Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2018; 52(2): 166-179

Gastrointestinal Şikayeti Olan Hastalarda Dientamoeba fragilis Enfeksiyonu

Dientamoeba fragilis Infection in Patients with Gastrointestinal System Complaints

Eda SİVCAN1, Arzuw CHARYYEVA2, Şirin Sahra CEYLAN3, Merve Y�R�K1, Emrah ERDOĞAN1, İzzet ŞAHİN1

1 Erciyes �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı, Kayseri.

1 Erciyes University Faculty of Medicine, Department of Medical Parasitology, Kayseri, Turkey.

2 Ostrava �niversitesi Bilim Fak�ltesi, Yaşam Bilimleri Araştırma Merkezi, Ostrava, �ek Cumhuriyeti.

2 Ostrava University Faculty of Science, Life Science Research Center, Ostrava, Czech Republic.

3 Celal Bayar �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı, Manisa.

3 Celal Bayar University Faculty of Medicine, Department of Medical Parasitology, Manisa, Turkey.

�Z

Bu �alışmada, gastrointestinal şikayeti olan hastalarda Dientamoeba fragilis'in farklı tanı y�ntemleriyle yaygınlığının araştırılması ve tanıda kullanılan y�ntemlerin duyarlılık ve �zg�ll�klerinin belirlenmesi ama�lanmıştır. �alışmada, �eşitli kliniklerden gelen ve �zellikle �st karın ağrısı, abdominal ve pelvik ağrı, bulantı ve kusma, gastroenterit ve kolit, sebebi bilinmeyen ateş ve ishal gibi gastrointestinal şikayeti olan 101 hasta ve sağlıklı bireylerden oluşan 20 kontrol olgusuna ait dışkı �rneği �ncelikle nativ-Lugol (N-L) y�ntemiyle incelenmiş ve t�m� Robinson besiyerine ekilmiştir. Toplam 121 olguya ait t�m dışkı ve k�lt�r �rnekleri demir hematoksilen boyama (DHB) ve� trikrom boyama (TB) ile boyanmıştır. Bu 242 �rneğin t�m� ayrıca polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kantitatif ger�ek zamanlı-PCR (QPCR) y�ntemleriyle D.fragilis a�ısından araştırılmıştır. Toplam 121 dışkı �rneğinin 13 (%10.7)'� DHB, 2 (%1.7)'si TB, 7 (%5.7)'si PCR, 13 (%10.7)'� QPCR ile pozitif bulunurken, aynı sayıdaki k�lt�r �rneğinin 7 (%5.8)'si DHB, 4 (%3.3)'� TB, 2 (%1.7)'si PCR, 3 (%2.5)'� QPCR y�ntemiyle pozitif olarak tespit edilmiştir. Y�z yirmi bir dışkı �rneğinin 15'inin ishalli olduğu belirlenmiştir. İshalli 15 dışkı �rneğinin hi�biri DHB veya TB ile pozitif bulunmamıştır. İshalli ve ishalli olmayan dışkıların sırasıyla 1 (%1)'i ve 6 (%4.9)'sı PCR y�ntemiyle pozitif iken, QPCR y�nteminde ishalli ve ishalli olmayan dışkılar sırasıyla (-/negatif) ve 13 (%10.7)'� pozitif olarak tespit edilmiştir. QPCR y�ntemi altın standart olarak kabul edildiğinde 121 dışkıya ait duyarlılık ve �zg�ll�k değerleri sırasıyla, DHB i�in %46 ve %93, TB i�in 0 ve %99, PCR i�in %54 ve %100 olarak tespit edilirken, k�lt�r �rneklerinde DHB i�in %67 ve %96, TB i�in %33 ve %98 ve PCR i�in %67 ve %100 olarak tespit edilmiştir. Sonu� olarak, hasta ve kontrol gruplarına uygulanan konvansiyonel ve molek�ler y�ntemlerin (DHB, TB, PCR ve QPCR) duyarlılıkları ve �zg�ll�kleri karşılaştırıldığında �nemli bir fark olduğu g�zlemlenmiş olup, �alışmanın konvansiyonel ve molek�ler y�ntemler a�ısından karşılaştırıldığı diğer �alışmaları desteklediği g�zlenmiştir. D.fragilis'in tanısında boyama y�ntemleri deneyim gerektirdiğinden, sıklıkla yanlış pozitif� veya negatif sonu� elde edildiği belirlenmiştir. Ayrıca, daha kısa zamanda kesin tanı konulması ve tedaviye başlanması bakımından QPCR y�nteminin avantajlı olduğu, QPCR'nin bulunmadığı durumlarda ise DHB ve konvansiyonel PCR y�ntemlerinin birlikte kullanılması gerektiği sonucuna varılmıştır. Bu �alışmanın, T�rkiye'de Dientamoeba �zerine yapılacak olan epidemiyolojik �alışmalara ve bilimsel �alışmalara katkı sağlayacağı kanaatindeyiz.

