Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2017; 51(4): 340-349

Şanlıurfa'da Kutan�z Leyşmanyazis Ş�pheli Hastalardan Alınan
Klinik �rneklerin Tanısında Kinetoplast DNA'sına �zg�l Primerlerin
Kullanıldığı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile
Diğer Parazitolojik Y�ntemlerin Karşılaştırılması

Comparison of Polymerase Chain Reaction Using Kinetoplast DNA Specific Primers and
Other Parasitological Methods in the Diagnosis of Clinical Samples of Suspected Patients with
Cutaneous Leishmaniasis in Şanlıurfa

Fadile YILDIZ ZEYREK1,2, Seray T�Z2, Fehmi Y�KSEL1, Nevin TURGAY2, Yusuf �ZBEL2

1 Harran �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Şanlıurfa.

1 Harran University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Sanliurfa, Turkey.

2 Ege �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı, İzmir.

2 Ege University Faculty of Medicine, Department of Medical Parasitology, Izmir, Turkey.

�Z

Visseral leyşmanyazis (VL) ve kutan�z leyşmanyazis (KL) T�rkiye'de endemik olarak g�r�lmektedir. Leishmania tropica'nın neden olduğu KL, G�neydoğu Anadolu B�lgesi'nde olduğu gibi T�rkiye'nin diğer b�lgelerinde de halk sağlığı problemi olarak �nem kazanmıştır. Tanı, genellikle lezyonun klinik g�r�n�m� ve/veya lezyonun aspirasyon yayma preparatlarının mikroskobik incelemesiyle konulmaktadır. �zellikle kronik lezyonlarda deri biyopsi �rneği histolojik olarak incelendiğinde, parazit varlığının her zaman saptanamadığı durumlar olabilmektedir. Bunun yanı sıra, endemik b�lgelerde KL enfeksiyonlarının farklı t�rlerle de oluşması nedeniyle t�r tayininin yapıldığı tanı y�ntemlerini kullanmak �nem arz etmektedir. KL tanısı konurken aynı zamanda t�r�n tanımlanması, klinisyenlere tedavinin planlanmasında yardımcı olduğu gibi hastalığın kontrol�nde alınması gerekli �nlemlerin belirlenmesinde de �nem taşımaktadır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), paraziti t�r d�zeyinde ayırabilen y�ksek derecede �zg�n ve hassas bir tanı y�ntemidir. Kinetoplast DNA'sı (kDNA), klinik �rneklerde Leishmania parazitinin saptanmasında kullanılan hedef genetik b�lgelerdendir. Farklı gen b�lgelerinin hedeflendiği PCR y�ntemi leyşmanyazis tanısında uzun s�redir kullanılmakta olup kDNA'sının kullanıldığı PCR, parazit DNA'sının k���k daire b�lgesinin t�rlere �zg� değişken b�lgelerini hedefleyen en duyarlı y�ntemler arasında yer almaktadır. Kinetoplast DNA b�lgesi, leyşmanyazis tanısında ideal hedeflerden birisi olarak kabul edilmektedir. Bu �alışmanın amacı, KL tanısı i�in alınan klinik �rneklerde, Uni21/Lmj4 primerleri kullanılarak kinetoplastik DNA'yı hedefleyen PCR y�ntemini uygulamak ve elde edilen sonu�ları yayma ve k�lt�re dayalı diğer parazitolojik y�ntemlerle karşılaştırmaktır. �alışmada, Şanlıurfa Şark �ıbanı Tanı ve Tedavi Merkezine başvuran KL ş�pheli hastalardan alınan 62 �rnek kullanılmıştır. Klinik �rnekler kinetoplast DNA'yı hedefleyen PCR, parazit k�lt�r� ve yayma preparatlarının mikroskobik incelenmesi y�ntemleriyle �alışılarak sonu�lar değerlendirilmiştir. PCR ile 35 klinik �rnekte KL tanısı konulmuş ve bu y�ntemin t�m y�ntemler arasında en y�ksek duyarlılığı (%100) g�sterdiği tespit edilmiştir. PCR ile t�m mikroskobik ve/veya k�lt�r pozitif �rneklerde de olumlu sonu� alınmıştır. Ayrıca, PCR ile diğer y�ntemlerle saptanmayan d�rt KL olgusu saptanmıştır. Mikroskobik inceleme ile 25 hastada %71.4 duyarlılıkla, k�lt�r y�ntemi ile 19 hastada %54.3 duyarlılıkla tanı konulmuştur. K�lt�r ve mikroskobik inceleme y�ntemleri birlikte uygulandığında duyarlılık %88.6 (31/35 olguda pozitiflik) olarak bulunmuştur. Bu sonu�lara g�re, �zellikle G�neydoğu Anadolu gibi y�ksek KL a�ısından endemik b�lgelerde klasik y�ntemlerin yanı sıra kDNA PCR'nin uygulanması hem tanıda duyarlılığın y�kseltilmesi hem de t�r d�zeyinde tanımlama yapmaya olanak vermesi, ayrıca buna bağlı olarak uygun tedavi rejimlerinin oluşturulması ve gerekli �nlemlerin alınması a�ısından �nem taşımaktadır.

