Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2018; 52(3): 233-246

Streptococcus pyogenes İzolatlarının Vir�lans Fakt�rlerinin Araştırılması ve
"Multiple Locus Variable Number Tandem Repeat Fingerprinting (MLVF)"
Y�ntemi ile Tiplendirilmesi

Investigation of Streptococcus pyogenes Virulence Factors and Typing
by Multiple Locus Variable Number Tandem Repeat Fingerprinting (MLVF) Method

Hatice T�RK DAĞI1, Şerife Y�KSEKKAYA2, Tuba SEYHAN1, Duygu FINDIK1, İnci TUNCER1, Uğur ARSLAN1

1 Sel�uk �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Konya.

1 Sel�uk University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Konya, Turkey.

2 Konya Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Mikrobiyoloji Laboratuvarı, Konya.

2 Konya Training and Research Hospital, Microbiology Laboratory, Konya, Turkey.

*Bu �alışma, Sel�uk �niversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinat�rl�ğ� tarafından (Proje no: 13101131) desteklenmiştir.

�Z

Streptococcus pyogenes, konağın boğaz ve cildini kolonize eden, farenjit, tonsillit ve impetigo gibi hafif enfeksiyonların yanı sıra streptokoksik toksik şok sendromu, septisemi ve nekrotizan fasiit gibi şiddetli invaziv enfeksiyonlara neden olan ve �eşitli vir�lans fakt�rleri �reten �nemli bir bakteriyel patojendir. Bu �alışmada tonsillo-farenjitli hastaların boğaz k�lt�rlerinden elde edilen S.pyogenes izolatlarının antibiyotiklere duyarlılıklarının saptanması, vir�lans fakt�rlerinin [pirojenik ekzotoksin genleri (speA, C, G, H, I, J, K, L, M, smeZ ve ssa), deoksiribon�kleaz genleri (sdaB, spd3, sdc ve sdaD), proteaz genleri (speB, spyCEP ve scpA) ve inhibit�r genlerinin (mac ve sic)] belirlenmesi ve "multiple locus variable number tandem repeat fingerprinting (MLVF)" y�ntemiyle tiplendirilmesi ama�lanmıştır. Bu araştırmada 150 adet S.pyogenes izolatı konvansiyonel y�ntemler ve streptokok grup A lateks kiti (Biomerieux, Fransa) ile tanımlanmış, antibiyotik duyarlılıkları Kirby-Bauer disk dif�zyon y�ntemiyle "Clinical and Laboratory Standards Institute- CLSI" �nerilerine g�re �alışılmış ve değerlendirilmiştir. DNA izolasyonu, ticari bir DNA izolasyon kiti (Qiagen, Almanya) kullanılarak �retici firma �nerileri doğrultusunda yapılmıştır. Vir�lans genleri multipleks polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) y�ntemiyle belirlenmiş, MLVF analizi bakteri genomu i�inde yer alan tekrarlayan dizilere �zg�l primerler kullanılarak multipleks PCR y�ntemiyle ger�ekleştirilmiştir. �alışma sonunda S.pyogenes izolatlarının tamamının penisilin G, sefotaksim, seftriakson, eritromisin, klindamisin, levofloksasin, kloramfenikol, vankomisin ve linezolide duyarlı olduğu belirlenmiştir. Pirojenik ekzotoksin genleri arasında en sık smeZ (%90.0), ardından speG (%88.0), speC (%58.7), ssa (%42.7), speA (%33.3), speJ (%24.0), speK (%18.7), speH (%14.0), speI (%13.3), speL ve speM (%9.3) saptanmıştır. Deoksiribon�kleaz genlerinden sdaB t�m izolatlarda (%100) saptanırken spd3, sdc, sdaD genleri sırasıyla %64.7, %36.0 ve %24.7 oranlarında tespit edilmiştir. Proteaz genleri (speB, spyCEP, scpA) ve inhibit�r genlerinden mac, izolatların tamamında pozitifken sic geni yalnız 3 (%2.0) izolatta pozitif olarak belirlenmiştir. MLVF analizinde her birinde iki veya daha fazla izolatın yer aldığı 32 farklı patern belirlenmiştir. İzolatların 91'i 32 farklı paternin herhangi birinde yer alırken, 59'u sporadik� izolat olarak tanımlanmıştır. Sonu� olarak, semptomatik tonsillo-farenjitli hastaların boğaz k�lt�rlerinden elde edilen S.pyogenes izolatlarının t�m antibiyotiklere duyarlı olduğu ve �ok y�ksek oranda vir�lans fakt�r geni taşıdıkları, ancak izolatların �oğunlukla klonal olarak ilişkisiz ve sporadik olduğu saptanmıştır. Bu �alışma, S.pyogenes izolatlarının MLVF y�ntemiyle tiplendirildiği ve �ok sayıda vir�lans fakt�r�n�n araştırıldığı T�rkiye'de yapılmış ilk araştırmadır.

Anahtar s�zc�kler: Streptococcus pyogenes; vir�lans fakt�rleri; MLVF y�ntemi.