Anahtar s�zc�kler: Dientamoeba fragilis; DHB; TB; PCR; QPCR; Kayseri.

ABSTRACT

In this study, we aimed to investigate the incidence of Dientamoeba fragilis with different diagnostic methods in patients with gastrointestinal symptoms and determine the sensitivity and specificity of existing diagnostic methods. Fecal samples collected from 101 patients with gastrointestinal complaints (especially upper abdominal pain, abdominal and pelvic pain, nausea and vomiting, gastroenteritis and colitis, unexplained fever and diarrhea) and 20 control cases from various clinics were included in the study.� Samples were first examined with native-Lugol (N-L) method and cultured in Robinson medium. All 121 stool and culture samples were stained with iron hematoxylin stain (IHS) and trichrome stain (TS) methods and examined by PCR and QPCR for D.fragilis. Among 121 stool samples 13 (10.7%), 2 (1.7%), 7 (5.7%)� 13 (10.7%), and 7 (5.8%), 4 (3.3%), 2 (1.7%), 3 (2.5%) of cultured samples were determined� positive with IHS, TS, PCR, QPCR respectively. Fifteen of the 121 stool samples were� determined as diarrheal. All diarrheal stool samples were negative with IHS and TS.� One of the diarrheal stools and� 6 (4.9%) of the non-diarrheal stools were positive by PCR. All of the diarrheal stools were negative. Thirteen of the non-diarrheal stool samples (10.7%) were positive by QPCR. When the QPCR method was considered as gold standard, sensitivity and specificity values were determined as 46% and 93% in IHS, 0% and 99% in TS,� 54% and 100%� by PCR and sensitivity and specificity values were 67% and 96% in IHS, 33%� and 98% in TS,� 67% and 100%� by PCR� among cultured stool samples. As a result, it was determined that there was a statistically significant difference between the samples of the patients and the control groups and the sensitivity and specificity of the conventional and molecular methods (IHS, TS, PCR and QPCR) determined in this study supported the results of other compared studies. It has been determined that staining methods used for the diagnosis of D.fragilis gave false positivite or negativite results. In addition, the QPCR method is more advantageous in terms of time saving for the diagnosis and initiation of the treatment and in cases where QPCR is not available, IHS and conventional PCR methods should be used together. In our opinion, this study will contribute to� the results of epidemiological and scientific studies on D.fragilis in Turkey.

Keywords: Dientamoeba fragilis; IHS; TS; PCR; QPCR; Kayseri.

Geliş Tarihi (Received): 27.10.2017 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 28.01.2018

GİRİŞ

Dientamoeba fragilis insanların kalın bağırsağında yaşayan, ps�dopodlarıyla hareket eden amip benzeri patojen bir protozoondur1. Başlangı�ta amoeboid organizma olarak tanımlanmasına rağmen, bir dizi elektron mikroskopi ve imm�nolojik bulgular ışığında kam�ılı protozoon olarak yeniden sınıflandırılmıştır2. D.fragilis'in dış ortamda hayatta kalması i�in kist formunun bulunması gerektiği d�ş�n�l�rken,� ps�dokist, prekist ve kist� varlığı a�ısından yapılan �alışmalar sonucunda kist formu olmayan parazit olarak kabul edilmiştir. Kist formu olmadığı i�in� insanlara bulaş yolunun besin-su bulaşından ziyade fekal-oral yolla olduğu d�ş�n�lmektedir3. Bulaşın ayrıca, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura ve Ascaris lumbricoides gibi helmint yumurtaları aracılığıyla bulaşabileceği g�sterilmiştir. Bu parazit ile enfekte bireylerde en sık g�r�len belirtiler; karın ağrısı, şişkinlik, yorgunluk, iştahsızlık, ishal ve bulantı olmakla birlikte; eozinofilinin de g�r�lebileceği bildirilmiştir4-8. D.fragilis'in d�nyadaki prevalansı kullanılan tanı y�ntemine g�re %0.3-52 arasında değişiklik g�stermektedir9-11. D.fragilis'in� tanısı taze dışkı �rneği ve boyama y�ntemi kullanılsa bile g�� olmaktadır9. D.fragilis'in belirlenmesinde kullanılan en yaygın boyama y�ntemi demir-hematoksilen (DHB) ve trikrom boyama (TB) y�ntemidir2. Boyama y�ntemi �ncesinde trofozoitler hızlı bir şekilde dejenere olduğu i�in dışkının uygun fiksatiflerle fikse edilmesi gerekmektedir12. D.fragilis'in tanımlanmasında ksenik k�lt�r y�ntemleri kullanılmaktadır. Ksenik k�lt�r y�ntemleri i�erisinde Boeck ve Drbohlav besiyeri, Robinson besiyeri, Dobell ve Laidlow besiyeri, Cleveland-Collier besiyeri, Balamuth besiyeri ve TYGM-9 besiyeri yer almaktadır2. Konvansiyonel tanı y�ntemlerinin yanı sıra molek�ler tanı y�ntemi olarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kantitatif ger�ek zamanlı-PCR (QPCR) y�ntemleri kullanılmaktadır. QPCR y�nteminin konvansiyonel y�ntemlerden daha hassas ve� �zg�l olduğu g�r�lm�şt�r12.

