Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2018; 52(4): 390-400

Encephalitozoon intestinalis'in D�rt Farklı H�cre Hattında
�reme Potansiyelinin Değerlendirilmesi

Evaluation of the Reproductive Potential of Encephalitozoon
intestinalis in Four Different Cell Line

�lfet �ETİNKAYA1, Arzuv CHARYYEVA2,3, Esra G�RB�Z3

1 Erciyes �niversitesi Halil Bayraktar Sağlık Hizmetleri Meslek Y�ksek Okulu, Kayseri.

1 Erciyes University Halil Bayraktar Vocational School of Health Services, Kayseri, Turkey.

2 Ostrava �niversitesi Bilim Fak�ltesi, Yaşam Bilimleri Araştırma Merkezi, Ostrava.

2 Ostrava University Faculty of Science, Life Science Research Center, Ostrava, Czech Republic.

3 Erciyes �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Parazitoloji Anabilim Dalı, Kayseri.

3 Erciyes University Faculty of Medicine, Department of Parasitology, Kayseri, Turkey.

* Bu �alışma, Erciyes �niversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi tarafından (Proje no: TCD-2016-7042) desteklenmiştir.

�Z

Microsporidia, omurgalı ve omurgasız bir�ok canlıda enfeksiyon oluşturan, k���k ve dış ortam koşullarına diren�li sporlara sahip parazitlerdir. Zorunlu h�cre i�i parazitleri oldukları i�in aksenik k�lt�rleri yapılamamaktadır. Bu �alışmada, insan kolon epidermal adenokarsinoma h�cresi (Caco-2), insan monositik h�creleri (U937), Afrika yeşil maymunu b�brek epitel h�cre hattı (VERO) ve insan b�brek epitel h�creleri (HEK-293) olmak �zere parazitin yerleştiği doku ve organlara ait h�cre hatlarında parazit k�lt�r�n�n yapılması ve altı hafta boyunca spor miktarı takip edilerek bu h�cre hatlarında parazitin �reme potansiyelinin araştırılması ama�lanmıştır. U937 h�crelerinin �retilmesi i�in RPMI-1640 besiyeri, diğer h�cre hatları i�inse DMEM kullanılmıştır. U937 h�creleri, Phorbol-12-Myristate-13-Asetate ile stim�lasyon sağlandıktan sonra enfekte edilmiştir. Parazit invazyonunun ger�ekleşebilmesi i�in 37�C'de %5 CO2'li ortamda bir gece ink�be edildikten sonra besiyeri i�erisindeki serbest halde bulunan sporlar uzaklaştırılmıştır. Altı hafta boyunca t�m k�lt�rler takip edilerek sporların konak h�crelerinden ilk �ıkış s�resi, enfeksiyon sonrası konak h�crelerinin durumu g�zlenmiştir. Enfekte h�crelerden a�ığa �ıkan spor yoğunluğu; kantitatif ger�ek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRt-PCR) ile parazit y�k� hesaplanarak ve Thoma lamı ile sayılarak farklı h�crelerde parazitin �reme potansiyelleri değerlendirilmiştir. �alışma sonunda d�rt h�cre hattının da enfekte edilebildiği ve en az altı hafta boyunca enfeksiyonun devam ettiği g�zlenmiştir. Enfeksiyon sonrası birka� g�nl�k s�re�te y�zeye tutunmuş haldeki makrofaj ve CaCo-2 h�crelerinin y�zeyden ayrılmaya başladığı ve b�ylece h�cre sayısının da azaldığı g�zlenmiştir. Daha sonraki g�nlerde HEK-293 h�crelerinin de y�zeyden ayrılarak kirli besiyerinin oluşmasına ve dolayısıyla da saf spor elde edilmesinin olumsuz y�nde etkilenmesine sebep olduğu saptanmıştır. VERO h�crelerinde ikinci haftanın sonunda sporların �ıkmaya başladığı g�r�lm�ş olup, diğer h�crelerde spor �ıkmaya başlaması daha uzun s�rm�şt�r. Altı hafta boyunca VERO h�crelerinde parazitin �reme potansiyelinin daha y�ksek olduğu g�r�lm�şt�r. Bu �alışmada insan orijinli �� h�cre hattı ile maymun orijinli VERO h�cre hattında E.intestinalis �reme potansiyeli karşılaştırılmıştır. Bu �alışma, yaygın enfeksiyonlara sebep olan E.intestinalis'in yerleştiği doku ve organlara ait h�creleri enfekte edebildiğini ve enfeksiyonun altı hafta boyunca devam ettiğini g�stermiştir. Bu �alışmada elde edilen sonu�ların; parazitle ilişkili genetik, farmakolojik, biyokimyasal, imm�nolojik alanda yapılacak olan �alışmalara katkı sağlayacağı d�ş�n�lmektedir.