ABSTRACT

Streptococcus pyogenes is an important bacterial pathogen that colonizes the throat and skin of human beings and causes a wide variety of diseases ranging from mild infections like pharyngitis, tonsillitis and impetigo to severe invasive infections such streptococcal toxic shock syndrome, septicemia, and necrotizing fasciitis, and produces a wide variety of virulence factors. The aim of this study was to investigate the antibiotic resistance, virulence genes; [pyrogenic exotoxin genes (speA, C, G, H, I, J, K, L, M, smeZ and ssa), deoxyribonuclease genes (sdaB, spd3, sdc ve sdaD), protease genes (speB, spyCEP ve scpA) and inhibitor genes (mac and sic)] of S.pyogenes strains isolated from throat cultures of patients with symptomatic tonsillo-pharyngitis and typing by multiple locus variable number tandem repeat fingerprinting (MLVF) method. One hundred and fifty S.pyogenes isolates were identified by conventional methods and streptococcus group A latex kit (Biomerieux, France). Antibiotic susceptibility tests were performed by Kirby-Bauer disk diffusion method as recommended by Clinical and Laboratory Standards Institute. DNA isolation was performed by using a commercial DNA isolation kit (Qiagen, Germany) in accordance with manufacturer's recommendations. The virulence genes were determined by multiplex PCR. MLVF method was performed with multiplex PCR using specific primers for repeated sequences within bacterial genome. All of the S.pyogenes isolates were susceptible to penicillin G, cefotaxime, ceftriaxone, chloramphenicol, clindamycin, erythromycin, levofloxacin, vancomycin and linezolid. Among streptococcal pyrogenic exotoxin genes the most frequent gene was smeZ (90.0%) followed by speG (88.0%), speC (58.7%), ssa (42.7%), speA (33.3%), speJ (24.0%), speK (18.7%), speH (14.0%), speI (13.3%), speL and speM (9.3%).� Of the DNase genes, sdaB was detected in all strains (100%), spd3, sdc, sdaD genes were determined as 64.7%, 36.0%, 24.7% respectively. Protease genes (speB, spyCEP, scpA) and mac gene from the inhibitor genes were positive in all strains, and sic gene was� positive in only 3 (2.0%) of the isolates. Thirty-two different patterns that contained two or more isolates were determined by MLVF analysis.� Ninety one isolates were included in any of the 32 different patterns, while 59 isolates were defined as sporadic� isolates. In conclusion, S.pyogenes isolates collected from throat cultures of patients with symptomatic tonsillo-pharyngitis in Konya/Turkey were susceptible to all antibiotics studied and have carried a very high rate of virulence factors. However the� isolates were mostly clonally unrelated and sporadic. This study is the first report in Turkey, in which S.pyogenes isolates were typed by the MLVF method and a large number of virulence factors were investigated.

Keywords: Streptococcus pyogenes; virulence factors; MLVF method.

Geliş Tarihi (Received): 19.01.2018 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 29.04.2018

GİRİŞ

Beta-hemolitik streptokoklar i�inde patojenitesi en y�ksek olan A grubu beta-hemolitik streptokokların (AGBHS) tek �yesi Streptococcus pyogenes geniş enfeksiyon yelpazesi nedeniyle klinik, laboratuvar ve epidemiyolojik olarak araştırılan bir mikroorganizma olmuştur. S.pyogenes, insanlarda boğaz ve cildi kolonize ederek farenjit, tonsillit ve impetigo gibi hafif enfeksiyonların yanı sıra streptokoksik toksik şok sendromu, septisemi ve nekrotizan fasiit gibi şiddetli invaziv enfeksiyonlara ve akut romatizmal ateş (ARA), akut glomer�lonefrit (AGN) gibi sekellere neden olan �eşitli vir�lans fakt�rlerine sahip �nemli bir bakteriyel patojendir1,2.

S.pyogenes y�zeyle ilişkili, sekretuvar fakt�rler ve toksinler gibi �nemli vir�lans fakt�rlerine sahiptir. S.pyogenes'in speA, C, G, H, I, J, K, L, M, smeZ ve ssa genlerince kodlanan �ok sayıda pirojenik ekzotoksin (Spe) tanımlanmıştır. Spe'ler s�per antijen olup konvansiyonel antijen işleme yolaklarını atlayan ve t�m�r nekroz fakt�r� (TNF)-alfa, interl�kin (IL)-1, TNF-beta, IL-2, interferon (IFN)-gama gibi sitokinlerin salınımını ind�kleyerek �ok sayıda T h�cresini aktive eden protein yapıda h�cre dışı toksinlerdir. �zellikle speA, speK, smeZ ve ssa genlerince kodlanan Spe'lerin streptokoksik toksik şok sendromuna neden oldukları d�ş�n�lmektedir. Kızıl hastalığındaki d�k�nt�lerin ortaya �ıkışında da SpeA ve SpeC'nin rol�� bulunmaktadır3,4.