Bu �alışmada, gastrointestinal şikayeti olan hastalarda, �nceleri patojen olmadığı d�ş�n�len fakat bug�n patojen olduğu bilinen, akut veya kronik GİS hastalık sebebi olan D.fragilis'in farklı tanı y�ntemleri ile yaygınlığının araştırılması ve tanıda kullanılan y�ntemlerin duyarlılık ve �zg�ll�klerinin belirlenmesi ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

Bu �alışma i�in Erciyes �niversitesi Klinik Araştırmalar Etik Kurulu Başkanlığı tarafından
etik kurul onayı alındı (23.11.2013-2013/638).

�rneklerin Toplanması

�alışmada kullanılacak olan dışkı �rnekleri, Erciyes �niversitesi Tıp Fak�ltesi Parazitoloji Laboratuvarına �eşitli polikliniklerine başvuran ve tetkik i�in Parazitoloji Anabilim Dalına gelen hastalar ile sağlıklı g�n�ll�lerden oluşan kontrol grubundan alındı. Dışkı �rneği alınan hastalar ile sağlıklı g�n�ll�ler bilgilendirilip yazılı onamları alındıktan sonra �alışmaya dahil edildi. �alışmaya �eşitli kliniklerden gelen ve gastrointestinal şikayeti olan 101 hasta grubu ve kontrol grubu olarak ise 20 kişiden oluşan, herhangi bir kronik rahatsızlığı ve gastrointestinal şikayeti bulunmayan sağlıklı g�n�ll�ler dahil edildi. Hasta grubuna ait �rneklerin 15'i ishalli iken, kontrol grubunda ishalli hasta bulunmadı.

�rneklerinin Konvansiyonel Y�ntemlerle İncelenmesi

Y�z bir hasta ve 20 kontrol grubuna ait birer dışkı �rneği �ncelikle Nativ- Lugol (N-L) y�ntemiyle incelendi. T�m dışkı �rneklerinden 180-200 mg alınarak Robinson besiyerine ekim yapıldı. Aynı zamanda 121 dışkı �rneğinden TB y�ntemi i�in PVA fiksatifi i�erisine, DHB y�ntemi i�in ise SAF fiksatifi i�erisine bir miktar dışkı (dışkı: 1 hacim, fiksatif: 3 hacim) eklendi. Geriye kalan 121 dışkı �rneği DNA izolasyonunda kullanılmak �zere -20�C'de muhafaza edildi.

�rneklerinin Molek�ler Y�ntemlerle İncelenmesi; PCR ve QPCR

Y�z yirmi bir dışkı �rneğinden ve bu dışkı �rneklerinin ekilmesi sonucu elde edilen 121 izolatın t�m�nden DNA ekstraksiyonu yapıldı. -20�C'de saklanan dışkı �rneklerinden 180-220 mg tartılarak 1.5 ml'lik santrif�j t�p�ne alındı. K�lt�r �rnekleri� �ncelikle 1.5 ml'lik santrif�j t�p�ne alındı ve 3500 rpm'de 3 dk santrif�j edildi. Daha sonra QIAamp Fast Stool Mini Kit (QIAGEN, Almanya) protokol�ne g�re DNA'lar elde edildi ve kullanıma kadar -20�C'de saklandı.

�alışmada, R�ser ve arkadaşları13 tarafından tasarlanan D.fragilis'e �zg�l 364 bp'lik bir b�lgeyi amplifiye eden DFpn 1F: (5'-GCC AAG GAA GCA CAC TAT GG-3') ve DFpn 364R: (5'-GTA AGT TTC GCG CCT GCT-3') primerleri kullanıldı. PCR y�ntemi i�in; 10x Tampon ��zeltisinden 2.5 �l, 25 mM MgCl2'den 2 �l, 10 mM dNTP miksden 0.5 �l, 20 pmol forward ve reverse primerlerin her birinden 1 μl, 5 u/�l Taq DNA polimerazdan 1 μl (Thermo Fisher Scientific, ABD) ve genomik DNA'dan 5 μl alınarak toplamda 25 �l'lik karışım hazırlandı. 95C'de 15 dk �n ısıtma, 94�C'de 30 sn denat�rasyon, 65�C'de 30 sn primer bağlanma, 72�C'de 30 sn uzamadan oluşan 35 d�ng� sonrası 72�C'de 5 dk'lık son uzamadan oluşan PCR programı kullanıldı. PCR �r�n� %2'lik agaroz jelde 120V'da 400 mA'de 45 dk y�r�t�ld�. Agaroz jel, etidyum brom�rle boyanarak ardından Bio-Rad Chemidoc MP (ABD) jel g�r�nt�leme cihazında g�r�nt�lendi.

