Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2018; 52(4): 376-389

Bazı Dezenfektanların Candida albicans �zerine Antifungal Aktivitelerinin İncelenmesi

Investigation of Antifungal Activities of Some Disinfectants on Candida albicans

Ali �ZT�RK1, Ayşe KALKANCI2

1 Niğde �mer Halisdemir �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Niğde.

1 Niğde �mer Halisdemir University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Niğde, Turkey.

2 Gazi �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

2 Gazi University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

* Bu �alışma doktora tez �alışması olarak ger�ekleştirilmiş olup, T�rkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (T�BİTAK) 1001 başlığı altında, SBAG 113S383 kodlu proje kapsamında desteklenmiştir.

�Z

Dezenfektanlar mantar h�cresinde fungisidal veya fungistatik etki g�sterebilir. Dezenfektanların fungal h�cre �zerindeki etki mekanizmasının bakterilerde g�r�len antibakteriyel etkiye benzer olduğu d�ş�n�lmektedir. Bu �alışmada bazı dezenfektanların Candida albicans'a karşı etkinliklerinin g�sterilmesi ve vir�lans ile diren� arasında bir ilişki olup olmadığının araştırılması ama�lanmıştır. �alışmada, �eşitli klinik �rneklerden elde edilen 417 C.albicans ile bir referans izolatının dezenfektanlara karşı duyarlılıkları saptanmıştır. Dezenfektanların minimum inhibit�r konsantrasyonu (MİK) ve minimum fungisidal konsantrasyonu (MFK) değerleri buyyon mikrodil�syon (BMD) y�ntemiyle elde edilmiştir. MİK ve MFK değerleri kullanılarak epidemiyolojik sınır değerleri (ECV) belirlenmiştir. Dezenfektan duyarlı ve diren�li izolatlarda membran ge�irgenliğinin incelenmesi i�in kristal viyole deneyi yapılmıştır. Se�ilen izolatlarda atım� pompalarının sayıca artışını g�stermek i�in rhodamin 6G (R6G) floresans boyası kullanılmıştır. Vir�lans ile dezenfektan direnci arasında ilişki olup olmadığı in vitro ve in vivo olarak araştırılmıştır. Salgısal asit proteinaz (SAP), fosfolipaz, esteraz, hemolitik aktivite ve slime fakt�r �retimi gibi vir�lans fakt�rleri in vitro olarak incelenmiştir. İn vivo vir�lans deneyi ise Galleria mellonella larvalarında enfeksiyon modeli oluşturularak ger�ekleştirilmiştir. Vir�lans fakt�rleri ile dezenfektan direnci arasındaki ilişki G.mellonella larva modelinin mortalite oranlarına g�re değerlendirilmiştir. Benzalkonyum klor�r (BZK) ve klorheksidin diglukonat (CHX) i�in MİK değerleri 0.25-8 mg/L arasında, triklosan (TRC) i�in MİK değerleri 0.06-4 mg/L ve sodyum hipoklorit (SHC) i�in MİK değerleri 256-16.384 mg/L arasında bulunmuştur. ECV sınır değerleri BZK, CHX, TRC ve SHC i�in sırasıyla 4 mg/L, 2 mg/L, 1 mg/L ve 4096 mg/L olarak belirlenmiştir. Kristal viyole alım y�zdesi, duyarlı izolatta %26.5-57.6 arasında, diren�li izolatlarda ise %33-79.2 arasında bulunmuştur. Dezenfektan direncinin atım pompalarıyla ilişkili olduğu sonucuna varılmıştır. İn vitro vir�lans deneyinde kullanılan izolat sayısının az olması nedeniyle dezenfektan direnci ile vir�lans fakt�rleri arasındaki ilişki kesin kanıtlar eşliğinde değerlendirilememiştir. Dezenfektan diren�li izolatlarla oluşan enfeksiyonların mortalitesi, dezenfektan duyarlı izolattan farklı bulunmamıştır. Bu �alışmanın sonucunda, 417 izolat i�inde BZK, CHX, SHC ve TRC'ye diren�li izolatlar olduğu belirlenmiştir. Dezenfektanların giriş ve �ıkışının C.albicans'ın h�cre membranındaki atım pompalarıyla ilişkili olduğu g�sterilmiştir.

Anahtar s�zc�kler: Candida albicans; dezenfektan; diren�; vir�lans; Galleria mellonella.

ABSTRACT

Disinfectants may have fungicidal or fungistatic effects against fungal cells. The mechanism of action of disinfectants on fungal cells believed to be similar to the antibacterial activity. The aim of this study was to demonstrate the efficacy of some disinfectants against Candida albicans and to investigate the relationship between virulence and disinfectant resistance. In this study, the susceptibility of 417 clinical C.albicans and reference isolates against disinfectants were determined. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) values of disinfectants were obtained by using broth microdilution (BMD) assay. Epidemiological cut-off values (ECVs) were determined by using the MIC and MFC values. Crystal violet assay was carried out to investigate membrane permeability in disinfectant resistant and susceptible isolates. Rhodamine 6G (R6G) flourescence stain was used to show the increase in the number of efflux pumps among selected isolates. The relationship between virulence and disinfectant resistance was determined by in vitro and in vivo investigations. Virulence factors secretory acid proteinase (SAP), phospholipase, esterase, hemolytic activity and slime factor production were examined in vitro. In vivo virulence assay was performed by infecting Galleria mellonella larvae. The relationship between virulence factors and disinfectant resistance was evaluated according to the mortality rates of G.mellonella larvae. The range of MIC values for benzalkonium chloride (BZC) and chlorhexidine digluconate (CHX), triclosan (TRC) and sodium hypochlorite (SHC) were 0.25-8 mg/L, 0.06-4 mg/L and 256-16.384 mg/L, respectively. ECV values for BZC, CHX, TRC and SHC were determined as 4, 2, 1 and 4096 mg/L, respectively. The rate of crystal violet uptake was found between 26.5-57.6% for disinfectant susceptible isolates, and between 33-79.2% for resistant isolates. It is concluded that the disinfectant resistance was related with efflux pumps. Due to the lack of number of isolates that were used in this assay, the relationship between disinfectant resistance and virulence factors could not be assessed. There was no difference in the mortality of larvae infections caused by disinfectant resistant and susceptible isolates. As a result, in this study, resistant isolates� against BZC, CHX, SHC and TRC were found among 417 isolates. Input and output of disinfectants were found to be associated with the cell membrane efflux pumps of C.albicans.