S.pyogenes'in salgıladığı enzimlerden deoksiribon�kleaz (DNaz) DNA'yı depolimerize etmektedir. DNaz, enzimatik debridman yaparak ortamın akıcılığını artırmakta ve bakterinin yayılmasını sağlamaktadır. İmm�nolojik-elektroforetik olarak A, B, C, D şeklinde d�rt farklı tipe ayrılan DNaz'lar, B ve D n�kleazları ayrıca ribon�kleaz (RNaz) aktivitesine sahiptir5,6. speB, spyCEP ve scpA genlerinin kodladığı proteazlar ise S.pyogenes tarafından salgılanan ve doku yıkımına neden olan enzimlerdir. �nceden pirojenik ekzotoksin olduğu d�ş�n�lerek yanlış isimlendirilen speB, komplemanın C3b fakt�r�n� ve IL-1 ve imm�nglobulinler gibi imm�n yanıtta rol oynayan diğer bir�ok konak�ı fakt�r� inaktive edebilen bir sistein proteazdır. scpA geni tarafından kodlanan C5a peptidaz, S.pyogenes'in y�zeyinde bulunan bir C5a'ya spesifik serin proteazdır ve bakterinin kompleman sisteminden ve dolayısıyla n�trofillerin fagositozundan ka�masını sağlamaktadır7,8.

S.pyogenes enfeksiyonlarında tedavinin amacı klinik iyileşmeyi sağlamakla birlikte, ARA gelişmesini, s�p�ratif komplikasyonları ve bakterinin yayılmasını �nlemektir. Tedavide ilk se�enek penisilin grubu antibiyotiklerdir. G�n�m�zde bu grup bakterilerde hen�z penisilin direnci saptanmamıştır. Penisilin allerjisi olanlarda eritromisin veya diğer makrolidler kullanılabilir. S.pyogenes suşlarında makrolid direnci �zellikle makrolidlerin sık kullanıldığı �lkelerde y�ksektir9.

�S.pyogenes'in farklı coğrafi b�lgelerde vir�lans fakt�rleri ve antibiyotiklere diren� profilindeki değişiklikler, etken olduğu enfeksiyonların değişen epidemiyolojisini a�ıklayabilir. Bu �alışma, tonsillofarenjitli hastaların boğaz k�lt�rlerinden izole edilen S.pyogenes izolatlarının antibiyotiklere duyarlılıklarının saptanması, vir�lans genlerinin [pirojenik ekzotoksin genleri (speA, C, G, H, I, J, K, L, M, smeZ ve ssa), DNaz genleri (sdaB, spd3, sdc ve sdaD), proteaz genleri (speB, spyCEP ve scpA) ve inhibit�r genleri (mac ve sic)] belirlenmesi ve "multiple locus variable number tandem repeat fingerprinting (MLVF)" y�ntemiyle tiplendirilmesi amacıyla yapılmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

Bu �alışma, Sel�uk �niversitesi Tıp Fak�ltesi Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu onayı ile ger�ekleştirilmiştir (Tarih: 29.01. 2013 ve Karar No: 2013/01).

�eşitli kliniklere başvuran ve tonsillofarenjit �n tanısı alan hastaların boğaz s�r�nt� �rneklerinden elde edilen 150 adet S.pyogenes izolatı �alışmaya alındı. Boğaz s�r�nt� �rnekleri %5 koyun kanlı Columbia agara (Biomerieux, Fransa) ekilerek 35�C'de 18-24 saat ink�be edildi. İnk�basyon sonunda beta-hemoliz yapan kolonilere katalaz testi uygulandı. Katalaz negatif kolonilere Gram boyama yapıldı. Gram-pozitif boyanan kolonilerden %5 koyun kanlı agara ekim yapılarak basitrasin diski (0.04 �nite) ve trimetoprim-s�lfametoksazol (TMP-SXT) diski (1.25 μg trimetoprim + 23.75 μg s�lfametoksazol) yerleştirildi. Aerop koşullarda, 35�C'de bir gece ink�be edilerek basitrasin diski etrafında inhibisyon zonu bulunan ancak TMP-SXT diski etrafında inhibisyon zonu bulunmayan plaklardaki bakteriler olası AGBHS olarak tanımlandı. AGBHS olarak d�ş�n�len, streptokok grup A lateks kiti (Slidex Strepto Plus A, Biomerieux, Fransa) ile agl�tinasyon veren bakteriler AGBHS olarak doğrulandı.

Antibiyotik duyarlılık testi Kirby-Bauer disk dif�zyon y�ntemiyle "Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)" �nerileri doğrultusunda �alışıldı ve değerlendirildi. Kalite kontrol olarak Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 suşu kullanıldı10.

DNA izolasyonu ticari bir DNA izolasyon kiti (Qiagen, Almanya) kullanılarak �retici firma �nerileri doğrultusunda yapıldı. S.pyogenes suşlarında 20 vir�lans fakt�r geni (spd3, sdc, sdaB, sdaD, speB, spyCEP, scpA, mac, sic, speL, K, M, C, I, A, H, G, J, smeZ ve ssa) Tablo I'de belirtilen �zg�l primerler kullanılarak multipleks polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) y�ntemiyle araştırıldı. Amplifikasyon �r�nleri %1.5 SeaKemLE agaroz jelde y�r�t�ld�kten sonra etidyum brom�r ile boyandı ve �alışılan genlere uygun baz �ifti amplikon varlığı pozitif olarak değerlendirildi. sdaB, speB, spyCEP, scpA ve mac genlerinin primerleri t�m AGBHS suşlarında bulunan kromozomal genleri tespit etmesi nedeniyle PCR amplifikasyonu sırasında pozitif kontrol olarak kullanıldı11.