Anahtar s�zc�kler: Leyşmanyazis; kutan�z; tanı; kinetoplast; PCR.

ABSTRACT

Visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL)� are seen endemically in Turkey and CL caused by Leishmania tropica is an important public health problem in southeastern as well as other regions of Turkey. The diagnosis has been usually made by clinical view of lesion and/or parasitologically using lesion aspiration smears. Histological examination does not, always reveal the parasite in the skin biopsy, particularly in chronic lesions. Besides this, due to CL infections caused by different species in endemic areas, diagnostic methods enabling species identification are in great need. Species identification, in the time of diagnosis, is an important procedure for helping the clinicians in the planning of treatment as well as control measures. Polymerase chain reaction (PCR) is a specific and sensitive diagnostic tool that can also identify the parasite at species level. Kinetoplast DNA (kDNA) is one of the genetic regions that can be used for the detection of Leishmania parasites in clinical specimens, kDNA PCR is reported as one of the most sensitive methods related to species-specific variable regions in mini-circle long time ago. It has been considered as one of the most ideal targets for the diagnosis of leishmaniasis. The aim of the study was to perform PCR targeting kDNA by using the primers of Uni21/Lmj4 in clinical samples and compare the results with other parasitological methods like smear and culture, for the diagnosis of CL. The kDNA PCR, parasite culture and microscopical evaluation of stained smears� of 62 specimens from suspected CL cases who have referred to Cutaneous Leishmaniasis Diagnosis and Treatment Center in Sanliurfa, Turkey were included in the study. The kDNA PCR showed the highest sensitivity 100% of the samples (35/35) among all diagnostic assays,� followed by the microscopy (25/35 positive, 71.4% sensitivity) and culture (19/35 positive, 54.3% sensitivity). The sensitivity of combination of culture and microscopy was 88.6% (31/35 positive). These results suggested that performing kDNA PCR in addition to conventional techniques is important for improving the true diagnosis of CL� to the species level and also important for establishing treatment regimens and designing appropriate� precautions in highly endemic area like the southeastern region of Turkey.

Keywords: Leishmaniasis; cutaneous; diagnosis; kinetoplast; PCR.

Geliş Tarihi (Received):� 23.08.2017 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 17.10.2017

GİRİŞ

Leyşmanyazis, Leishmania cinsi i�erisinde yer alan t�rlerin etken olduğu bir parazit hastalığıdır ve hastalığın visseral leyşmanyazis (VL), kutan�z leyşmanyazis (KL) ve mukokutan�z leyşmanyazis (MKL) gibi farklı klinik şekilleri bulunmaktadır. T�rkiye'de VL ve KL olmak �zere iki klinik şekil g�r�lmekte ve 40'tan fazla ilimizden hastalık tanısı bildirilmektedir. G�neydoğu Anadolu ve Doğu Akdeniz b�lgelerimizde, Leishmania tropica ve Leishmania infantum'un etken olduğu KL �nemli bir halk sağlığı problemini oluşturmaktadır. Hastalık Anadolu'da y�zyıllardır bilinmekte ve T�rkiye'de 1970'li yıllardan bu yana bildirimi zorunlu hastalıklar arasında yer almaktadır. Antroponotik KL T�rkiye'de 1950'li yıllarda endemik olsa da, sivrisineklere karşı sıtma kontrol programı uygulaması sırasında, bu m�cadelenin etkenin vekt�r� olan kum sineği pop�lasyonlarını da etkilemesi nedeniyle olguların sayısında kayda değer bir azalma g�r�lm�şt�r.� Bununla birlikte, 1980 yılından bu yana� �zellikle Şanlıurfa, Osmaniye ve Adana illerimizde KL'nin insidansında artış g�zlenmiştir ve 1983 yılında 1741 KL olgusunun saptandığı bir epidemi yaşanmıştır1. Sağlık Bakanlığının verilerine g�re, 1990-2010 yılları arasında toplam 46.003 olgu bildirilmiştir. Bu olguların %96'sı G�neydoğu ve Doğu Akdeniz b�lgelerinde yer alan Şanlıurfa, Adana, Osmaniye, Hatay, Diyarbakır, İ�el ve Kahramanmaraş illerimizden bildirilmiştir. T�rkiye'de son� yıllarda bildirilen KL olgu sayısında bir artış eğilimi g�zlenmektedir2,3.