Keywords: Candida albicans; disinfectant; resistance; virulence; Galleria mellonella.

Geliş Tarihi (Received): 03.04.2018 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 10.09.2018

GİRİŞ

Dezenfektanlar, hastane ortamında y�zeylerin veya �r�nlerin kontaminasyondan korunmasında kullanılan antimikrobiyal etkili kimyasallardır. Dezenfektanlar mantar h�cresinde fungisidal veya fungistatik etki g�sterebilmektedir. Antifungal etkinin mekanizması ile bakterilerde g�r�len antibakteriyel etki arasında benzerlikler bulunduğu d�ş�n�lmektedir. Mikroorganizmaların h�cre yapısında dezenfektanların etkisini g�sterdiği birden fazla hedef bulunmaktadır. Bu nedenle dezenfektanlara karşı bakteriyel diren�, hedef b�lgede ya da metabolik aktivitelerinde bir modifikasyon sonucu ortaya �ıkmakta ve intrensek ya da kazanılmış diren� olarak gelişmektedir1.

Mantar h�cresinde dezenfektanların hedefi h�cre membranı, ribozomlar, proteinler ve n�kleik asitler gibi yapılardır. �rneğin, gluteraldehidin h�cre duvarına, kuarterner amonyum bileşiklerinin h�cre membranına, alkilleyici ajanların proteinlere, ağır metallerin fungal enzimlere etki ettikleri belirtilmiştir2.

Candida albicans, �eşitli vir�lans fakt�rlerine sahip olup, bunları konak savunma sistemleri tarafından yok edilmelerini �nlemek i�in kullanmaktadır. Vir�lans fakt�rleri yardımıyla C.albicans mikrobiyal flora ile rekabet ederek konağın farklı b�lgelerinde enfeksiyonlara neden olabilmektedir. Patojenite kriterleri denilen bu fakt�rler C.albicans ve diğer Candida t�rlerinin vir�lansını belirlemektedir. Vir�lans fakt�rlerinin �nemi en fazla C.albicans t�r�nde g�sterilmiştir3.

Mikroorganizmaların patojenite ve vir�lansının araştırılması i�in daha �ok memeli hayvan modelleri kullanılmaktadır. Memeli hayvanlar ile yapılan �alışmaların sonucunda elde edilen bilgiler, enfeksiyonların tanı ve tedavisi i�in �nem kazanmıştır. Ancak son yıllarda deneysel hayvan modellerinin kullanımı ile ilgili �eşitli kısıtlamalar ve zorluklar yaşanmaktadır. Deney hayvanları ile �alışma yapılabilmesi i�in sertifika zorunluluğunun getirilmiş olması, etik kuralların gittik�e ağırlaştırılması gibi nedenlerin yanı sıra bu t�r deneylerin zaman alıcı ve zor olması g�n�m�zde hayvan modeli olarak omurgasız hayvanların kullanımını g�ndeme getirmiştir4.�

Omurgasız canlılar arasında yer alan ve bal mumu g�vesi olarak bilinen Galleria mellonella, mikroorganizmaların vir�lansının ve konak yanıtının araştırılmasında kullanılmaktadır. Bu canlılar diğer memeli modeller ile karşılaştırıldığında ekonomik olmaları, etik kurul onayı gerektirmemeleri ve kolay uygulanımları nedeniyle son yıllarda ilgi �ekmeye başlamıştır. G.mellonella vir�lans �alışmaları i�in iyi bir fizyolojik model oluşturmakta ve laboratuvar şartlarında kolayca yetiştirilmektedir4.�

Bu �alışmada, Gazi �niversitesi Tıp Fak�ltesi Hastanesi, Mikrobiyoloji Laboratuvarı k�lt�r koleksiyonunda bulunan C.albicans izolatları �zerinde, bazı dezenfektanların etkilerinin g�sterilmesi, dezenfektan direncinin varlığının araştırılması ve vahşi izolatların oluşturacağı enfeksiyonlar ile dezenfektanlara diren�li izolatların oluşturacağı enfeksiyonların G.mellonella larvası modeli kullanılarak karşılaştırılması ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

Candida albicans İzolatları

�alışmaya Gazi �niversitesi Tıp Fak�ltesi Hastanesi, Mikrobiyoloji Laboratuvarında 2010-2015 yılları arasında �eşitli klinik �rneklerden izole edilen 417 C.albicans izolatı ve bir ATCC standart izolat (C.albicans 10231) dahil edildi. İzolatlar saklama t�plerine (mikrobank) konularak �alışmanın yapılacağı g�ne kadar -80�C'de muhafaza edildi. Saklanan izolatlar Sabouraud Dekstroz Agar (SDA)'da �retildi.

Dezenfektanlar

�alışmada, benzalkonyum klor�r (BZK; Sigma, B6295), klorheksidin diglukonat (CHX; Sigma, C9394), sodyum hipoklorit (SHC; Sigma, 425044) ve triklosan (TRC; Irgasan; Sigma, 72779) kullanıldı. BZK bir kuarterner amonyum bileşiği olup geniş spektrumlu bir antimikrobiyal ila�tır5. CHX kuarterner amonyum yapılı, bis-biguanid bileşiğidir. Antiseptik ama�lı en yaygın kullanılan dezenfektanlardan biridir6. SHC, en yaygın kullanılan klor i�eren dezenfektandır7. TRC ise sentetik, iyonize olmayan, geniş spektrumlu bir antimikrobiyal ila�tır8.