Anahtar s�zc�kler: Microsporidia; Encephalitozoon intestinalis; h�cre k�lt�r�.

ABSTRACT

Microsporidia are parasites that can cause infections in many vertebrate and invertebrate organisms and produce small spores resistant to environmental conditions. As they are obligate intracellular parasites, axenic cultures cannot be performed. The aim of this study was to investigate the reproductive potential of the parasite in human colon epidermal adenocarcinoma (Caco-2), human monocytic (U937), African green monkey renal epithelial (VERO) and human kidney epithelial (HEK-293) cell lines of tissue and organs where the parasite is located by following the culture of the parasites and the amount of spores for six weeks. RPMI-1640 medium was used for the cultivation of U937 cells, while DMEM was used for other cell lines and the immature U937 cells were stimulated with Phorbol-12-Myristate-13-Acetate before infection. All of the host cell groups were infected with freshly collected Encephalitozoon intestinalis spores in ratio 1:30 and free spores in the culture media were removed after overnight incubation at 37�C under 5% CO2 condition for parasite invasion. The first release of the spores from the infected cells was observed and recorded by following for six weeks. Furthermore, the spore density released from each cell groups was evaluated by measuring the parasite load by Thoma cell counting chamber and quantified by real-time PCR. As a result of the study, it was observed that four cell lines could be infected by E.intestinalis and the spore production can be maintained for six weeks. It was observed that the monolayer macrophages and CaCo-2 cells, started to be detached from the culture flasks in few days following the parasite invasion, thus decreasing the number of host cells. After 1-2 weeks, HEK-293 cells were also detached from the surface, thus negatively affected the pure spore production by contaminating the media with dead host cell suspension. Spores started to appear in VERO cell media at the end of the second week after initial infection, while it took longer time for other cells to start releasing spores. Over the course of six weeks, the VERO cell line had the highest spore-producing potential among the other cell lines. In conclusion, this study compared the potential for reproduction of E.intestinalis in three human cell lines and monkey originated VERO cell line. This study demonstrated that cells derived from the tissues or organs where Microsporidia species causes disseminated infections could be infected by the parasitic spores in vitro. Additionally, the parasite can survive and propagate longer than six weeks. The authors believe that the results of this study will contribute to the further studies related to the parasite in the area of genetics, pharmacology, biochemistry, immunology and eradication studies.

Keywords: Microsporidia; Encephalitozoon intestinalis; cell culture.

Geliş Tarihi (Received): 12.06.2018 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 06.09.2018

GİRİŞ

Microsporidia omurgalı ve omurgasız bir�ok canlıda enfeksiyon oluşturan, k���k ve dış ortam koşullarına diren�li sporlara sahip parazitlerdir. Bug�ne kadar tanımlanmış 144 cinsi ve bu cinslere bağlı 1200'den fazla t�r� bulunmaktadır. Yedi cinse bağlı 14 Microsporidia t�r� ise insanlarda patojen olarak tanımlanmıştır. Bu t�rler i�erisinde Enterocytozoon bieneusi ve Encephalitozoon intestinalis en sık g�r�len t�rler olup gastrointestinal sistem enfeksiyonlarına yol a�maktadırlar1-3. �lkemizde Microsporidia ile ilgili bir�ok epidemiyolojik �alışma yapılmış ve bu parazitin olduk�a yaygın olduğu bildirilmiştir4-7. Zorunlu h�cre i�i parazitleri oldukları i�in aksenik k�lt�rleri yapılamamaktadır1-3.

