izole edilen koag�laz negatif stafilokok t�rlerinin teikoplanine duyarlılıkları. Klimik Derg 2010; 23(2): 44-7.
  21. �ift�i N, Dağı T�rk H, Demircan A, Tuncer İ. Kan k�lt�rlerinden izole edilen koag�laz negatif stafilokokların t�r tayini ve antibiyotiklere diren� oranları. ANKEM Derg 2016; 30(1): 7-11.
  22. Yılmaz N, K�se Ş, Ağuş N, Ece G, Akko�lu G, Kıraklı C. Yoğun bakım �nitesinde yatan hastaların kan k�lt�rlerinde �reyen mikroorganizmalar, antibiyotik duyaklılıkları ve nozokomiyal bakteriyemi etkenleri. ANKEM Derg 2010; 24(1): 12-9.
  23. Akpaka PE, Christian N, Bodonaik NC, Smikle MF. Epidemiology of coagulase-negative staphylococci isolated from clinical blood specimens at the universty hospital of the West Indes. West Indian Med J 2006; 55(3): 170-3.
  24. Khorshed A, �zbal Y. Kan k�lt�rlerinde izole edilen koag�laz negatif stafilokokların tiplendirilmesi ve antibiyotik duyarlılıklarının araştırılması. Sağlık Bilimleri Derg 2012; 21(3): 153-6.
  25. LaPlante KL, Mermel LA. In vitro activity of daptomycin and vancomycin lock solutions on staphylococcal biofilms in a central venous catheter model. Nephrol Dial Transplant 2007; 22(8): 2239-46.
  26. Aslan H, Yapar N. Tigesiklin ve vankomisin etkinliklerinin metisiline diren�li Staphylococcus aureus ile oluşturulan in vitro biyofilm modelinde karşılaştırılması. Mikrobiyol Bul 2015; 49(4): 475-83.
  27. de Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha Mde L. Antimicrobial resistance profile of planktonic and biofilm cells of Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. Int J Mol Sci 2016; 17(9): 1423.
  28. Luther MK, Mermel LA,� LaPlante KL. Comparison of telavancin and vancomycin lock solutions in eradication of biofilm-producing staphylococci and enterococci from central venous catheters. Am J Health Syst Pharm 2016; 73(5): 315-21.
  29. Moore CL, Osaki-Kiyan P, Haque NZ, Perri MB, Donabedian S, Zervos MJ. Daptomycin versus vancomycin for bloodstream infections due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus with high vancomycin minimum inhibitory concentration: a case-control study. Clin Infect Dis 2012; 54(1): 51-8.
  30. Murray KP, Zhao J, Davis SL, et al. Early use of daptomycin versus vancomycin for methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia with vancomycin MIC > 1 mg/L: a matched cohort study. Clin Infect Dis 2013; 56(11): 1562-9.
  31. Ho SW, Jung D, Calhoun JR, et al. Effect of divalent cations on the structure of the antibiotic daptomycin. Eur Biophys J 2008; 37(4): 421-33.
  32. Mathur T, Bhateja P, Pandya M, Fatma T, Rattan A. In vitro activity of RBx 7644 (ranbezolid) on biofilm producing bacteria. Int J Antimicrob Agents 2004; 24(4): 369-73.
  33. Bilman Bayındır F, Can F, Kaya M, Yazıcı AC. Kateter ile ilişkili hastane enfeksiyonlarından izole edilen metisiline diren�li stafilokoklarda biyofilm ile ilişkili antibiyotik duyarlılığının araştırılması. Mikrobiyol Bul 2013; 47(3): 401-16.
  34. El-Azizi M, Rao S, Kanchanapoom T, Khardori N. In vitro activity of vancomycin, quinupristin/dalfopristin and linezolid against intact and disrupted biyofilms of staphylococci. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2005; 4(2): 1-9.
  35. Steward PS, Davison WM, Steenbergen JN. Daptomycin rapidly penetrates a Staphylococcus epidermidis biofilm. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53(8): 3505-7.

İletişim (Correspondence):

Uzm. Dr. Duygu Nil�fer �cal,

Sağlık Bilimleri �niversitesi

Dışkapı Yıldırım Beyazıt Eğitim ve Araştırma Hastanesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji B�l�m�,

06110 Dışkapı, Ankara, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 312 596 2671,

E-posta (E-mail): drduygunil@hotmail.com

Yazdır