Dezenfektanların konsantrasyonları �n �alışma yapılarak belirlendi. Dezenfektanların kullanılan dil�syonlarından elde edilen MİK değerleri 5-6. kuyucuğa gelecek şekilde dil�syonları tespit edildi. MİK değerleri ortanca dil�syonlarda olacak şekilde dezenfektan konsantrasyonu belirlendi. BZK'nin en y�ksek konsantrasyonu 256 mg/L, CHX'in 64 mg/L, SHC'nin 32.768 mg/L ve TRC'nin 16 mg/L olarak saptandı.

Dezenfektanların MİK Değerlerinin Belirlenmesi

İn vitro duyarlılık testi "Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)" M27-A3 rehberinde �nerilen buyyon mikrodil�syon (BMD) y�ntemine g�re yapıldı9. Her dezenfektan i�in yukarıda belirtilen en y�ksek konsantrasyondan başlayarak 10 kez seri sulandırım yapıldı. Maya s�spansiyonu final konsantrasyonu 0.5 x 103 h�cre/ml i�erecek şekilde hazırlanarak farklı dezenfektan konsantrasyonları i�eren mikroplak kuyucuklarına aktarıldı. Mikroplaklar 37�C'de 24 saat ink�be edildi. G�zle �reme saptanmayan en d�ş�k dezenfektan konsantrasyonu MİK değeri olarak kabul edildi. MİK değeri belirlendikten sonra minimum fungisidal konsantrasyonu (MFK) değerleri saptandı. Bu değerler grafik �zerinde yerleştirilerek izolatların �oğunluğunun toplandığı epidemiyolojik sınır değeri (ECV) belirlendi. B�ylece her bir dezenfektan i�in CLSI BMD y�ntemiyle bir ECV değeri elde edildi. MİK değerinin elde edildiği izolat sayısı x eksenine, MİK değeri y eksenine yazıldı. En fazla izolatın toplandığı MİK değerinin (modal MİK) tepe noktası alınarak �izilen grafikte, ECV olarak kabul edildi. Dezenfektanlara duyarlılık-diren� i�in sınır değerler bulunmadığından, her bir dezenfektan i�in elde edilen ECV değerine g�re izolatlar dezenfektan duyarlı (MİK ≤ ECV) ve dezenfektan diren�li (MİK > ECV) olarak gruplandı10.

Membran Ge�irgenlik Deneyi

Fenotipik olarak gruplanan duyarlı ve diren�li izolatların membran ge�irgenliğinin araştırılması i�in kristal viyole deneyi yapıldı. Sabouraud dekstroz buyyon (SDB) besiyerinde �retilen C.albicans k�lt�r�nden 106 h�cre/ml i�erecek şekilde s�spansiyonlar hazırlandı. Her dezenfektan i�in toplam beş ayrı dil�syon (MİK, -2 MİK ve +2 MİK değerleri) test edildi. Dezenfektan ve mayanın serum fizyolojik i�indeki karışımı (2 ml) bir gece 37�C'de ink�be edildi. İnk�basyon sonrasında s�spansiyon i�eren t�pler santrif�j edildi. Oluşan ��kelti �zerine 100 �l (10 �g/ml) kristal viyole eklendi. Boyalı karışım 37�C'de 10 dakika ink�basyondan sonra tekrar santrif�j edildi. �st sıvı d�z tabanlı, 96 kuyucuklu mikroplaklara aktarılarak optik dansite (OD) değerleri 590 nm dalga boyunda okundu. Sadece kristal viyole i�eren kuyucuk %100 olarak kabul edilerek [Alım y�zdesi = (�rneğe ait OD değeri/kristal viyole OD değeri) x 100] form�l�ne g�re her bir �rnek i�in kristal viyole alım y�zdesi hesaplandı. Dezenfektan i�ermeyen maya s�spansiyonları negatif kontrol olarak, nistatin (4 mg/L) ve amfoterisin B (16 mg/L) eklenmiş maya s�spansiyonları da pozitif kontrol olarak kullanıldı11.