Tablo I

MLVF y�ntemi i�in bakteri genomu i�inde yer alan tekrarlayan sekanslara �zg�l Tablo II'de verilen primerler kullanılarak multipleks PCR yapıldı12. Amplifikasyon �r�nleri %2.5 NuSieve agaroz jelde y�r�t�ld�kten sonra etidyum brom�r ile boyandı. DNA bant profillerinin dendrogramı "Gel Compar II" yazılımı (versiyon 6.0; Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Bel�ika) kullanılarak �izildi ve "clusterler Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA)" y�ntemiyle belirlendi.


Tablo II

BULGULAR

�alışmada� kullanılan izolatların elde edildiği hastaların yaş aralığının 6-25 yıl arasında olduğu belirlenmiştir. Hastaların yaş dağılımı; 6-10 yaş grubunda 33 (%22) hasta, 11-15 yaş grubunda 76 (%51) hasta, 16-20 yaş grubunda 29 (%19) hasta ve 20-25 yaş grubunda 12 (%8) hasta olarak saptanmıştır. Hastaların cinsiyete g�re dağılımı da incelenmiş ve 76 (%51) hastanın kadın, 74 (%49) hastanın ise erkek olduğu tespit edilmiştir.

Boğaz k�lt�rlerinden izole edilen 150 adet S.pyogenes izolatının tamamının penisilin G, sefotaksim, seftriakson, eritromisin, klindamisin, levofloksasin, kloramfenikol, vankomisin ve linezolide duyarlı olduğu belirlenmiştir.

Pirojenik ekzotoksin genleri arasında en sık smeZ (%90.0) geni, ardından speG (%88.0), speC (%58.7) ve en az sıklıkta ise speL ve speM genleri (%9.3) saptanmıştır (Tablo III). DNaz genlerinden sdaB t�m izolatlarda saptanırken spd3 97 (%64.7), sdc 54 (%36.0) ve sdaD 37 (%24.7) izolatta tespit edilmiştir. Proteaz genleri (speB, spyCEP, scpA) ve inhibit�r genlerinden mac izolatların tamamında pozitifken sic geni sadece 3 (%2.0) izolatta pozitif olarak belirlenmiştir. Multipleks PCR ile saptanan vir�lans genlerinin �rnek jel g�r�nt�leri Resim 1,2,3,4'te g�sterilmiştir.


Tablo III

Resim 1

Resim 2

Resim 3

Resim 4

MLVF y�ntemi ile tiplendirilen 150 S.pyogenes izolatında, MLVF paternleri en az �� banttan (altı� izolat) oluşmuştur. En yaygın paternler 4 (56 izolat) ya da 5 (58 izolat) bant i�ermektedir. B�t�n primerlerin pozitif olduğu yedi bant i�eren iki izolat ve altı bant i�eren 28 izolat saptanmıştır. MLVF analizinde iki veya daha fazla izolatın yer aldığı 32 farklı patern belirlenmiştir.� İzolatların 91'i 32 farklı paternin herhangi birinde yer alırken, 59'u sporadik izolat olarak tanımlanmıştır.� En b�y�k iki k�me 19 ve 24, sırasıyla altı ve beş izolattan oluşmuştur (Şekil 1). İzolatların MLVF paternleriyle vir�lans �zellikleri arasında ilişki saptanmamıştır. MLVF y�ntemi ile aynı paternde yer alan izolatların vir�lans genleri farklı bulunmuştur.


Şekil 1

TARTIŞMA

S.pyogenes, farenjitten şiddetli invaziv enfeksiyonlara ve nekrotizan fasiite kadar değişen �eşitli klinik durumlara neden olan �nemli bir bakteriyel patojendir. T�rkiye'de AGBHS enfeksiyonlarının klinik, epidemiyolojik ve mikrobiyolojik �zellikleriyle ilgili �alışmalar yetersizdir. İnvaziv AGBHS enfeksiyonlarıyla ilgili olarak �lkemizde yapılan ilk toplum k�kenli s�rveyans �alışmasında, Amerika Birleşik Devletleri, Kanada ve Avrupa �lkeleri ile karşılaştırıldığında invaziv AGBHS hastalıklarının T�rkiye'de d�ş�k endemisiteye sahip olduğu g�r�lm�şt�r13.