D.fragilis i�in AY730405 GenBank aksesyon numarası ile bildirilen SSU rRNA gen b�lgesi hedef alınarak "Roche Diagnostics Universal Probe Library� (UPL) Assay Design Center" programı ile primerler (DFpn 1F ve DFpn 364R) ve prob (5'-ggaggaag-3') tasarlandı. LightCycler 480II (Roche Diagnostic, Almanya) cihazında QPCR yapılarak analiz edildi. QPCR reaksiyonunda; 2x Probes master miksten 10 �l, probdan 0.4 �l, 20 pmol/�l forward ve reverse primerlerin her birinden 1 �l, genomik DNA'dan 5 μl olmak �zere toplamda 20 �l'lik karışım 96'lık steril plaklarda hazırlandı. 95�C'de 10 dk denat�rasyon, 95�C'de 10 sn denat�rasyon, 60�C'de 30 sn bağlanma, 72�C'de 1 sn uzamadan oluşan 45 d�ng� sonrası 40�C'de 30 sn son uzamadan oluşan QPCR programı kullanıldı.

BULGULAR

�alışmaya; �st karın ağrısı, abdominal ve pelvik ağrı, bulantı ve kusma, gastroenterit ve kolit, sebebi bilinmeyen ateş ve ishal gibi gastrointestinal şikayeti olan toplam 101 hasta ve 20 kişilik kronik rahatsızlığı olmayan, sağlıklı g�n�ll�lerden oluşan kontrol grubu dahil edilmiştir. Toplam 121 dışkı �rneğinin t�m� �ncelikle N-L y�ntemiyle incelenmiş olup, D.fragilis dışında belirlenen parazitler ve ishal durumuna g�re dağılımı verilmiştir (Tablo I). İncelenen 121 dışkı �rneğinin t�m�ne DHB, TB, PCR ve QPCR y�ntemleri uygulanmış ve D.fragilis saptama sıklıkları belirlenmiştir (Tablo II). Dışkı �rneklerinden 13 (%10.7)'� DHB (Şekil 1), 2 (%1.7)'si TB (Şekil 2), 7 (%5.7)'si PCR (Şekil 3) ve 13 (%10.7)'� QPCR (Şekil 4) y�ntemleriyle D.fragilis a�ısından pozitif olarak tespit edilmiştir. Kullanılan y�ntemlere ait pozitiflik y�zdeleri karşılaştırıldığında aralarında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olduğu g�r�lm�şt�r (x2= 0.505, p< 0.05).


Tablo I

Tablo II

Şekil 1

Şekil 2

Şekil 3

Şekil 4

Toplam 121 k�lt�r �rneğine uygulanan DHB, TB, PCR ve QPCR y�ntemlerinin, D.fragilis pozitiflik� y�zdelerinin dağılımı belirlenmiştir (Tablo III). K�lt�r �rneklerinin 7 (%5.8)'si DHB (Şekil 5), 4 (%3.3)'� TB (Şekil 6), 2 (%1.7)'si PCR (Şekil 7) ve 3 (%2.5)'� QPCR (Şekil 8) y�ntemleriyle pozitif olarak tespit edilmiştir. Kullanılan y�ntemler sonucunda elde edilen pozitif� sonu�lar karşılaştırıldığında aralarında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olduğu g�r�lm�şt�r (x2= 1.371, p< 0.05).


Tablo III

Şekil 5

İshalli 15 dışkı �rneğinin hi�biri DHB, TB ve QPCR y�ntemleriyle D.fragilis a�ısından pozitif bulunmamıştır. PCR y�ntemi ile ishalli dışkıların 1 (%6.6)'i pozitif bulunmuştur. D.fragilis a�ısından; ishalli 15 dışkı �rneğinin, ishalli olmayan �rneklerdeki pozitiflik oranlarının kullanılan y�ntemlere g�re karşılaştırıldığında aralarında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olduğu g�r�lm�şt�r (x2= 2.244, p< 0.05) (Tablo IV).


Tablo IV

QPCR y�ntemi altın standart olarak kabul edilerek, 121 dışkı �rneğinde DHB, TB ve PCR y�ntemlerine ait duyarlılık ve �zg�ll�k sonu�ları belirlenmiştir. Buna g�re QPCR'nin duyarlılık ve �zg�ll�ğ� sırasıyla; DHB'ye g�re %44 ve %83; TB'ye g�re 0 ve %99, PCR'ye g�re %54 ve %100 olarak tespit edilmiştir (Tablo V).