Atım Pompa Deneyi

Mantar h�cresinde kimyasalların ve ila�ların h�cre dışına atımından sorumlu iki tip atım pompası tanımlanmıştır. Bunlar C.albicans ila� diren� proteini (Cdr1p ve Cdr2p) ve C.albicans �oklu ila� diren� proteini (Mdr1p) pompalarıdır. Rodamin 6G (R6G) floresans boya olup sadece CDR1 ve CDR2 genlerinin artmış ekspresyonu g�sterilebilmektedir. Atım pompalarının dezenfektan metabolizmasında rol�n�n anlaşılması i�in R6G floresans boyası geri alım �alışması yapıldı. Bu y�ntem i�in, bir gecelik ink�basyon ile sıvı besiyerinde �retilmiş olan dezenfektan diren�li ve duyarlı C.albicans k�lt�r�nden alınan h�creler sayılarak (106 h�cre/ml) 10 ml SDB besiyerine aktarıldı. H�creler 5 saat ink�basyondan sonra santrif�j edildi. ��kelti fosfat tamponlu sol�syon (PBS) ile iki kere yıkandı. H�creler 10 ml PBS i�inde tekrar s�spanse edilerek 1 saat 37�C'de �alkalanarak ink�be edildi. H�crelerin �zerine 10 �l R6G sol�syonundan (0.5 M) eklendi. Karışım 37�C'de 30 dakika s�re ile ink�be edildi. Karışımdan 1 ml santrif�j t�p�ne aktarıldı. Kalan 9 ml h�cre s�spansiyonu iki ayrı 15 ml'lik santrif�j t�p�ne paylaştırıldı. Kontrol t�p� olacak bir tanesine 500 �l PBS, deney t�p� olacak diğerine 500 �l glukoz sol�syonu (10 mM) pompaları uyaran bir fakt�r olarak eklendi. Karışımlar 37�C'de 30 dakika s�re ile ink�be edildi. Her 15 ml'lik t�pten 1 ml alarak mikrosantrif�j t�p�ne aktarıldı. Mikrosantrif�j t�pleri 10.000 x g devirde 1 dakika s�re ile santrif�j edildi. �st sıvılar hemen temiz mikroplaklara aktarıldı. Kuyucuk i�indeki sıvılar OD 527 nm'de okundu. R6G'nin 0-5 molar arasındaki konsantrasyonlarının OD değerleri �l��lerek bir standart eğri oluşturuldu. Bilinmeyen R6G miktarı bu standart eğriye g�re hesaplandı. Glukoz eklenmeden �nceki R6G tutulumu ile eklendikten sonraki tutulum karşılaştırıldı12. Glukozun eklendiği koşulda elde edilen sonu�lar karşılaştırma amacıyla istatistiksel analiz i�in kullanıldı.

İn Vitro Vir�lans Deneyleri

Dezenfektan duyarlı ve diren�li olarak ayrılan izolatların in vitro hemolitik aktivite, salgısal asit proteinaz (SAP), fosfolipaz, esteraz, slime fakt�r oluşturma �zellikleri araştırıldı. �ok sayıda vir�lans fakt�r� incelendiği i�in, diren�li izolat sayısının az olmasına (3 izolat) rağmen sonu�lar sunuldu.

SAP deneyi i�in, sığır serum albumin agar (SSAA) kullanıldı. İzolatların 0.5 McFarland s�spansiyonlarından 10 �l alınarak SSAA besiyerine ekildi ve 37�C'de 10 g�n bekletildi. İnk�basyondan sonra, besiyerinin �zerini �rtecek şekilde %20 triklorasetik asit (TCA) eklendi ve 20 dakika bekletildikten sonra d�k�ld�. Plaklar PBS ile yıkanarak %0.06 amidosiyahı boyası ile 10 dakika boyandı. Plaklar boya ��z�c�s� (metanol, asetik asit, distile su, 45:10:45) ile yıkandı. Plaklar PBS ile tekrar yıkanarak, kurumaya bırakıldı. Koloni etrafında şeffaf zonu olmayanlar negatif, şeffaf zon olan koloniler ise pozitif olarak değerlendirildi13.

Fosfolipaz deneyi i�in, yumurta sarılı agar (YSA) besiyeri kullanıldı. İzolatların 0.5 McFarland s�spansiyonlarından 10 �l'si YSA plaklarına ekildi ve 37�C'de 4 g�n ink�be edildi. Kolonilerin etrafında oluşan presipitasyon zonu �l��ld�14.

Esteraz �retiminin g�zlenmesi i�in tween 80 agar kullanıldı. Taze k�lt�rlerden steril ek�vyon �ubuğu ile alınarak 1 cm �apında ekim yapıldı. Besiyerleri 37�C'de 10 g�n ink�be edildi, koloni etrafında opak kristallerin oluşumu pozitif esteraz aktivitesi olarak değerlendirildi15.

Hemolitik aktivitenin g�sterilmesi i�in, %5 koyun kanlı SDA besiyeri kullanıldı. İzolatların 0.5 McFarland s�spansiyonlarından 10 �l, 5 mm �apında ekim yapıldı. Plaklar 37�C'de, %5 CO2'li et�vde 48 saat ink�be edildi. Kolonilerin etrafında oluşan saydam halkalar hemoliz zonu olarak değerlendirildi16.

Slime fakt�r �retimini saptamak i�in t�p aderens y�ntemi kullanıldı. Taze� k�lt�rde �remesi olan mayadan bir �ze dolusu alınarak i�inde %8 glukoz bulunan SDB besiyerine aktarıldı. Et�vde 37�C'de 48 saat �alkalayarak ink�basyondan sonra t�p i�erikleri boşaltıldı ve distile su ile yıkandıktan sonra %1'lik safranin ile boyandı. T�plerde kırmızı pembe renkli film tabakası oluşması slime pozitif, herhangi bir film tabakası oluşmaması negatif olarak değerlendirildi17. Deneyde, t�p�n tamamında boya toplanması slime pozitifliği olarak kabul edildi. Literat�rde belirtildiği �zere, sıvı besiyerinin t�p i�inde bittiği seviyede halka şeklindeki boya toplanması slime fakt�r negatif olarak değerlendirildi.�

Galleria mellonella Larvalarının İnok�lasyonu

G.mellonella larvaları laboratuvarımızda yetiştirildi. Larvaların �retilmesi i�in sentetik besiyeri kullanıldı. Larvaların 3-4 haftalık, 0.33 g ağırlığında, kremsi renkte ve 2-3 cm uzunluğunda olanları �alışmaya dahil edildi. Her larvanın sol arka bacak i�ine Hamilton iğnesi kullanılarak 10 �l maya s�spansiyonu (106 h�cre/ml) enjekte edildi. Her grupta 10 larva olmak �zere; i) ellenmemiş sağlıklı kontrol grubu, ii) serum fizyolojik (SF) ile muamele edilmiş kontrol grubu, iii) diren�li C.albicans ile enfekte edilmiş grup, iv) duyarlı C.albicans ile enfekte edilmiş grup olmak �zere toplam d�rt gruba ayrıldı. Enfekte edilen larvalar 30�C'de ink�be edilerek her g�n �len larva (hareketsiz ve kahve renkli) sayısı belirlendi. B�t�n deney en az iki kez tekrar edilerek g�nlere g�re canlı larva sayıları ile Kaplan-Meier eğrileri elde edildi18,19.