KL'nin y�ksek derecede endemik olduğu Şanlıurfa ilinde KL ş�pheli hastalar Şark �ıbanı Tanı ve Tedavi Merkezine başvurmaktadırlar. Bu merkezde hastalığın tanısı rutin olarak hastalardaki lezyonlardan elde edilen aspirasyon �rneklerinden hazırlanan yayma preparatlarının Giemsa ile boyanması sonrasında mikroskobik inceleme sonucu konulmaktadır. Bu b�lgede daha �nceleri hastalıktan sorumlu etken olarak L.tropica� g�r�l�rken son zamanlarda iki yerli ve bir Suriyeli hastada L.major'un etken olduğu bildirilmiştir4-6. Giemsa boyalı yayma preparatlarının mikroskopta incelenmesi, �zellikle kronik lezyonlarda d�ş�k duyarlılık g�stermesine rağmen, en basit ve hızlı tanı y�ntemi olarak kabul edilmektedir. Diğer bir tanı y�ntemi olan k�lt�r y�ntemi, hem klinik �rneklerin uzun s�reli ink�basyonunun gerekmesi hem de standardizasyonunun zor olması nedeniyle diğer y�ntemlere g�re daha d�ş�k duyarlılığa sahiptir1.

KL tanısı konurken t�r tanısının yapılması, klinisyenlere tedavinin planlanmasında yol g�sterici olmasının yanı sıra, hastalığın kontrol�nde alınması gerekli �nlemlerin belirlenmesinde de �nem taşımaktadır7. Farklı gen b�lgelerinin hedeflendiği PCR y�ntemi leyşmanyazis tanısında uzun zamandır kullanılmaktadır. Kinetoplast DNA (kDNA) PCR, parazit DNA'sı k���k daire b�lgesinin t�rlere �zg� değişken b�lgelerini saptayan en duyarlı y�ntemler� arasında yer almaktadır8. kDNA b�lgesi, leyşmanyazis tanısında ideal hedeflerden birisi olarak kabul edilmektedir9,10.

Anders ve arkadaşları11, Uni21/Lmj4 primerlerinin kullanıldığı araştırmalarında kDNA'nın hedeflendiği PCR ile t�rlere �zg� [L.major i�in 650 baz �ifti (bp); L.tropica ve L.donovani grubu i�in 800 bp] farklı b�y�kl�kte bant paternlerinin elde edildiğini bildirmişlerdir. Bu y�ntemle, yeni d�nya Leishmania t�rleri eski d�nya Leishmania t�rlerinden daha k���k bant paternleri� g�stererek kolaylıkla� ayırt edilebilmektedir11.

Bu �alışmada Şanlıurfa ilindeki KL ş�pheli hastalardan elde edilen klinik �rneklerde, kDNA'yı hedefleyen Uni21/Lmj4 primerlerinin kullanıldığı PCR y�ntemi ile mikroskopi ve k�lt�r y�ntemlerinin karşılaştırılması ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

Bu �alışma, Ege �niversitesi Tıp Fak�ltesi Araştırma Etik Kurulu (Karar no: 07-9/2- Protokol adı: "Visseral ve kutan�z Leishmaniasis enfeksiyonlarının tanısı ile parazit t�r ile t�r i�i farklılıklarının T�rkiye'de endemik b�lgelere g�re belirlenmesi") ile ger�ekleştirildi ve hasta ve/veya ebeveynlerinden onam formu� alındı.

Hastalar ve �rnekler

Şanlıurfa'da bulunan Şark �ıbanı Tanı ve Tedavi Merkezine başvuran toplam 62 hastadan �rnek alındı. KL ş�pheli en az bir lezyonu olan hastalar �alışmaya dahil edildi. �alışmaya dahil edilen hastaların yaş aralığı 1-55 yaş olarak belirlendi. Hastalara ait demografik veriler kaydedildi.

�rnek alınırken, lezyon ve �evresine deri antisepsisi uygulandı. Serum fizyolojik (0.1-0.2 mL) i�eren ins�lin iğnesi (1 mL, 25-g) ile lezyonun t�r�ne g�re �lser veya nod�l�n sağlam deri ile birleştiği b�lgeden bir ka� defa nazik�e girilip �ıkılarak �rnek alındı. İşlem sırasında dokuya az miktarda serum fizyolojik enjekte edilip geri �ekilerek doku sıvısı aspire edildi. Enjekt�r lezyondan �ekilerek aspirasyon materyali �nce NNN besiyerine inok�le edildi ve sonrasında 3-4 adet yayma preparatı hazırlandı. Yayma preparatları tamamen kuruduktan sonra, bir tanesi %100 metanol ile sabitlendi ve tekrar kurutulduktan sonra Giemsa ile boyanarak mikroskopta (x1000) incelendi. Diğer yayma preparatları DNA izolasyonu i�in -20�C'de saklandı. Lezyon kabuklu ise, tek kullanımlık bist�ri ucu ile kabuk kaldırılarak %70'lik alkol i�erisine alındı ve DNA izolasyonu yapılıncaya kadar -20�C'de saklandı.