S.pyogenes farenjitinin doğru tanısı ve uygun antimikrobiyal tedavisi, ARA ve s�p�ratif komplikasyonların �nlenmesi, klinik belirti ve bulguların iyileştirilmesi, bulaşıcılığın hızla d�ş�r�lmesi, aile �yeleri ve hastanın diğer temas ettiği kişilere ge�işin azaltılması i�in �nemlidir. Tedavide dar antibakteriyel spektrumu ve d�ş�k maliyeti dikkate alındığında ilk tercih olarak penisilin, penisilin allerjisi olan bireylerde birinci kuşak sefalosporinler (anafilaksisi olmayanlar i�in) veya makrolidler �nerilmektedir. S.pyogenes suşlarında hen�z penisiline diren� bildirilmemiştir ancak makrolidlere karşı diren� d�nyanın bazı b�lgelerinde olduk�a yaygındır ve tedavi başarısızlığına neden olmaktadır. Coğrafi b�lgeler ve yıllara g�re diren� oranları değişiklik g�stermektedir. İspanya'da 1994-2006 yılları arasında eritromisin direnci %32.8 oranında saptanırken, 2005-2012 yılları arasında %7.0'a, 2012 yılında ise %2.8'e d�şt�ğ� bildirilmiştir14,15. Van Heirstraeten ve arkadaşları16 Bel�ika'da 1999-2009 yılları arasında tonsillofarenjit ve invaziv hastalıklardan izole edilen 11.189 S.pyogenes izolatını incelemişler, 1999-2006 yılları arasında makrolid direncinin %13.5'ten %3.3'e d�şt�ğ�n�, sonraki yıllarda da aynı d�zeyi koruduğunu belirtmişlerdir. �in'de yapılan bir araştırmada 2011 yılında kızıl ve tonsillit olgularından izole edilen 71 AGBHS izolatının tamamının eritromisine diren�li olduğu tespit edilmiştir17.

�lkemizde Kara ve arkadaşları18 tarafından yapılan sekiz merkezin katıldığı �alışmada eritromisine orta derecede duyarlılık oranı %2, diren� oranı ise %1.3 olarak bildirilmiştir. Bayramoğlu ve arkadaşları19 tarafından yapılan bir �alışmada da 22 invaziv izolattan 1 (%4.5)'i eritromisine orta duyarlı bulunmuştur. Akg�n Karapınar ve arkadaşları20 tarafından yapılan �alışmada, eritromisine diren� oranları 2009 yılında %2.8, 2010 yılında %3.4, 2011 yılında %2.8, 2012 yılında %5.1 ve 2013 yılında %3.6 olarak bulunmuştur.

�alışmamızda tonsillit olgularından elde edilen 150 S.pyogenes izolatının tamamının penisilin G, sefotaksim, seftriakson, eritromisin, klindamisin, levofloksasin, vankomisin ve linezolide duyarlı olduğu belirlenmiştir. Daha �nce yaptığımız bir �alışmada da �eşitli klinik �rneklerden elde edilen 35� izolatın hi�birisinde penisilin, eritromisin, linkomisin, gentamisin, vankomisin ve linezolid direnci saptanmamış; altı izolatta levofloksasin direnci tespit edilmiştir21. �lkemiz verilerine bakıldığında zaman zaman y�ksek diren� oranları bildirilmesine rağmen genel olarak Avrupa �lkeleri ile uyumlu diren� oranları izlenmektedir. Bunun nedeni, son yıllarda antibiyotik direnci konusunda bilincin artması veya ampirik tedavide eritromisinin sık tercih edilmemesi olabilir.

S.pyogenes vir�lansını artıran bir�ok fakt�re sahiptir; y�zey antijenleri, toksinler ve enzimler. S.pyogenes'in vir�lans fakt�rlerini belirlemek ve şiddetli S.pyogenes enfeksiyonlarının gelişmesiyle ilişkili mekanizmaları anlamak i�in bir�ok �alışma yapılmaktadır. Rivera ve arkadaşlarının22 �alışmasında invaziv ve noninvaziv enfeksiyonlardan izole edilen 126 AGBHS izolatının s�perantijen gen profilini araştırmış, speB ve speF genlerini t�m izolatlarda speA, speC, speG,speH, speI, speJ, speL, speM, ssa ve smeZ genlerini sırasıyla %31.7, %44.4, %84.1, %23.8, %19, %33.3, %8.7, %32.5, %28.6 ve %91.7 oranlarında� bulunmuştur. Meisal ve arkadaşları23 262 invaziv izolat ile yaptıkları �alışmada, s�perantijen genlerinden speA, speB, speC, speF, speG, speH, speI, speJ, speK, speL, speM, smeZ ve ssa sıklığını sırasıyla %26.3, %99.6, %68.7, %98.1, %89.3, %29.0, %27.9, %41.2, %19.8, %3.4, %22.9, %98.5 ve %20.6 olarak tespit etmiştir. �in'de 71 AGBHS izolatının molek�ler �zellikleri �zerine yapılan bir �alışmada 10 vir�lans geni araştırılmış, speC, smeZ ve slo genleri b�t�n izolatlarda saptanırken, speF ve ssa genleri %97.2'sinde, speG geni %95.8'inde, speH ve speI genleri %80.3'�nde, speA geni %15.5'inde ve speJ geni %12.7'sinde tespit edilmiştir17.