BULGULAR

Toplam 417 C.albicans izolatının MİK ve MFK değerleri saptanmıştır. BZK i�in MİK değerleri izolatlardan birinde 0.25 mg/L, d�rd�nde 0.5 mg/L, 20'sinde 1 mg/L, 170'inde 2 mg/L, 205'inde 4 mg/L ve 17'sinde 8 mg/L olarak belirlenmiştir. BZK i�in ECV değeri 4 mg/L olarak bulunmuştur.

CHX i�in MİK değerleri 417 izolattan ���nde 0.25 mg/L, 13'�nde 0.5 mg/L, 79'unda 1 mg/L, 239'unda 2 mg/L, 72'sinde 4 mg/L ve 11'inde 8 mg/L olarak saptanmıştır. CHX i�in ECV değeri 2 mg/L olarak bulunmuştur.

TRC i�in MİK değerleri 417 izolattan birinde 0.06 mg/L, 21'inde 0.125 mg/L, 47'sinde 0.25 mg/L, 28'inde 0.5 mg/L, 163'�nde 1 mg/L, 99'unda 2 mg/L ve 33'�nde 4 mg/L olarak saptanmıştır. TRC i�in ECV değeri 1 mg/L olarak bulunmuştur.

SHC i�in MİK değerleri 417 izolattan ikisinde 256 mg/L, beşinde 512 mg/L, 96'sında 1024 mg/L, 127'sinde 2048 mg/L, 155'inde 4096 mg/L, 31'inde 8192 mg/L ve birinde 16.384 mg/L olarak tespit edilmiştir. SHC i�in ECV değeri 4096 mg/L olarak bulunmuştur. T�m dezenfektanlar i�in MİK/MFK ve ECV değerleri Şekil 1'de g�sterilmiştir.


Şekil 1

Deneyde se�ilen izolatların toplam beş farklı dezenfektan konsantrasyonu i�in kristal viyole alım (up take) y�zdeleri belirlenmiştir. Deneyin sonucunda dezenfektanlara duyarlı izolatta kristal viyole alım d�zeyleri %26.5-57.6 arasında bulunurken, diren�li izolatlarda %79.2'ye kadar y�kselmiştir. Dezenfektan miktarı MİK d�zeyinin �zerine �ıktık�a, kristal viyole alım y�zdeleri artmıştır (Şekil 2). Bu deney bize, dezenfektanların membrandan h�cre i�ine alındığını ve alımın dezenfektan miktarı ile ilişkili olduğunu g�stermiştir. Dezenfektan duyarlı ve diren�li izolatlar arasında, membranın ge�irgenliği a�ısından fark bulunmuştur. Diren�li izolatlarda membranın daha ge�irgen olduğu ve alım y�zdelerinin arttığı� tespit edilmiştir.


Şekil 2

Atım pompalarının sayıca artışını g�stermek i�in floresan boya olan R6G kullanılmıştır. Bu �alışma i�in dezenfektanlara duyarlı ve diren�li birer adet izolat se�ilerek R6G'nin geri alımı belirlenmiştir. Deneyin sonucunda, R6G'nin konsantrasyonu arttık�a OD değerininde y�kseldiği saptanmıştır. Dezenfektan diren�li izolatın R6G geri alım değerinin, duyarlı izolattan y�ksek olduğu g�zlenmiştir (Tablo I). Glukoz eklenen koşullarda dezenfektan diren�li izolatın R6G geri alım değeri, duyarlı izolattan y�ksek bulunmuştur (Şekil 3).


Tablo I

Şekil 3

Vir�lans deneyleri i�in t�m dezenfektanlara duyarlı bir ve diren�li �� izolat olmak �zere toplam d�rt izolat se�ilmiştir. Se�ilen izolatlarda; �� diren�li izolatın ikisinde SAP ve fosfolipaz enzimine rastlanırken, duyarlı izolatta SAP ve fosfolipaz enzimi saptanmamıştır. Dezenfektanlara diren�li izolatların sadece birinde esteraz enzimi �rettiği saptanmamıştır. İzolatların hi�birinde hemolitik aktivite g�zlenmemiştir. Dezenfektan diren�li �� izolatın ikisinde slime fakt�r �retimi g�sterilmiştir. Dezenfektan duyarlı izolat ve diren�li diğer izolatta ise slime fakt�r �retimi negatif bulunmuştur (Tablo II, Resim1). �alışmamızın sonucunda in vitro vir�lans fakt�rlerinden bazılarının diren� ile arttığı, bazılarının ise hi� değişmediği g�sterilmiştir.


Tablo II

Resim 1

Duyarlı ve diren�li izolatlar ile G.mellonella larvalarında oluşturulan enfeksiyon modeli sonucunda, �l�mler 48. saatten itibaren başlamış ve 240. saatte (10. g�n) en y�ksek d�zeye ulaşmıştır. �alışmada ilk �l�mler dezenfektana diren�li ve fosfolipaz pozitif grupta 48. saatte başlamıştır. Doksan altıncı saatte fosfolipaz pozitif ve slime pozitif gruplarda canlı larva sayısı altıya kadar d�şm�şt�r. Bu sonu�lara g�re larvalarda fosfolipaz, esteraz, SAP ve slime �retiminin mortaliteyi artırdığı s�ylenebilir. Elde edilen sonu�lara bakıldığında larvaların 240. saatteki mortalite oranı fosfolipaz ve esteraz negatif gruplarında y�ksek (%90) bulunmuştur (Şekil 4). Hemolitik aktivite hem dezenfektanlara duyarlı hem de diren�li izolatlarda saptanmadığından G.mellonella larva deneyine dahil edilmemiştir.