İn vitro k�lt�r sistemleri, farmakoloji, biyokimya, imm�noloji ve genetik gibi bir�ok alanda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bunun dışında, parazit-konak ilişkisinin anlaşılması, antimikrobiyal ila�ların etkilerinin değerlendirilmesi, gen susturma ve gen tedavisi �alışmaları, parazitlerle ilişkili serolojik testlerin geliştirilmesi gibi bir�ok �alışmada da �nemli bir temel oluşturmaktadır. Bu nedenle, yapılacak �alışmanın amacına y�nelik olarak, yeterli miktarda saf spor elde etmek amacıyla parazitin k�lt�r�n� yapmak ve belirli bir s�re k�lt�r� devam ettirebilmek olduk�a �nemlidir.

E.intestinalis'in h�cre k�lt�r�; dışkı, idrar, bronkoalveoler lavaj (BAL), balgam, burun mukozası, duodenal aspirat ve biyopsi �rnekleri gibi farklı biyolojik �rneklerde yapılabilmektedir. E.intestinalis in vitro h�cre k�lt�r� i�in tavşan b�brek (RK13), k�pek b�brek (MDCK), maymun b�brek (VERO), insan fetal akciğer fibroblastları (MRC-5) gibi farklı h�cre hatları kullanılmış ve bu g�ne kadar yapılan bir�ok �alışmada VERO h�cre hattı parazitin �retilmesi i�in en uygun h�cre hatlarından biri olarak bildirilmiştir8.

E.intestinalis, �ncelikle ince bağırsak enterositlerini enfekte etmekte ve kişinin imm�n sisteminin paraziti yok etmek i�in yetersiz kaldığı durumlarda lamina propria makrofajları, fibroblastlar ve endotelyal h�crelere yerleşerek yaygın enfeksiyonlara sebep olmaktadır1,9,10. Bu �alışmada, parazitin yerleştiği doku ve organlara ait h�cre hatlarında parazit k�lt�r�n�n ger�ekleştirilmesi ve altı hafta boyunca spor miktarı takip edilerek bu h�cre hatlarında parazitin �reme potansiyelinin araştırılması ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

Konak H�cre Hatlarının Hazırlanması

Bu �alışmada, insan kolon epidermal adenokarsinoma h�cresi (Caco-2), insan monositik h�creleri (U937) ve insan b�brek epitel h�creleri (HEK-293) olmak �zere parazitin yerleştiği doku ve organlara ait olan insan orijinli �� h�cre hattı ile birlikte VERO h�cre hattında parazit k�lt�re edilmeye �alışıldı ve altı hafta boyunca spor miktarı takip edildi. �alışmada, Caco-2 ATCC� HTB-37�, HEK-293 ATCC� CRL-1573�, VERO ATCC� CCL-81� ve U937 ATCC� CRL1593� h�cre hatları kullanıldı.

Caco-2, HEK-293 ve VERO h�cre hattının devamlılığı i�in aşağıda belirtildiği şekilde aynı besiyeri kullanıldı ve benzer şartlar sağlandı. H�crelerin ��zd�r�lmesi ve sonraki işlemler i�in "Dulbecco's modified eagle medium" (DMEM)- FG 0445 (Biochrom, Almanya) kullanıldı. Bu besiyeri ayrıca 2 mM L-Glutamin- 59202 (Sigma, Almanya), %10 inaktive edilmiş fetal bovine serum (FBS,10270-106) (Thermo-Fisher Scientific, ABD), 100 IU/ml penisilin + 100 �g/ml streptomisin-15140122 (Thermo-Fisher Scientific, ABD) ilave edilerek zenginleştirildi. Sıvı azotta muhafaza edilen h�creler 37�C'de sıcak su banyosunda ��zd�r�ld� ve 9 ml besiyeri i�erisinde 1000 devirde 10 dakika santrif�j edilerek yıkandı. S�pernatan uzaklaştırılarak pelet �zerine taze besiyeri ilave edilip Thoma lamında h�creler sayıldı. H�creler s�spansiyon haline getirilerek 6 kuyucuklu mikroplaklara 2 ml besiyeri i�erisinde 5 x 106 h�cre olacak şekilde dağıtıldı ve 37�C'de %5 CO2'li ortamda bir gece ink�be edildi. İnk�basyon sonrasında tutunmayan h�creler ortamdan besiyeri ile birlikte uzaklaştırıldı11-13.