K�lt�r y�ntemi Modifiye NNN besiyeri (1 g� NaCl, 2 g bakteriyolojik pepton, 5 g bakteriyolojik agar) hazırlanarak 120�C'de 20 dakika otoklavlandı. Besiyeri 55�C'ye soğuduğunda 30-60 ml insan kanı, 1.5 ml gentamisin eklendi. Besiyeri 2-4 ml steril t�plere dağıtılarak 45 derecelik eğimle soğutuldu ve ardından 4�C'de saklandı. Kullanım �ncesi her t�pe 1 ml %20 fetal sığır serumu i�eren RPMI sıvı besiyeri eklenerek lezyona ait aspirasyon �rneklerinden bir ka� damla ekim yapıldı. T�m işlemler steril koşullarda ger�ekleştirildi. Ekim yapılan k�lt�r �rnekleri 24�C'de �� hafta ink�be edildi ve her hafta �reme a�ısından �rnek alınarak mikroskopta incelendi. Bu s�re sonunda �reme olmayan �rnekler negatif olarak değerlendirildi.�

DNA İzolasyonu ve PCR Amplifikasyonu

TE tampon ��zeltisinden 200 �l alınarak yayma preparat �rnekleri yıkandı. Kabuklar mekanik olarak par�alandıktan sonra ependorf t�plere aktarıldı ve "Genomic DNA Purification Kit, K0512 (Fermentas, Almanya)" ticari kiti kullanılarak DNA izolasyonu ger�ekleştirildi. DNA �rnekleri 100 �l iki kez distile edilmiş su ile seyreltildi. DNA �rnekleri kullanılana kadar -20�C'de saklandı.

�rneklerdeki Leishmania DNA'sının �oğaltılması i�in, kDNA'sının k���k daire sekansı hedeflenerek hazırlanan Uni21 (5'-GGG GTT GGT GTA AAA TAG GCC-3') ve Lmj4 (5'-CTA GTT TCC CGC CTC CGA G-3') primer �ifti kullanıldı10. DNA amplifikasyonu; PCR tamponu, 2.0 mM MgCl2, her bir n�kleotitten 0.2 mM, her bir primerden 1 �m (50 pmol), 2.0 U Taq polimeraz (Fermentas, Almanya) ile 50 ng konsantrasyondaki genomik DNA'dan 1 �l i�eren 50 �l hacimde ger�ekleştirildi. Isı d�ng� cihazı (Perkin Elmer, Warrington, Birleşik Krallık)'nda PCR programı;� 94�C'de 5 dakika denat�rasyon sonrası, 94�C'de 1 dakika denat�rasyon,� 60�C'de 1 dakika primer birleşmesi ve 72�C'de 1.5 dakika uzama olacak şekilde toplam 35 d�ng� uygulandı. PCR �r�nleri %1 agaroz jelde Tris-asetat-EDTA tampon ��zeltisi i�inde y�r�t�ld� ve etidyum brom�r ile boyanarak UV ışık altında g�r�nt�lendi. Pozitif kontrol olarak Leishmania promastigot k�lt�r�nden hazırlanan 10 ng DNA kullanıldı. Eski d�nya Leishmania t�rleri i�in (L.major i�in 650 bp; L.infantum/L.donovani ve L.tropica i�in 800 bp; L.aethiopica i�in 850 bp) beklenen b�y�kl�kteki bant paterni izlenmesi halinde test pozitif olarak kabul edildi 11.

İstatistiksel Analiz

�rnekler, k�lt�r veya boyalı preparatın mikroskobik incelemesinde parazitin g�sterilmesi ya da PCR'de leyşmanya DNA'sının saptanması halinde doğrulanmış pozitif (D-Poz) sonu� olarak kabul edildi. Her �� y�ntem de negatif ise, �rnek doğrulanmış negatif (D-Neg) olarak kabul edildi. Bu değerler her bir tanı y�nteminin değerlendirilmesinde konsensus standardı olarak kabul edildi. �alışmada duyarlılık, �zg�ll�k, pozitif prediktif değer (PPD), negatif prediktif değer (NPD) ve Cohen'in kappa katsayısı () hesaplandı. Cohen'in kappa katsayısı ile iki test arasında şansa bağlı olmayan uyum �l��ld�ğ�nde "0" tesad�fi uyum ve "1" ideal uyum olarak değerlendirildi. Kappa indeksinin genel olarak 0.70 olması yeterli bulundu. Veriler SPSS programı (versiyon 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL, ABD) ile analiz edildi ve p değeri ≤ 0.05 olan değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