Larva �alışması ve in vitro vir�lans sonu�ları birleştirildiğinde, SAP, fosfolipaz ve slime �retimi pozitif diren�li izolat ile oluşturulan enfeksiyon modelinde 240. saatte elde edilen mortalite oranları %100 olarak saptanırken; SAP, fosfolipaz ve slime �retimi negatif diren�li ve duyarlı izolatlarda mortalite oranları %70-90 arasında bulunmuştur. Esteraz pozitif izolatın 240. saatte larvalardaki mortalite oranı %90, esteraz negatif duyarlı izolatın ise %10 olarak bulunmuştur.

Vir�lans sonu�ları topluca değerlendirildiğinde, vir�lansı y�ksek izolatlar ile mortalitesi y�ksek enfeksiyonlar oluşmuştur. Dezenfektan direncinin vir�lans fakt�rlerinden bağımsız olduğu tespit edilmiştir. Dezenfektan direnci ile vir�lans arasındaki ilişki mortalite oranlarına g�re değerlendirilmiştir. Dezenfektan diren�li izolatlar ile oluşan enfeksiyonların mortalitesinin, dezenfektan duyarlı izolatlarla oluşan enfeksiyonların mortalitesinden farklı olmadığı bulunmuştur.

TARTIŞMA

Dezenfektan maddeler mikroorganizmalar �zerine mikrobisidal veya mikrobiyostatik etki yaparak yaygın şekilde kullanılmaktadır. Hastane enfeksiyonlarının �nlenmesinde dezenfeksiyonun etkin şekilde uygulanması ayrı bir �neme sahiptir. Ancak patojen mikroorganizmalarda g�r�lebilen dezenfektan direnci, dezenfeksiyon uygulamalarında karşılaşılan sorunların en �nemli kısmını oluşturmaktadır. Bu y�zden dezenfektan maddelere olan direncin kaynağının belirlenmesi �nemlidir. Bu ama�la �alışmamızda dezenfektan olarak kullanılan SHC, BZK, TRC ve CHX maddeleri kullanılmıştır.

Dezenfektanların bakteri ve mantar h�creleri �zerine benzer etki g�sterdikleri d�ş�n�lmektedir. Bakteri konusunda �ok sayıda �alışma bulunmakla birlikte, mantarlarla yapılan �alışmaların sayısı kısıtlıdır. Bu nedenle, mantarlarda dezenfektana duyarlı-diren�li ayırımı yapılması zordur. ECV değeri, MİK dağılımından elde edilen bir değerdir. Test edilen izolat grubuna �zg�l olarak, bir duyarlılık yoklamasını g�stermektedir. Elde edilen ECV değeri diren� sınır değeri olarak kullanılabilir. �alışmamızda 417 C.albicans izolatının se�ilen dezenfektanlar i�in ECV değerleri BZK i�in 4 mg/L, CHX i�in 2 mg/L, TRC i�in 1 mg/L ve SHC i�in 4096 mg/L olarak belirlenmiştir. Morrissey ve arkadaşları20 2014 yılında yaptıkları �nc� �alışmada, 3319 izolat i�in dezenfektanların MİK, MFK/MBK değerlerini belirlemişlerdir. Bu �rnekler i�inde yer alan 200 C.albicans izolatı i�in BZK, CHX, TRC ve SHC ECV değerleri sırasıyla 16 mg/L, 16 mg/L, 16 mg/L ve 8292 mg/L olarak belirlenmiştir. Dezenfektanların Candida izolatları i�in ECV değerlerinin belirlenmesine y�nelik başka �alışma bulunmadığından, sonu�larımız bu �nc� �alışma ile karşılaştırılabilmiştir. �alışmamızda elde edilen ECV değerleri, Morrissey ve arkadaşlarının sonu�larından d�ş�k bulunmuştur. Morrissey ve arkadaşlarının �alışmasında 200 izolat, bizim �alışmamızda ise 417 izolat kullanılması nedeniyle, ECV değerlerimizin geniş bir izolat sayısı kullanılarak elde edildiği ve daha kesin sonu�lar ortaya �ıkardığı d�ş�n�lm�şt�r.

ECV değerlerinin belirlenmediği ancak C.albicans'ların dezenfektanlara duyarlılığının araştırıldığı başka �alışmalar bulunmaktadır. Gupta ve arkadaşlarının21 2015 yılında yaptıkları bir �alışmada dişlerin kanal tedavisinde kullanılan CHX ve kalsiyum hidroksitin C.albicans ve enterokoklar �zerine etkili olduğu saptanmıştır. Ancak bu �alışmada� etki sınır değeri belirlenmemiştir.

Literat�r araştırmasında, dezenfektanların mantarlara karşı etkinliği sınırlı sayıda �alışmada değerlendirilmiştir. Fungisidal veya fungistatik etki mekanizmaları ise tam olarak bilinmemektedir22. Kalkancı ve arkadaşlarının23 2015 yılında yayınlanan makalelerinde gıda ve �evre kaynaklı veya klinik izolat olarak izole edilmiş 77 adet k�f mantarının SHC, CHX, BZK ve TRC duyarlılıkları incelenmiştir. Klinik izolatlar ile gıda-�evre kaynaklı izolatların duyarlılıklarının farklı olduğu bulunmuştur. �alışmanın sonucunda, izolatların %75'i CHX'e (MİK ≤ 1 mg/L), %90'ı BZK'ye (MİK ≤ 2 mg/L) ve %89'u TRC'ye karşı duyarlı olarak belirlenmiştir. SHC i�in t�m izolatların geniş bir MİK dağılımı (MİK 2048-16.384 mg/L) g�sterdiği belirlenmiştir. Yaptığımız �alışmada ise aynı dezenfektanlar kullanılarak C.albicans izolatları �zerine etkinlikleri araştırılmıştır.