Tablo V

Ayrıca, 121 k�lt�r �rneğine ait duyarlılık ve �zg�ll�k değerlerindeki değişim de belirlenmiştir. Buna g�re; QPCR'ın duyarlılık ve �zg�ll�ğ� sırasıyla, DHB'ye g�re %67 ve %96, TB'ye g�re %33 ve %98, PCR'ye g�re ise %66 ve %100 olduğu tespit edilmiştir (Tablo VI).


Tablo VI

TARTIŞMA

D.fragilis, insanlarda gastrointestinal sisteme yerleşen patojen bir parazittir. Yaşam d�ng�s�, bulaş yolu hakkında bilgi eksikliği, aksenik k�lt�rde �retilememesi ve tanı testlerinin yetersizliği gibi kısıtlılıklar D.fragilis ile ilgili epidemiyolojik �alışmaların artmasına sebep olmuştur14-18. Parazitin kullanılan tanı y�ntemlerine g�re direkt bakı ve boyama y�ntemleri ile tanısı zor olması sebebiyle d�nyadaki insidansı değişiklik g�stermektedir8-10.

�alışmaya dahil edilen gastrointestinal şikayeti olan toplam 101 hastadan ve 20 kişilik sağlıklı g�n�ll�den oluşan kontrol grubundan elde edilen �rnekler ile D.fragilis'in tanısında kullanılan QPCR, DHB, TB, PCR ve Robinson k�lt�r y�ntemleri karşılaştırılmıştır.�

HIV/AIDS ile enfekte hastanın 82 dışkı �rneğinin incelendiği bir �alışmada, �rnekler DHB ile boyanmış ve D.fragilis'i belirlemede diğer tekniklere oranla bu y�ntemin 2.7 kat daha hassas olduğu bildirilmiştir19. Gastrointestinal şikayeti olan hastalarda yapılan başka bir �alışmada, mikroskopisi pozitif 31 hastanın 29'u PCR y�ntemi ile pozitif olarak saptanmıştır ve PCR y�nteminin %100 duyarlı ve %93.5 �zg�l olduğu� bildirilmiştir14. Dışkı �rneklerinin (n= 6750) incelendiği bir diğer �alışmada, kalıcı boyama y�ntemi ile pozitif bulunan 60 dışkı �rneği PCR y�ntemiyle doğrulanmıştır. Hastaların 32'sinin ishal ve abdominal karın ağrısı şikayeti bulunan kronik semptomlu hastalar olduğu bildirilmiştir. QPCR y�nteminin; dışkı �rneklerinde %100 duyarlılık ve �zg�ll�k g�stermesi, aynı zamanda iki saat gibi daha kısa bir s�rede sonu� verilebilmesi, hem tanı s�resinin hem de kontaminasyon riskinin azaltılmasıyla konvansiyonel PCR'ye g�re avantajlı olduğu bildirilmiştir15,20. Calderaro ve arkadaşları21 tarafından yapılan ve D.fragilis 5.8S rDNA'sını hedef alan QPCR y�ntemiyle k�lt�r y�ntemi uygulanan intestinal parazit ş�pheli 491 hastadan alınan 959 dışkı �rneği karşılaştırılmıştır. �alışma sonucunda k�lt�r y�ntemine ek olarak QPCR'de 117 �rneğin daha pozitif olduğu belirlenmiştir. Gastrointestinal şikayeti olan ve yaşları 0-18 arasında değişen �ocuk hastalarda� intestinal protozoonları belirlemek i�in yapılan bir �alışmada, 163 �ocuk hastanın dışkı �rneklerinin 114'�n�n multipleks QPCR ile Blastocystis, D.fragilis, Giardia lamblia, Cryptosporidium t�rleri ve Entamoeba t�rleri bakımından pozitif olduğu tespit edilmiştir. �ocuk hastaların 101'inin D.fragilis, 49'unun ise Blastocystis hominis ile enfekte iken 47'sinin ise başlıca D.fragilis olmak �zere birden fazla parazit kombinasyonu ile enfekte olduğu bildirilmiştir22. Retrospektif olarak yapılan bir �alışmada,� kronik karın ağrısı olan 132 ve gastrointestinal şikayeti olmayan 77 �ocukta, multipleks QPCR y�ntemi kullanarak D.fragilis'i belirlemek ama�lanmıştır. Bu �alışmada 132 hastanın 57'sinde, kontrol grubunda ise 77 kişiden 39'unda D.fragilis'in pozitif olduğu belirlenmiştir23. Başka bir �alışmada, SSU rRNA genini hedef alan 5'n�kleaz bazlı (TaqMan) QPCR, konvansiyonel PCR ve modifiye edilmiş DHB y�ntemleri karşılaştırılmıştır. Toplamda 200 hastanın mikroskopi ile 50'sinin (%92.4 duyarlılık ve %98.7 �zg�ll�k), konvansiyonel PCR ile 48'inin (%88.9 duyarlılık ve %100 �zg�ll�k), QPCR ile 51'inin (%100 duyarlılık ve �zg�ll�k) pozitif olduğu bildirilmiştir24. Altı y�z elli dışkının 35 (%5.4)'inin D.fragilis a�ısından QPCR ile pozitif bulunduğu bir �alışmada, konvansiyonel PCR ile 15'i, MBD k�lt�r y�ntemiyle 14'�, TYGM-9 k�lt�r y�ntemiyle 10'u, mikroskopi ile 12'si pozitif bulunmuştur. Diğer tanı y�ntemlerine kıyasla QPCR'de daha fazla pozitif sonu� bildirilmiştir. Y�ntemlerin duyarlılık ve �zg�ll�klerinin sırasıyla, QPCR'de %100, konvansiyonel PCR'de %42.9 ve %100, MBD k�lt�r�nde %40 ve %100, TYGM-9 besiyerinde %28.6 ve %100, mikroskopide ise %34.3 ve %99 olduğu g�sterilmiştir8. Konu ile ilgili olarak T�rkiye'de yapılan �eşitli �alışmalar� bulunmaktadır. Enflamatuvar bağırsak sendromu bulunan hastalarda direkt mikroskopi, TB ve spesifik k�lt�r yapılarak D.fragilis ve B.hominis sıklığının araştırıldığı bir diğer �alışmada, D.fragilis'in hi� tespit edilmediği bildirilmiştir25. İshali olan 400 hastada D.fragilis'in patojenitesinin incelendiği bir �alışmada, 35 D.fragilis pozitif hastanın 34'�nde seknidazol ile tedavisinden sonra parazite rastlanmamıştır. �alışmada sonu� olarak, D.fragilis'in sık g�r�ld�ğ�, patojenik olduğu ve seknidazol�n tedavide etkili olduğu tespit edilmiştir26. Parazitoloji laboratuvarına başvuran 5178 hastanın dışkı �rneklerinde bağırsak parazitlerinin sıklığının N-L ile araştırıldığı bir başka �alışmada 10 (%1.8) hasta D.fragilis pozitif olarak tespit edilmiştir27.