�lkemizde yapılan bir �alışmada, hastalardan ve taşıyıcılardan izole edilen AGBHS'lerin t�m�nde speB geni saptanırken speA, speC, speG ve smeZ genleri sırasıyla %30.2, %49.6, %80.6 ve %19.4 oranlarında tespit edilmiştir. Taşıyıcılar ve hastalar arasında vir�lans gen varlığı a�ısından fark bulunmamıştır24. Bir başka �alışmada, 134 �ğrencinin boğaz k�lt�r�nden S.pyogenes izole edilerek toplam 25 (%18.6) izolatta pirojenik toksin geni bulunmuş; bunların 11 (%8.2)'inde speA, 12 (%8.9)'sinde speC ve 2 (%1.5)'sinde her iki gen birden saptanmıştır25. Bizim �alışmamızda pirojenik ekzotoksin genleri arasında en sık smeZ (%90), ardından speG (%88), speC (%58.7), ssa (%42.7), speA (%33.3), speJ (%24), speK (%18.7), speH (%14), speI (%13.3), speL ve speM (%9.3) belirlenmiştir. �alışmamızda� diğer �lkelerde yapılan �alışmalarla uyumlu olarak smeZ ve speG genleri en sık saptanan genler olmuştur. Ancak �lkemizde yapılan smeZ ve speG genlerinin araştırıldığı tek �alışmada smeZ geni olduk�a d�ş�k oranda (%19.4) bulunurken speG gen (%80.6) varlığı �alışmamızla ve literat�rle benzer olarak saptanmıştır24.� Bu durum �alışmanın yapıldığı b�lgenin, hasta grubunun ve o b�lgede endemik olarak bulunan izolatların farklı olmasından kaynaklanmış olabilir. Streptokoksik toksik şok sendromu ve kızılla ilişkili olduğu d�ş�n�len ve en �ok araştırılan speA geni de �alışmamızda Avrupa verileri22,23� ve �lkemizden Cengeloglu ve arkadaşları24 tarafından yapılan �alışma ile uyumlu olarak izolatların %33'�nde saptanmıştır. Ancak, Otlu ve arkadaşları25 tarafından yapılan �alışmada speA olduk�a d�ş�k oranda (yaklaşık %10) bulunmuştur. Bunun nedeni s�z konusu �alışmanın hastalardan değil, taşıyıcılardan elde edilen izolatlardan yapılması olabilir.

�alışmamızda DNaz genlerinden sdaB t�m izolatlarda saptanırken spd3, sdc, sdaD genleri sırasıyla %64.7, %36.0 ve %24.7 oranlarında tespit edilmiştir. Proteaz genleri (speB, spyCEP, scpA) ve inhibit�r genlerinden mac suşların tamanında, sic geni ise sadece 3 (%2.0) izolatta pozitif olarak tespit edilmiştir. sdaB, speB, spyCEP, scpA ve mac genleri t�m AGBHS izolatlarında kromozomal olarak kodlanan genler olduğu i�in t�m izolatlarda pozitif olarak� saptanmaktadır11. Bu genlerden en �ok �alışılan speB geni �alışmamızda olduğu gibi bir�ok �alışmada da %100 oranında saptanmıştır22,24.

MLVA/MLVF izolatlar arasındaki klonal ilişkiyi belirlemek i�in kullanılan PCR tabanlı bir y�ntemdir. Y�ntemin prensibi genom i�indeki tekrarlayan dizileri ve tekrar sayısının saptanmasıdır. Bu y�ntem �eşitli gram-pozitif ve gram-negatif bakterileri tiplendirmek i�in kullanılmaktadır26,27. S.pyogenes izolatlarının molek�ler �zelliklerinin araştırılması i�in emm tiplendirmesi ve "pulsed field gel" elektroforezi (PFGE) sıklıkla kullanılmaktadır. Son yıllarda Streptococcus agalactiae veya S.pyogenes gibi streptokokları tiplendirmek i�in de MLVA/MLVF y�ntemleri geliştirilmiştir12,28. S.pyogenes izolatlarında MLVA/MLVF kullanımını veya faydalarını belirten d�nyada birka� �alışma bulunmaktayken �lkemizde bu konuda� herhangi bir �alışma yapılmamıştır. Bizim �alışmamızda 150 S.pyogenes izolatının MLVF analizinde iki veya daha fazla izolatın yer aldığı 32 farklı patern belirlenmiştir. İzolatların 91'i 32 farklı paternin herhangi birinde yer alırken, 59'u sporadik izolat olarak tanımlanmıştır. İzolatların MLVF paternleriyle vir�lans �zellikleri arasında ilişki saptanmamıştır. MLVF y�ntemiyle aynı paternde yer alan izolatların vir�lans fakt�rleri farklı bulunmuş, başka bir deyişle aynı vir�lans fakt�rlerine sahip izolatlar farklı MLVF paternlerinde yer almıştır. Sırbistan'da yapılan bir �alışmada da 103 S.pyogenes izolatının klonal ilişkisi emm tiplendirme, MLST, MLVA, faj ve vir�lans fakt�r� profilleme y�ntemleriyle araştırılmış, MLVA analizi ve vir�lans fakt�rleri profilleme y�ntemleri ile farklı paternler belirlenmiştir29.