BULGULAR

Şanlıurfa ilindeki 62 KL ş�pheli hastanın �rnekleri �� tanı y�ntemiyle incelenmiştir. Toplamda saptanan 35 KL olgusunun, 15 (%42.9)'inin erkek, 20 (%57.1)'sinin kadın olduğu tespit edilmiştir. Olguların �oğu �ocuk olup ortalama yaş 14.7 � 13 olarak bulunmuştur. Olguların �oğunda (%66.1) lezyonların tanıdan 1-6 ay �ncesinde başlama �yk�s� olduğu tespit edilmiştir. Predominant klinik şekiller �lseratif ve nod�ler lezyonlar olup pap�ler lezyonlar nadiren saptanmıştır. KL hastalarının klinik g�r�n�m ve karakteristikleri Tablo I'de �zetlenmiştir. Toplamda 21 hastada tek lezyon, yedi hastada iki lezyon ve altı hastada �� lezyon saptanırken sadece bir hastada sekiz lezyona rastlanmıştır. Lezyonlar �ncelikle y�zde ve/veya �st ekstremitelerde yerleşmiştir.� Kullanılan y�ntemlerle elde edilen sonu�lar duyarlılık ve �zg�ll�k a�ısından karşılaştırılmıştır (Tablo I).


Tablo I

Konsensus kriterine g�re, �alışmaya alınan toplam 62 �rnek i�inde 35 (%56.5) �rnek pozitif, 27 (%43.5)� �rnek negatif olarak kabul edilmiştir. Konsensus standartlarında tanımlandığı gibi, parazit k�lt�r� ve mikroskobik inceleme y�ntemlerinin her ikisi de KL tanısında y�ksek derecede �zg�ll�k (%100) g�stermiş ve y�ntemler birlikte değerlendirildiklerinde 35 �rnekten 31 (%88.6)'inin doğru tanımlandığı saptanmıştır. Y�ntemlerin tek başına duyarlılıkları daha d�ş�k olup yayma i�in duyarlılık %71.4, k�lt�r i�in duyarlılık %54.3 olarak tespit edilmiştir. Bazı k�lt�rlerde bakteri veya mantarlara bağlı kontaminasyon g�zlenmiştir. Yayma ve k�lt�r y�ntemlerinin �zg�ll�k ve pozitif prediktif değerleri %100 olarak bulunmuştur. Cohen'in kappa katsayısı ()� ile yayma ve k�lt�r ile tanı arasındaki uyum d�zeyi vasat (0.37, p= 0.005) bulunurken, yayma veya k�lt�rle doğrulanan sonu�lar (D-Poz ve D-Neg) arasındaki uyum d�zeyleri ise sırasıyla iyi (0.69, p< 0.0001) ve ılımlı (0.50, p< 0.0001) olarak değerlendirilmiştir.

K�lt�r ve/veya mikroskobik inceleme ile pozitif bulunan 31 �rneğin hepsi kDNA PCR ile doğrulanmıştır. Testler arasındaki uyum d�zeyi = 0.84 (p< 0.0001) olup k�lt�r ve/veya mikroskopiyle kDNA PCR sonu�larının y�ksek derecede uyumlu olduğu saptanmıştır.

Toplam 62 �rnekten 35'i kDNA PCR (mikroskopi ve k�lt�r pozitif olan 31 �rnek ve mikroskopi veya k�lt�r negatif olan d�rt �rnek) ile 800 bp g�stererek pozitif bulunmuştur (Şekil 1). �alışmada kDNA PCR y�ntemi, uygulanan y�ntemler i�erisinde en duyarlı (%100) y�ntem olarak g�zlenmiştir. Doğrulanan sonu�lar ile kDNA PCR sonu�ları arasındaki uyum m�kemmel = 1 (p< 0.0001) olarak bulunmuştur.


Şekil 1

TARTIŞMA

T�rkiye'de leyşmanyazisin VL ve KL olmak �zere iki şekli g�r�lmektedir ve her ikisi de 1970'li yıllardan beri bildirimi zorunlu hastalıklardır. VL daha �ok Ege, Akdeniz ve Orta Anadolu b�lgelerinde olmak �zere sporadik olarak bildirilmektedir. Kendiliğinden iyileşebilen antroponotik KL ise G�ney Doğu Anadolu ve Akdeniz b�lgelerinde endemik olarak g�r�lmektedir. VL'nin etkeni L.infantum, KL'nin etkeni ise L.tropica'dır. Son yıllarda, Akdeniz b�lgesinde L.tropica'nın yanı sıra L.infantum'un da KL'ye neden olabileceği ve KL'nin Ege b�lgesinde de yayılım g�sterdiği bildirilmiştir2,12-14. Ayrıca, Akdeniz ve G�neydoğu Anadolu b�lgelerinde L.major ve/veya L.donovani'nin de KL etkeni olduğu g�sterilmiştir6,15.