�alışmada, hasta ve kontrol grubu �rnekleri DHB ve TB y�ntemiyle boyanmıştır. TB y�nteminde, g�rece daha kısa s�rede �rnek inceleme avantajı sağlanmasına rağmen, her iki gruba ait �rneklerde DHB ile y�ksek oranda pozitiflik tespit edilmiş ve DHB y�nteminin parazitin morfolojik olarak belirlenmesinde daha avantajlı olduğu tespit edilmiştir. K�lt�r sonrası D.fragilis pozitifliğinin farklı tanı y�ntemlerine g�re gruplar arası dağılımı değişmiş, pozitiflik oranı k�lt�rden sonra daha y�ksek bulunmuştur. Parazitin k�lt�r�n�n uzun s�re devam ettirilememesinden dolayı, devam eden pasajlardan sonra pozitiflik oranında d�ş�ş tespit edilmiştir.

D.fragilis enfeksiyonu ile ishal arasındaki ilişkiyi araştırmak i�in Al-Hindi ve Shammala tarafından Al-Nuseirate M�lteci Kampı Kliniğinde yapılan �alışmaya yaşları 1-75 arasında değişen, ishal ve karın ağrısı şikayeti olan kişiler dahil edilmiştir. Yapılan �alışmada; D.fragilis ile enfekte 28 kişinin %96.4'�n�n karın ağrısı, %71.4'�n�n ishal şikayeti olduğu belirtilmiştir28. 2011-2013 yılları arasında akut gastroenteritli �ocuklarda D.fragilis'in belirlenmesi i�in J�lio ve arkadaşları29 tarafından yapılan �alışmada, 103 (%58.5)'� erkek, 144 (%81.8)'� 0-5 yaş arasında olan ve 32 (%18.2)'si 6 yaş �st� olan toplam 176 �ocuk �alışmaya dahil edilmiştir. �ocuk hastaların %6.3 (11/176)'� D.fragilis a�ısından pozitif bulunmuş ve enfekte hastalarda kusma, karın ağrısı, ateş ile birlikte ishalin g�zlendiği belirtilmiştir. �alışmamızda incelemesi yapılan toplam 121 dışkı �rneğinin 15'inin ishalli olduğu tespit edilmiştir. İshalli olan dışkılardan 1 (%6.6)'inin sadece PCR y�ntemiyle pozitif olduğu saptanmıştır. Gastrointestinal şikayeti olan hastalarda ishalin g�r�lmesi durumunda, D.fragilis tanısı i�in sadece bu belirtinin yeterli olmayacağını d�ş�nmekteyiz.