Bu �alışmanın kısıtlılığı proje b�t�esi nedeniyle klonal ilişki araştırmak i�in altın standart y�ntem olan PFGE ile MLVF'nin karşılaştırılamamasıdır. Ancak daha �nceki �alışmalarımızda uyguladığımız emm tiplendirme, MLST ve PFGE ile kıyaslarsak MLVF y�ntemi uygulaması kolay, ��z�n�rl�ğ� y�ksek, �zel ekipman gerektirmeyen, emek ve zaman a�ısından avantajlı ve ucuz bir y�ntemdir. �in'de yapılan bir �alışmada �eşitli klinik �rneklerden ve farklı b�lgelerden izole edilen S.pyogenes izolatları �eşitli y�ntemlerle genotiplendirilmiş, emm tiplendirme ve PFGE ile karşılaştırıldığında MLVA/MLVF'nin izolatlar arasında daha iyi ayırım sağladığını, PFGE profilleri i�erisindeki �eşitliliği tespit edebildiğini bildirmiştir30.

Sonu� olarak, �alışmamızda semptomatik tonsillofarenjitli hastaların boğaz k�lt�rlerinden elde edilen S.pyogenes izolatları t�m antibiyotiklere duyarlıdır ve y�ksek oranlarda vir�lans genleri taşımaktadır. Ancak izolatların �oğunlukla klonal olarak ilişkisiz ve sporadik olduğu saptanmıştır. Bu �alışma, S.pyogenes izolatlarının MLVF y�ntemiyle tiplendirildiği ve �ok sayıda vir�lans geninin araştırıldığı T�rkiye'de ilk araştırmadır. Değişik boyuttaki �eşitli� gen b�lgelerinin amplifikasyonu ve �retilen bant paternlerinin karşılaştırılması esasına dayanan MLVF y�ntemi, uygulaması kolay ve ayırım g�c� y�ksek bir y�ntemdir. D�ş�k ��z�n�rl�ğe sahip, pahalı, uzun zaman alan ve yoğun emek harcanan y�ntemlere g�re avantajlıdır.