Literat�rde, dezenfektan duyarlı ve diren�li izolatlarda atım pompaları ayrıntılı olarak incelenmemiştir. �alışmamızda atım pompalarının incelenmesinde floresan boya olan R6G kullanılmıştır. Diren�li ve duyarlı izolatların R6G geri alımı incelenmiştir. Dezenfektan diren�li izolatta R6G geri alım değeri y�ksek bulunmuştur. Elde edilen sonu�lardan yola �ıkarak, dezenfektan direnci ile CDR tipindeki atım pompaları arasında ilişki olduğu d�ş�n�lm�şt�r. Yan Liu ve arkadaşları24 tarafından 2015 yılında yapılan bir �alışmada, 30 klinik C.albicans izolatında azollere diren� mekanizmaları R6G kullanılarak atım pompaları g�sterilmiştir. �alışmada azol diren�li 12 izolatta R6G'nin geri alımı diren�li izolatlarda, duyarlı izolatlardan y�ksek bulunmuştur. R6G geri alımının glukoz varlığında da arttığı g�zlemlenmiştir. Bizim �alışmamızda da dezenfektan direnci ile atım pompalarının artışı� arasında ilişki olduğunu d�ş�nd�recek benzer sonu�lar elde edilmiştir. Dezenfektan direncinin C.albicans atım pompaları ile ilişkili olduğunu g�steren �alışmamız literat�rde �zg�n bir değere sahip olacaktır.

�alışmamızda, dezenfektanlara diren�li olduğu� tespit edilen izolatların vir�lans fakt�rleri incelenmiştir. SAP aktivitesi diren�li izolatlarda belirgin olarak bulunurken, esteraz ve hemoliz �zellikleri bakımından fark g�sterilememiştir. Slime �retimi ve fosfolipaz �retimi ise kısmen farklı bulunmuştur. Dezenfektan diren�li C.albicans izolatlarında in vitro vir�lansın kısmen değiştiği g�r�lm�şt�r. Ancak kullanılan dezenfektan diren�li izolat sayısının az olmasıyla diren� ve vir�lans fakt�rleri arasındaki ilişki kesin kanıtlar eşliğinde değerlendirilememiştir. Elde ettiğimiz sonu�lar, in vitro vir�lans fakt�rlerinin, dezenfektanlara duyarlı ve diren�li izolatlarda pozitif veya negatif olabildiğini g�steren �nc� sonu�lardır.

�alışmada memeli hayvanlar yerine, etik kurallar ve maliyet g�zetilerek mini modellerden G.mellonella larvaları tercih edilmiştir. G.mellonella larvaları son yıllarda yaygın olarak kullanılmaktadır25. Elde edilen sonu�lar değerlendirildiğinde dezenfektan diren�li izolatlar i�erisinde vir�lans fakt�rleri pozitif olanlar ile G.mellonella larvalarında oluşturulan enfeksiyonların mortalite d�zeyinin, dezenfektan duyarlı ve vir�lans fakt�rleri negatif izolatlardan y�ksek olduğu sonucuna varılmıştır. Literat�r incelendiğinde bakterilerde dezenfektan direnci ve vir�lans ilişkisini araştıran �ok sayıda �alışma� olduğu g�zlenmiştir, ancak elde edilen sonu�lar farklılık g�stermektedir. Bazı �alışmalarda vir�lans a�ısından duyarlı ve diren�li mutant izolatların arasında fark olmadığı belirtilirken, bazı �alışmalarda ise dezenfektan direncinin vir�lansı azalttığı bildirilmiştir26-28.

�alışmamızda diren� ile vir�lans kavramlarının birbirlerinden farklı olduğu g�zlenmiştir. Dezenfektan diren�li C.albicans izolatlarının vir�lansı ile duyarlı izolatların vir�lansı arasında fark olmadığı �alışmamızda ilk kez g�sterilmiştir.

�alışmamızın sonucunda 417 izolat i�inde diren�li izolatlar olduğu belirlenmiştir. Bu sonuca g�re dezenfektan diren�li C.albicans izolatlarına karşı� gerekli �nlemlerin alınmasının �nemi ortaya �ıkarılmıştır. Dezenfektanların giriş ve �ıkışının h�cre membranındaki atım pompaları ile ilişkili olduğu g�sterilmiştir. Buna g�re, antifungal ila�lara direnci olan izolatlarda dezenfektan direncinin de olabileceğinin akılda tutulması gerektiği kanıtlanmıştır. İn vitro vir�lans fakt�rlerinden bazılarının diren� ile arttığı, bazılarının ise hi� değişmediği g�sterilmiştir. İn vivo vir�lans �alışmasında ise vir�lansı y�ksek olan izolatlar; dezenfektan direncinden bağımsız olarak G.mellonella larva modelinde mortalitesi y�ksek enfeksiyonlar oluşturmuştur. Mortaliteyi belirleyen temel fakt�r�n vir�lans olduğu fakat �alışmamızda diren� varlığının vir�lansı etkilemediği g�sterilmiştir. Bu sonuca g�re, diren� ve vir�lansın birbirinden farklı kavramlar olduğunun akılda tutulması doğru bir yaklaşım olacaktır.