Bu �alışmada kullanılan boyama y�ntemleri PCR ve QPCR y�ntemleri ile karşılaştırıldığında, boyama sonrası mikroskopide D.fragilis� pozitif olarak bulunan �rnek sayısının daha fazla olduğu g�r�lm�şt�r. PCR y�ntemi boyama y�ntemine g�re daha hassas bir y�ntem olmasına rağmen, pozitif �rnek sayısının daha az g�r�lmesi; D.fragilis'in morfolojik olarak birbirlerine benzerlik g�steren parazitlerle karıştırılabilmesinden ve k�lt�r y�nteminin sadece bu parazit i�in �zg�l olmayıp bir�ok parazitin besiyeri ortamında �remesi nedeniyle yanlış pozitiflik elde edilmesinden kaynaklanmaktadır. Konvansiyonel PCR'de negatif olduğu tespit edilen �rneklerin QPCR'de pozitif olduğu g�r�lm�şt�r. Bu durum, PCR y�nteminin QPCR y�ntemi kadar hassas olmamasından kaynaklanmaktadır. K�lt�rden �nce incelenen dışkı �rneklerinde QPCR y�ntemi ile kıyaslanan y�ntemlerin duyarlılıkları ve �zg�ll�kleri sırasıyla DHB ile %46 ve %93; TB ile %0 ve %99; PCR ile %54 ve %100 olarak bulunmuştur. K�lt�rden sonra ise QPCR y�ntemi ile kıyaslanan y�ntemlerin duyarlılıkları ve �zg�ll�kleri sırasıyla DHB ile %67 ve %96; TB ile %33 ve %98; PCR'de %67 ve %100 olarak bulunmuştur.

Sonu� olarak; hasta ve kontrol gruplarına uygulanan konvansiyonel ve molek�ler y�ntemlerin (DHB, TB, PCR ve QPCR) duyarlılıkları ve �zg�ll�kleri karşılaştırıldığında �nemli bir fark olduğu g�zlemlenmiş olup �alışma konvansiyonel ve molek�ler y�ntemler a�ısından, karşılaştırıldığı diğer �alışmaları destekler nitelikte bulunmuştur. D.fragilis'in tanısında boyama y�ntemlerini değerlendirmek deneyim gerektirmekte, aksi takdirde sık yanlış pozitif veya negatif sonu�ların elde edildiği g�r�lmektedir. Ayrıca, daha kısa zamanda kesin tanı konulması ve tedaviye başlanması bakımından QPCR y�nteminin avantajlı olduğu, QPCR'ın bulunmadığı durumlarda ise DHB ve konvansiyonel PCR y�ntemlerinin birlikte kullanılması gerektiği sonucuna varılmıştır. Bu �alışmanın, T�rkiye'de Dientamoeba �zerine yapılacak olan epidemiyolojik �alışmalarda verilerin ortaya konması ile bilime katkı sağlayacağı d�ş�n�lmektedir. Ayrıca, D.fragilis'in hayat d�ng�s�nde; bulaşma mekanizmasında ve taşınmasında �ok fazla bilinmeyen olması sebebiyle ileri araştırmaların yapılması kanaatindeyiz.