KAYNAKLAR

  1. Koneman E, Winn W, Allen SD, et al. The gram positive cocci Part II: Streptococci, Enterococci, and the "Streptococci-Like" bacteria, pp: 672-764. In: Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 2006, 6th ed. Lippincot Wiliams and Wilkins,� Baltimore, USA.
  2. �zenci H. Streptococus. pp: 412-29. In: Klinik Mikrobiyoloji (Manual of Clinical Microbiology, 9th ed, 2007 �evirisi). Başustaoğlu AC (�eviri ed.). 2009. Atlas Kitap�ılık, Ankara.
  3. Taylor AL, Cross EL, Llewelyn MJ. Induction of contact-dependent CD8+ regulatory T cells through stimulation with staphylococcal and streptococcal superantigens. Immunology 2012; 135(2): 158-67.
  4. Commons RJ, Smeesters PR, Proft T, Fraser JD, Robins-Browne R, Curtis N. Streptococcal superantigens: categorization and clinical associations. Trends Mol Med 2014; 20(1):48-62.
  5. Uchiyama S, Andreoni F, Schuepbach RA, Nizet V, Zinkernagel AS. DNase Sda1 allows invasive M1T1 Group A Streptococcus to prevent TLR9-dependent recognition. PLoS Pathog 2012; 8(6): e1002736.
  6. Anbalagan S, Chaussee MS. Transcriptional regulation of a bacteriophage encoded extracellular DNase (Spd-3) by Rgg in Streptococcus pyogenes. PLoS One 2013; 8(4): e61312.
  7. Hynes W. Virulence factors of the group A streptococci and genes that regulate their expression. Front Biosci 2004; 9: 3399-433.
  8. Terao Y. The virulence factors and pathogenic mechanisms of Streptococcus pyogenes.� J Oral Biosci 2012; 54(2): 96-100.
  9. Chiappini E, Regoli M, Bonsignori F, et al. Analysis of different recommendations from international guidelines for the management of acute pharyngitis in adults and children. Clin Ther 2011; 33(1): 48-58.
  10. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Third Informational Supplement. CLSI document M100-S23. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pennsylvania USA, 2013.
  11. Borek AL, Obszanska K, Hryniewicz W, Sitkiewicz I. Detection of Streptococcus pyogenes virulence factors by multiplex PCR. Virulence 2012; 3(6): 529-33.
  12. Obszanska K, Borek AL, Hryniewicz W, Sitkiewicz I. Multiple locus VNTR fingerprinting (MLVF) of Streptococcus pyogenes. Virulence 2012; 3(6): 539-42.
  13. Topkaya AE, Balıkcı A, Aydın F, et al. Epidemiology, clinical and microbiological characteristics of invasive streptococcal infections in Turkey, 2010-2011. Mikrobiyol Bul 2014; 48(1): 1-13.
  14. Rubio-L�pez V, Valdezate S, �lvarez D, et al. Molecular epidemiology, antimicrobial susceptibilities and resistance mechanisms of Streptococcus pyogenes isolates resistant to erythromycin and tetracycline in Spain (1994-2006). BMC Microbiol 2012; 12: 215.
  15. Montes M, Tamayo E, Mojica C, Garc�a-Arenzana JM, Esnal O, P�rez-Trallero E. What causes decreased erythromycin resistance in Streptococcus pyogenes? Dynamics of four clones in a southern European region from 2005 to 2012. J Antimicrob Chemother 2014; 69(6): 1474-82.
  16. Van Heirstraeten L, Samuel Coenen, Christine Lammens, Hens N, Goossens H, Malhotra-Kumar S. Antimicrobial drug use and macrolide-resistant Streptococcus pyogenes, Belgium. Emerg Infect Dis 2012; 18(9): 1515-8.
  17. Wang HB, Song YY, You YH, et al. Molecular epidemiological analysis of group A Streptococci isolated from children in Chaoyang District of Beijing, 2011: emm types, virulence factor genes and erythromycin resistant genes. Biomed Environ Sci 2013; 26(9): 782-4.
  18. Kara A, �zkaya Parlakay A, G�r D, et al. Grup A beta hemolitik streptokok T�rkiye makrolid diren� değerlendirmesi pilot �alışma sonu�ları. J Pediatr Inf 2011; 5(3): 96-9.
  19. Bayramoğlu G, Topkaya AE, Balıkcı A, Aydın F. Serotypes and antimicrobial susceptibilities of invasive group A streptococci identified in eastern Black Sea region of Turkey. Mikrobiyol Bul 2011; 45(3): 446-53.
  20. Akg�n Karapınar DB, Yılmaz M, �zbayrak A, Kaygusuz A, G�rler N, Salman N. Streptococcus pyogenes'te eritromisin direnci: 2009-2013. ANKEM Derg 2015; 29(1): 26-30.
  21. Arslan U, Oryaşın E, Eskin Z, et al.� Distribution of emm genotypes and antibiotic susceptibility of Streptococcus pyogenes strains: analogy with the vaccine in development. Mikrobiyol Bul 2013; 47(2): 318-23.
  22. Rivera A, Rebollo M, Miro E, et al. Superantigen gene profile, emm type and antibiotic resistance genes among group A streptococcal isolates from Barcelona, Spain. J Med Microbiol 2006; 55(8): 1115-23.
  23. Meisal R, Andreasson IKG, Hoiby EA, Aaberge IS, Michaelsen TE, Caugant DA. Streptococcus pyogenes Isolates Causing Severe Infections in Norway in 2006 to 2007: emm Types, Multilocus Sequence Types, and Superantigen Profiles. J Clin Microbiol 2010; 48(3): 842-51.
  24. Mengeloglu FZ, Aktas E, Otlu B, et al. Evaluation of emm gene types, toxin gene profiles and clonal relatedness of group A streptococci. Bosn J Basic Med Sci 2013; 13(3): 163-9.
  25. Otlu B, Karakurt C, Bayındır Y, Kayabaş �, Yakupoğulları Y, G�z�kara Bağ H. İlkokul �ocuklarında Streptococcus pyogenes taşıyıcılığı: M-protein tipleri, pirojenik toksin genleri ve izolatlar arası klonal ilişkinin araştırılması. Mikrobiyol Bul 2015; 49(3): 301-13.
  26. Luczak-Kadlubowska A, Sabat A, Tambic-Andrasevic A, Payerl-Pal M, Krzyszton-Russjan J, Hryniewicz W. Usefulness of multiple-locus VNTR fingerprinting in detection of clonality of community- and hospital-acquired Staphylococcus aureus isolates. Antonie Van Leeuwenhoek 2008; 94(4): 543-53.
  27. Jabalameli F, Mirsalehian A, Sotoudeh N, et al. Multiple-locus variable number of tandem repeats (VNTR) fingerprinting (MLVF) and antibacterial resistance profiles of extended spectrum beta lactamase (ESBL) producing Pseudomonas aeruginosa among burnt patients in Tehran. Burns 2011; 37(7): 1202-7.
  28. Radtke A, Lindstedt BA, Afset JE, Bergh K. Rapid multiple-locus variant-repeat assay (MLVA) for genotyping of Streptococcus agalactiae. J Clin Microbiol 2010; 48(7): 2502-8.
  29. Opavski N, Gajic I, Borek AL, et al. Molecular characterization of macrolide resistant Streptococcus pyogenes isolates from pharyngitis patients in Serbia. Infect Genet Evol 2015; 33: 246-52.
  30. You Y, Wang H, Bi Z, et al. Molecular typing of Chinese Streptococcus pyogenes isolates. Mol Cell Probes 2015; 29(3): 172-6.

İletişim (Correspondence):

Do�. Dr. Hatice T�rk Dağı,

Sel�uk �niversitesi Tıp Fak�ltesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

42131, Sel�uklu, Konya, T�rkiye.

Tel (Phone): + 90 505 253 3638,

E-posta (E-mail): haticeturkdagi@yahoo.com

Yazdır