Promonositik insan miyeloid l�semi U937 h�cre hattının k�lt�r� 2 mML-glutamin,� %10 inaktive edilmiş FBS, 100 IU/ml penisilin + 100 �g/ml streptomisin ve 10 mM HEPES-H0887 (Sigma, Almanya) i�erecek şekilde zenginleştirilmiş, RPMI-1640 R8758 (Sigma, Almanya) besiyeri kullanıldı14. �retilen bu �nc�l monositik h�crelerin stim�lasyonu i�in 10 ng/ml konsantrasyonda Phorbol-12-Myristate-13-Asetate (PMA) P8139 (Sigma, Almanya) i�eren zenginleştirilmiş RPMI-1640 besiyeri kullanılmış olup, h�crelerin olgunlaşması i�in 72 saat boyunca 37�C'de %5 CO2'li ve nemli ortamda ink�basyon sağlandı9,10.

E.intestinalis Sporlarının Hazırlanması

�alışmada ATCC 50506 E.intestinalis suşu kullanıldı. �alışmada kullanılmak �zere yeterli sayıda sporun elde edilmesi i�in parazitin k�lt�r� VERO h�cre hatlarında DMEM FG 0445 (Biochrom, Almanya) besiyeri kullanılarak ger�ekleştirildi (Resim 1).


Resim 1

Bu besiyeri, ayrıca 2 mM L-glutamin, %2 inaktive edilmiş FBS, 100 IU/ml penisilin + 100 �g/ml streptomisin ilave edilerek zenginleştirildi. Haftada iki kez besiyeri i�erisindeki sporlar besiyeri ile birlikte toplandı11-13. Besiyeri i�erisindeki �lm�ş h�creler 5 �m porluk filtreden ge�irilip 4000 devirde 10 dakika santrif�j edilerek sporlar toplandı.

Konak H�crelerinin E.intestinalis ile Enfeksiyonu

�alışmanın bu aşamasında VERO h�cre hattında k�lt�r� devam ettirilen ve hi� dondurulmamış olan sporlar ile konak h�creleri enfekte edildi. Enfeksiyon sırasında ve enfeksiyon sonrasında kullanılan besiyerlerinde konak h�crelerinin �oğaltılmasında kullanılandan farklı olarak %2 inaktive edilmiş FBS konuldu. Bir g�n �nceden flakslarda �retilmiş konak h�crelerinin bulunduğu besiyeri uzaklaştırılarak �zerlerine spor i�eren 500 �l besiyeri eklendi. Spor miktarları Thoma lamı ile sayıldı ve h�cre/spor oranı 1:30 olacak şekilde hesaplanarak, parazitin konak h�cre invazyonunun ger�ekleşmesi i�in, 37�C'de %5 CO2'li ortamda bir gece ink�be edildi. Sonrasında besiyeri i�erisinde tutunmayan sporlar uzaklaştırılarak k�lt�re %2 FBS i�eren besiyerinden 2 ml eklendi ve haftada iki kez besiyeri yenilendi. Altı hafta boyunca devam ettirilen k�lt�rde haftalık olarak sporlar toplandı. K�lt�rlerdeki spor yoğunluğu qRt-PCR ve Thoma lamı ile hesaplandı.

Enfeksiyonun Değerlendirilmesi

Konak h�crelerinden toplanan besiyeri ortamı haftalarına g�re ayrıldı ve toplanan besiyerinden homojen halde bir miktar alınarak Thoma lamında spor sayımı ger�ekleştirildi. Sayım sonunda 100 �l i�erisindeki spor miktarı hesaplandı.