KAYNAKLAR

  1. SCENIHR. 2009. Effects of biocides on antibiotic resistance. http://ec.europa.eu/health/ph_risk/committees/04_scenihr/docs/scenihr_o_021.pdf.
  2. Russell AD, Furr JR. Biocides: mechanisms of antifungal action and fungal resistance. Sci Prog 1996; 79(1): 27-48.
  3. �erik�ioğlu N. Mantarlarda virulans fakt�rleri. ANKEM Derg 2012; 26(2): 261-269.
  4. Kavanagh K, Fakkon PJ. Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence. Fungal Biol Rev 2010; 24(1-2): 79-83.
  5. Marple B, Roland P, Benninger M. Safety review of benzalkonium chloride used as a preservative in intranasal solutions: an overview of conflicting data and opinions. Otolaryngol Head Neck Surg 2004; 130(1): 131-41.
  6. Din� G. Kavite dezenfektanlarının antibakteriyel �zellikleri, bağlanma dayanımı ve mikrosızıntı �zerine etkileri. Atat�rk �niv. Diş Hek. Fak. Derg 2012; 6: 66-75.
  7. Dvorak G. Disinfection 101. Center for Food Security and Public Health 2008; 1-20.
  8. Cao C, Sha Y, Meng H, et al. A four-day study to evaluate the anti-plaque efficacy of an experimental triclosan-containing dentifrice. J Clin Dent 2001; 12(4): 87-91.
  9. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts: approved standard-third edition. CLSI document (M27-A3), 2008. CLSI, Wayne, PA.
  10. Lockhart SR, Ghannoum MA, Alexander BD. Establishment and use of epidemiological cut-off values for molds and yeasts by use of the Clinical and Laboratory Standards Institute M57 Standard. J Clin Microbiol 2017; 55(5): 1262-68.
  11. Li N, Luo M, Fu YJ, et al. Effect of corilagin on membrane permeability of Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Candida albicans. Phytother Res 2013; 27(10): 1517-23.
  12. Morgan G, Pinjon E, Coleman DC, et al. Analysis of drug resistance in pathogenic fungi, pp:93-113. In: Kavanagh, K. (ed.), Medical mycology: cellular and molecular techniques. First edition. Wiley 2007.
  13. Ozkan S, Kaynak F, Kalkanci A, et al. Slime production and proteinase activity of Candida species isolated from blood samples and the comparison of these activities with minimum inhibitory concentration values of antifungal agents. Mem Ins Oswaldo Cruz 2005; 100(3):319-24.
  14. Yıldırım M, Mumcuoğlu İ, Kurşun Ş, et al. İnfeksiyon etkeni olarak izole edilen Candida albicans ve non-albicans Candida suşlarındaki bazı virulans fakt�rlerinin karşılaştırılması. T�rk Mikrobiyo Cem Derg 2009; 39(34): 62-8.
  15. Fatahinia M, Poormohamadi F, Mahmoudabadi AZ. Comparative study of esterase and hemolytic activities in clinically important Candida Species, isolated from oral cavity of diabetic and non-diabetic individuals. Jundishapur J Microbiol 2015; 8(3): e20893.
  16. Demir F, Kuştimur S. Trichosporon spp. suşlarında bazı vir�lans fakt�rlerin araştırılması. Mikrobiyol Bul 2014; 48(4): 628-38.
  17. Satılmış �K, Akkaya Y, Ergin �, et al. �eşitli klinik �rneklerden izole edilen Candida spp. k�kenlerinde slime fakt�r �retimi. Pam Tıp Derg 2011; 4(1): 25-29.
  18. Fuchs BB, Eby J, Nobile CJ, et al. Role of filamentation in Galleria mellonella killing by Candida albicans. Microbes Infect 2010; 12(6): 488-96.
  19. Kalkancı A, Fouad AA, Erdoğan M, et al. Bazı bakteri ve mantarların vir�lansının araştırılmasında Galleria mellonella'nın in vivo model olarak kullanılması. Mikrobiyol Bul 2015; 49(3): 366-76.
  20. Morrissey I, Oggioni MR, Knight D, et al. Evaluation of epidemiological cut-off values indicates that biocide resistant subpopulations are uncommon in natural isolates of clinically-relevant microorganisms. PLoS One 2014; 9 (1): e86669.
  21. Gupta PS, Bhati M, Jhajharia K, et al. Evaluation of antimicrobial and antifungal efficacy of inter appointment intracanal medicaments against Enterococcus and Candida albicans: an in vitro study. J Int Oral Health 2015; 7(6): 97-102.
  22. McDonnell G, Russell, AD. Antiseptics and disinfectants: activity, action and resistance. Clin Microbiol Rev 1999; 12(1): 147-79.
  23. Kalkancı A, Elli M, Fouad AA, et al. Assessment of susceptibility of mould isolates towards biocides. J Mycol Med 2015; 25(4): 1-7.
  24. Liu JY, Shi C, Wang Y, et al. Mechanisms of azole resistance in Candida albicans clinical isolates from Shanghai, China. Res Microbiol 2015; 166 (3): 153-61.
  25. Maurer E, Browne N, Surlis C, et al. Galleria mellonella as a host model to study Aspergillus terreus virulence and amphotericin B resistance. Virulence 2015; 6(6): 591-8.
  26. Oggioni MR, Ciusa ML, Furi L, et al. Lack of evidence for reduced fitness of clinical Staphylococcus aureus isolates with reduced susceptibility to triclosan. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56(11): 6068-9.
  27. Wand ME, Bock LJ, Bonney LC, et al. Retention of virulence following adaptation to colistin in Acinetobacter baumannii reflects the mechanism of resistance. J Antimicrob Chemother 2015; 70(8): 2209-16.
  28. Latimer J, Forbes S, McBain AJ. Attenuated virulence and biofilm formation in Staphylococcus aureus following sublethal xposure to triclosan. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56(6): 3092-100.

İletişim (Correspondence):

Dr. �ğr. �yesi Ali �zt�rk,

Niğde �mer Halisdemir �niversitesi Tıp Fak�ltesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

51240, Niğde, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 534 323 86 43,

E-posta (E-mail): ozturkali@ohu.edu.tr

Yazdır