KL'nin klasik tanısı lezyondan yapılan aspirasyon yayma preparatı veya biyopsi �rneğinin mikroskobik incelemesinde parazitin g�r�lmesi ve parazit k�lt�r�ne dayanmaktadır. Deri biyopsisinin histolojik incelemesinde �zellikle kronik lezyonlarda, parazit her zaman tespit edilememektedir14. Bunun yanı sıra, endemik b�lgelerde KL enfeksiyonlarının farklı t�rlerle oluşabilmesi nedeniyle t�r tayininin yapılabildiği tanı y�ntemleri �nem arz etmektedir. Mikroskopi ve k�lt�r y�ntemleriyle t�r tayini yapılamamasına karşın, PCR paraziti t�r d�zeyinde ayırabilen y�ksek derecede �zg�l ve duyarlı bir tanı y�ntemidir. kDNA'sı, klinik �rneklerde Leishmania parazitinin saptanmasında tercih edilen DNA b�lgelerinden birisidir. Leishmania cinsi i�erisinde t�rlere g�re 600 ile 800 bp arasında değişen boyutlardaki k���k daire gen b�lgesinden her bir parazitte yaklaşık 10.000 kopya bulunmaktadır. K���k daire, t�m Leishmania cinsi t�rlerinde ve bazı trypanosoma t�rlerinde bulunan ve molek�ler tanı y�ntemi geliştirmek i�in ideal hedeflerden birisi olan sabit b�lge i�ermektedir16. Bu �alışmada, L.major, L.tropica ve L.donovani grubu gibi diğer Leishmania t�rlerinden ayırt edebilmek i�in kDNA primer dizileri (Uni21/Lmj4) kullanılmıştır11. �alışmamızda uygulanan kDNA PCR ile t�m mikroskopi ve/veya k�lt�r pozitif �rneklerde pozitif sonu� alınmıştır. Ayrıca, kDNA PCR testi ile diğer y�ntemlerle saptanamayan d�rt KL olgusu saptanmıştır. İran'da ger�ekleştirilen bir araştırmada, 155 KL ş�pheli olgudan toplanan �rneklerde boyalı yayma preparat ile mikroskobik inceleme, k�lt�r ve ITS-PCR (primer seti; LeishR/LeishF) y�ntemleri uygulanmış ve mikroskopi ve/veya k�lt�r ile doğrulanmış �rneklerde PCR y�nteminin duyarlılığı %98.8 (86/87) olarak saptanmıştır. Tanı y�ntemleri tek olarak değerlendirildiğinde mikroskopi ve k�lt�r�n� duyarlılıkları sırasıyla %79.3 ve %86.2 olarak bulunmuştur. Mikroskopi ve k�lt�r y�ntemleri birlikte uygulandığında %100 duyarlılık g�zlenmiştir17. Bizim �alışmamızda, PCR KL tanısında en� duyarlı y�ntem olarak saptanmıştır. Parazit k�lt�r� ve yayma preparatlarının mikroskobik incelenmesi y�ntemlerinin her ikisi de KL tanısında y�ksek derecede �zg�l (%100) olup birlikte uygulandıklarında �rneklerin 31/35 (%88.6)'ini doğru olarak saptamıştır. Bu sonu�lar bize PCR y�nteminin uygulanamadığı merkezlerde tanıda etkinliği artırmak amacıyla k�lt�r ve mikroskopi y�ntemlerinin birlikte uygulanmasının gerekliliğini g�stermektedir. K�lt�r y�ntemi parazitin izolasyonunu sağlaması nedeniyle �nemli olsa da, parazit tanısı i�in klinik �rneğin deri y�zeyinden alınması nedeniyle olası bakteriyel ve fungal kontaminasyonlar y�ntemin daha d�ş�k duyarlılık g�stermesine neden olmaktadır. Bununla birlikte, k�lt�r y�ntemi bir�ok rutin laboratuvarda zaman alıcı bir y�ntem olarak değerlendirilip uygulanmamakta ve b�ylece olguların %28 (10/35)'inden fazlasına tanı konamamaktadır10.