KAYNAKLAR

  1. Girginkardeşler N, Kurt �. �zcel'in tıbbi parazit hastalıkları: Dientamoeba fragilis, pp: 411-21. T�rkiye Parazitoloji Derneği; 2007.
  2. Johnson EH, Windsor JJ, Clark CG. Emerging from obscurity: biological, clinical, and diagnostic aspects of Dientamoeba fragilis. Clin Microbiol Rev 2004; 17(3): 553-70.
  3. Burrows RB, Sweedlow M. Enterobius vermicularis as a probable vector of Dientamoeba fragilis. Am J Trop Med Hyg 1956; 5(2): 258-65.
  4. Katz D, Taylor� DN. Parasitic infections of the gastrointestinal tract. Gastroenterol Clin North Am 2001; 30(3): 797-815.
  5. Preiss U, Ockert G, Broemme S, Otto A. On the clinical importance of Dientamoeba fragilis infections in childhood. J Hyg Epidemiol Microbiol Immunol 1990; 35(1): 27-34.
  6. Cuffari C, Oligny L, Seidman EG. Dientamoeba fragilis masquerading as allergic colitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1998; 26(1): 16-20.
  7. Stark D, Barratt J, Roberts T,� Marriott D, Harkness J, Ellis J. A review of the clinical presentation of dientamoebiasis. Am J Trop Med Hyg 2010; 82(4): 614-9.
  8. Stark D, Barratt J, Roberts T,� Marriott D, Harkness J, Ellis J. Comparison of microscopy, two xenic culture techniques, conventional and real-time PCR for the detection of Dientamoeba fragilis in clinical stool samples. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2010; 29(4): 411-6.
  9. Windsor J, Macfarlane L, Hughes-Thapa G, Jones SK, Whiteside TM. Detection of Dientamoeba fragilis by culture. Br J Biomed Sci 2003; 60(2): 79-83.
  10. Verweij JJ, Mulder B, Poell B, van Middelkoop D, Brienen EA, van Lieshout L. Real-time PCR for the detection of Dientamoeba fragilis in fecal samples. Mol Cell Probes 2007; 21(5-6): 400-4.
  11. Windsor JJ, Johnson EH. Dientamoeba fragilis: the unflagellated human flagellate. Br J Biomed Sci 1999; 56(4): 293.
  12. Stark DJ, Beebe N, Marriott D, Ellis JT, Harkness J. Dientamoebiasis: clinical importance and recent advances. Trends Parasitol 2006; 22(2): 92-6.
  13. R�ser D, Nejsum P, Carlsgart AJ, Nielsen HV, Stensvold CR. DNA of Dientamoeba fragilis detected within surface-sterilized eggs of Enterobius vermicularis. Exp Parasitol 2013; 133(1): 57-61.
  14. Stark D, Beebe N, Marriott D, Ellis J, Harkness J. Detection of Dientamoeba fragilis in fresh stool specimens using PCR. Int J Parasitol 2005; 35(1): 57-62.
  15. Peek R, Reedeker FR, van Gool T. Direct amplification and genotyping of Dientamoeba fragilis from human stool specimens. J Clin Microbiol 2004; 42(2): 631-5.
  16. Stark D, Beebe N, Marriott D,� Ellis J, Harkness J. Prospective study of the prevalence, genotyping, and clinical relevance of Dientamoeba fragilis infections in an Australian population. J Clin Microbiol 2005; 43(6): 2718-23.
  17. Johnson JA, Clark CG. Cryptic genetic diversity in Dientamoeba fragilis. J Clin Microbiol 2000; 38(12): 4653-4.
  18. Windsor J, Clark C, Macfarlane L. Molecular typing of Dientamoeba fragilis. Br J Biomed Sci 2004; 61(3): 153.
  19. Garcia JA, Cimerman S. Detection of Dientamoeba fragilis in patients with HIV/AIDS by using a simplified iron hematoxylin technique. Revista da SBMT 2012; 45(2): 156-8.
  20. Van Gool T, Weijts R, Lommerse E, Mank T. Triple faeces test: an effective tool for detection of intestinal parasites in routine clinical practice. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2003; 22(5): 284-90.
  21. Calderaro A, Gorrini C, Montecchini S, et al. Evaluation of a real-time polymerase chain reaction assay for the detection of Dientamoeba fragilis. Diagn Microbiol Infect Dis 2010; 67(3): 239-45.
  22. Maas L, Dorigo-Zetsma J, Groot C, Bouter S, Pl�tz FB, van Ewijk BE. Detection of intestinal protozoa in paediatric patients with gastrointestinal symptoms by multiplex real-time PCR. Clin Microbiol Infect 2014; 20(6): 545-50.
  23. de Jong MJ, Korterink JJ, Benninga MA, Hilbink M, Widdershoven J, Deckers-Kocken JM. Dientamoeba fragilis and chronic abdominal pain in children: a case-control study. Arch Dis Child 2014; 99(12): 1109-13.
  24. Stark D, Beebe N, Marriott D, Ellis J, Harkness J. Evaluation of three diagnostic methods, including real-time PCR, for detection of Dientamoeba fragilis in stool specimens. J Clin Microbiol 2006; 44(1): 232-5.
  25. Mumcuoğlu I, Coşkun FA, Aksu N, P�rnak T, G�ng�r C. Role of Dientamoeba fragilis and Blastocystis spp. in Irritable Bowel Syndrome. Turkiye Parazitol Derg 2013; 37(2): 73-7.
  26. Girginkardeşler N, Coşkun S, Balcioğlu CI, Ertan P, Ok UZ. Dientamoeba fragilis, a neglected cause of diarrhea, successfully treated with secnidazole. Clin Microbiol Infect 2003; 9(2): 110-3.
  27. Tamer GS, Calişkan S, Willke A. Distribution of intestinal parasites among patients who presented at the parasitology laboratory of the Kocaeli University School of Medicine Hospital. Turkiye Parazitol Derg 2008; 32(2): 126-9.
  28. Al-Hindi AI, Shammala BM. Dientamoeba fragilis in Gaza Strip: a neglected protozoan parasite. Iran J Parasitol 2013; 8(2): 249-55.
  29. J�lio C, Furtado C, Rocha R, Escobar C, Brito MJ, Oleastro M. Detection of Dientamoeba fragilis in Portuguese children with acute gastroenteritis between 2011 and 2013. Parasitology 2015; 142(11): 1398-403.

İletişim (Correspondence):

Eda Sivcan,

Erciyes �niversitesi Tıp Fak�ltesi,

Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı,

Melikgazi, 38039, Kayseri, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 352 207 6666,

E-posta (E-mail): edasvcn_38@hotmail.com

Yazdır