Fas'ta ger�ekleştirilen bir araştırmada, KL tanısı i�in ITS1 (primer seti; LITSR/L5.8S) ve iki farklı kDNA PCR (primer setleri; 13A/13B ve Lmj4/Uni21) y�ntemi, mikroskopi ve k�lt�r y�ntemleriyle karşılaştırılmış ve Lmj4/Uni21 PCR PCR y�ntemleri i�erisinde en d�ş�k duyarlılığı g�stermiştir. Bu �alışmada duyarlılığın d�ş�k olmasının, amplifikasyon �r�n�n�n daha b�y�k boyutta (650-800 bp) olmasına bağlı olabileceği ve aynı zamanda Lmj4 primerinin k���k dairenin değişken b�lgesinde yer almasından kaynaklanabileceği d�ş�n�lm�şt�r18. Diğer yandan, Hindistan'da yapılan bir araştırmada aynı primerlerin� [ITS1 (LITSR/L5.8S) ve kDNA (Lmj4/Uni21)] kullanıldığı PCR y�ntemiyle, KL'nin t�r d�zeyinde tanısı karşılaştırılmış ve Lmj4/Uni21 PCR (%96.6)'nin ITS1 PCR (%82.75)'den daha y�ksek duyarlılık g�sterdiği� bulunmuştur19. Bizim �alışmamızda Uni21/Lmj4 primer setinin kullanıldığı kDNA PCR, mikroskopi ve k�lt�r y�ntemleriyle karşılaştırıldığında %100 duyarlılık g�stermiştir. Kinetoplast k���k daire değişken ve ITS1 b�lgelerinin �zellikle L.tropica'da t�r ve t�r i�i d�zeylerde heterojen olması nedeniyle, farklı endemik b�lgelerde farklı PCR y�ntemlerinin duyarlılıklarının karşılaştırılmasına gereksinim bulunmaktadır. T�rkiye'de KL tanısında y�ksek duyarlılık elde edilmesi ve t�r�n tayin edilebilmesi i�in G�neydoğu Anadolu, Akdeniz ve Ege gibi farklı endemik b�lgelerde farklı PCR y�ntemlerinin karşılaştırılmasına gereksinim bulunmaktadır.

Suriye, Irak ve İran T�rkiye'nin G�ney ve G�neydoğu sınır komşularıdır ve L.major kaynaklı KL bu �� �lkede endemik olarak g�r�lmektedir. Suriye'de KL olgularından� elde edilen L.major parazitlerinin izoenzim analizi yapılmış ve bu etkenin Sahra ��l�n�n yarı kurak b�lgesi (Sub-Saharian Sahel) ile Yakın ve Orta Doğu arasındaki b�lgede yaşayan insanları etkileyen zoonotik KL etkeni olduğu bilinen L.major MON-26 t�r� olduğu saptanmıştır20-22. Şanlıurfa g�n�m�zde L.tropica'nın endemik olduğu illerimizden biridir ve 2008 yılında yapılan bir araştırmaya g�re seyahat �yk�s� bulunmayan kişilerde PCR-RFLP y�ntemiyle yapılan değerlendirme sonucunda Şanlıurfa'da yalnız L.tropica/L.donovani grubu ile uyumlu olabilecek 800 bp bant paterni bulunmuştur23. Bununla birlikte, 2014 yılında Şanlıurfa ilinde L.major'un etken olduğu �� KL olgusu bildirilmiştir6. Bu bulgulara g�re b�lgede dominant t�r hala L.tropica olsa da, Suriyeli g��menlerin b�lgeye gelmesiyle birlikte, epidemiyolojik durumun yakın gelecekte değişebileceğine işaret edilmektedir. Bu nedenle, zoonotik KL yayılımı a�ısından olası hayvan rezervuarlarının tanımlanabilmesi i�in ileri �alışmalara gereksinim bulunmaktadır. Adana ili ve �evresinde L.major ve L.donovani'nin otokutan�z KL olgularının etkeni olduğunun bildirilmesi nedeniyle rezervuar �alışmaları gibi vekt�r �alışmalarının da ger�ekleştirilmesi �nemlidir15.

Sonu� olarak, �alışmamızda KL tanı merkezlerinde hastaların tedavilerinin d�zenlenmesi ve hastalığın g�r�ld�ğ� b�lgede uygun kontrol y�ntemlerinin alınabilmesi i�in �nemli olan Leishmania t�r ayrımının yapılmasında PCR y�ntemlerinin� tercih edilmesi gerektiğinin �nemi kanıtlanmıştır.�

KAYNAKLAR

  1. Culha G, Uzun S, Ozcan K, Memisoglu HR, Chang KP. Comparison of conventional and polymerase chain reaction diagnostic techniques for leishmaniasis in the endemic region of Adana Turkey. Int J Dermatol 2006; 45(5): 569-72.
  2. Gurel MS, Ulukanligil M, Ozbilge H. Cutaneous leishmaniasis in Şanlıurfa, epidemiologic and clinical features of the last four years (1997-2000). Int J Dermatol 2002; 41(1): 32-7.
  3. G�rel MS, Yeşilova Y, �lgen MK, �zbel Y. Cutaneous Leishmaniasis in Turkey. Turkiye Parazitol Derg 2012; 36(2): 121-9.
  4. Akkafa F, Dilmec F, Alpua Z. Identification of Leishmania parasites in clinical samples obtained from cutaneous leishmaniasis patients using PCR-RFLP technique in endemic region Şanlıurfa province in Turkey. Parasitol Res 2008; 103(3): 583-6.
  5. Toz SO, Culha G, Zeyrek FY, et al. A real-Time ITS1-PCR based method in the diagnosis and species identification of Leishmania parasite from human and dog clinical samples in Turkey. PLoS Negl Trop Dis 2013; 7(5): e2205.
  6. Yıldız Zeyrek F, G�rses G, Uluca N, et al. Is the agent of cutaneous leishmaniasis in Şanlıurfa changing? First cases of Leishmania major. T�rkiye Parazitol Derg 2014; 38(4): 270-4.
  7. Control of the leishmaniases: Report of a Meeting of the WHO Expert Commitee on the Control of Leishmaniases. World Health Organization; Geneva: 2010.
  8. Bensoussan E, Nasereddin A, Jonas F, Schnur LF, Jaffe CL. Comparison of PCR assays for diagnosis of cutaneous leishmaniasis. J Clin Microbiol 2006; 44(4): 1435-9.
  9. Weigle KA, Labrada LA, Lozano C, Santrich C, Barker DC. PCR-based diagnosis of acute and chronic cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (Viannia). J Clin Microbiol 2002; 40(2): 601-6.
  10. Mohaghegh M, Fata A, Salehi G, et al. Molecular identification of Leishmania species using samples obtained from negative stained smears. Iran J Parasitol 2013; 8(2): 337-41.
  11. Anders G, Eisenberger CL, Jonas F, Greenblatt CL. Distinguishing Leishmania tropica and Leishmania major in the Middle East using the polymerase chain reaction with kinetoplast DNA specific primers. Trans R Soc Trop Med Hyg 2002; 96(Suppl 1): S87-92.
  12. Ok UZ, Balcıoglu İC, Taylan Ozkan A, �zensoy S, Ozbel Y. Leishmaniasis in Turkey. Acta Trop 2002; 84(1): 43-8.
  13. Uzun S, Durdu M, Culha G, Allahverdiyev AM, Memisoglu HR. Clinical features, epidemiology, and afficacy and safety of intralesional antimony treatment of cutaneous leishmaniasis: recent experience in Turkey. J Parasitol 2004; 90(4): 853-9.
  14. Serin MS, Daglioglu K, Bagirova M, et al. Rapid diagnosis and genotyping of Leishmania isolates from cutaneous and visceral leishmaniasis by microcapillary cultivation and polymerase chain reaction�restriction fragment length polymorphism of miniexon region. Diag Microbiol Infect Dis 2005; 53(3): 209-14.
  15. Koltas IS, Eroglu F, Alabaz D, Uzun S. The emergence of Leishmania major and Leishmania donovani in southern Turkey. Trans R Soc Trop Med Hyg 2014; 108(3): 154-8.
  16. Abdolmajid F, Ghodratollah SS, Hushang R, Mojtaba MB, Ali MM, Abdolghayoum M. Identification of Leishmania species by kinetoplast DNA-polymerase chain reaction for the first time in Khaf district, Khorasan-e-Razavi province, Iran. Trop Parasitol 2015; 5(1): 50-4.
  17. Shahbazi F, Shahabi S, Kazemi B, Mohebali M, Abadi AR, Zare Z. Evaluation of PCR assay in diagnosis and identification of cutaneous leishmaniasis, a comparison with the parasitological methods. Parasitol Res 2008; 103(5): 1159-62.
  18. Mouttaki T, Morales-Yuste M, Merino-Espinosa G, et al. Molecular diagnosis of cutaneous leishmaniasis and identification of the causative Leishmania species in Morocco by using three PCR-based assays. Parasit Vectors 2014; 7: 420.
  19. Kumar R, Bumb RA, Ansari NA, Mehta RD, Salotra P. Cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania tropica in Bikaner, India: parasite identification and characterization using molecular and immunologic tools. Am J Trop Med Hyg 2007; 76(5): 896-901.
  20. Khiami A, Dereure J, Pratlong F, Martini A, Rioux JA. Human cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania major MON-26 in the region of Damascus (Syria). Bull Soc Pathol Exot 1991; 84(4): 340-4.
  21. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Update, Cutaneous leishmaniasis in US military personnel-Southwest/Central Asia 2002-2004 MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2004; 53(12): 264-5.
  22. Talari SA, Talaei R, Shajari G, Vakili Z, Taghaviardakani A. Childhood cutaneous leishmaniasis, report of 117 cases from Iran. Korean J Parasitol 2006; 44(4): 355-60.
  23. Zeyrek FY, Korkmaz M, Ozbel Y. Serodiagnosis of anthroponotic cutaneous leishmaniasis (ACL) caused by Leishmania tropica in Sanliurfa Province, Turkey, where ACL is highly endemic. Clin Vaccine Immunol 2007; 14(11): 1409-15.

İletişim (Correspondence):

Prof. Dr. Fadile Yıldız Zeyrek

Harran �niversitesi Tıp Fak�ltesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

Osmanbey Kamp�s�, Şanlıurfa-T�rkiye.

Tel (Phone): +90 414 318 1572,

E-posta (E-mail): fadilezeyrek@hotmail.com

Yazdır