Konak h�crelerinden toplanan besiyeri ortamı haftalarına g�re ayrıldı ve toplanan besiyerinden 100 �l alınarak DNA izolasyonu yapıldı. DNA izolasyonu, GeneAll Exgene Cell SV Mini Kit (GeneAll, Kore) ile doku prosed�r� kullanılarak �retici firma �nerisine g�re yapıldı. E.intestinalis'in 16S rRNA gen b�lgesini hedef alan E.intestinalis F (5'-CCT GAC TGG ACG GAC AGA AG-3') ve E.intestinalis R (5'-TTC GTC CTT CAT CGT CAC AT-3') primerleri kullanılarak benzer prosed�rle PCR işlemi ger�ekleştirildi15. qRt-PCR ile spor yoğunluğunun hesaplanması i�in; E.intestinalis 16S SSU rRNA gen b�lgesini i�eren plazmid DNA'sından hazırlanmış olan farklı konsantrasyonlardaki seri dil�syonlar kullanıldı. Seri dil�syonlarda, ana sulandırımın kopya sayısı 2.8 x 109 olarak hesaplandı. Daha sonra ana stoktan onar kat sulandırım yapılarak dokuz farklı dil�syon hazırlandı.

qRt-PCR analizi sonunda �rneklerdeki parazit y�k� standart eğriye g�re hesaplandı ve değerlendirildi. Deneyler �� kez tekrarlandı ve verilerin ortalamaları alındı.

BULGULAR

�nc�l monosit h�creleri PMA ile stim�le edildiklerinde makrofaj h�crelerine farklılaştıkları ve mikroskobik olarak incelendiğinde �nemli farklılıkların olduğu g�r�lm�şt�r. S�spanse halde �reyen bu h�creler uyarıldıktan sonra tek tabakalı h�crelere d�n�şm�ş, boyutları b�y�m�ş ve fagositik h�cre �zelliği kazandıklarından dolayı yalancı ayaklar �ıkartarak yıldızımsı g�r�n�me sahip oldukları g�r�lm�şt�r (Resim 2).


Resim 2

E.intestinalis sporları ile enfekte edilmiş t�m h�cre gruplarının her 2-3 g�nde besiyeri ortamı değiştirilerek invert mikroskobunda incelenmiştir. Mikroskobik incelemede ikinci haftanın sonunda tutunmuş halde olan Caco-2 ve U937 h�crelerinin y�zeyden kopmaları nedeniyle besiyeri ortamının olduk�a hızlı kirlendiği g�r�lm�şt�r.

Spor miktarlarının değerlendirilmesinde iki farklı y�ntem kullanılmıştır. Her iki y�ntemle elde edilen sonu�ların birbirini destekler şekilde olduğu g�r�lm�şt�r. Kantitatif olarak sonu�ları değerlendirebildiğimiz qRt-PCR sonu�ları Tablo I'de verilmiştir. Plazmit DNA'sından hazırlanan seri dil�syonlardan elde edilen DNA d�zeyleri (kopya/ml) standart eğrinin oluşturulmasında kullanılmıştır (Resim 3).�


Tablo I

Resim 3

D�zenli olarak takip edilen d�rt h�cre hattı arasında VERO h�crelerinde 10. g�nde sporların �ıkmaya başladığı saptanmış, diğer h�crelerde spor yapısının g�r�lmeye başlamasının daha uzun s�rd�ğ� tespit edilmiştir. Her hafta sonunda h�cre gruplarından toplanan besiyerlerinden, serbest haldeki h�creleri uzaklaştırmak i�in boyutu 5 �m porlu filtrelerden s�z�lm�ş ve parazit yoğunluğu değerlendirilmiştir. D�rt h�cre hattının da başarılı şekilde enfekte edildiği ve enfeksiyonun en az altı hafta boyunca devam ettirilebildiği g�r�lm�şt�r.

Altı hafta boyunca VERO h�crelerinde parazitin �reme potansiyelinin daha y�ksek olduğu tespit edilmiştir. Caco-2 ve U937 h�crelerinde ise spor miktarının ilerleyen haftalarda d�ş�ş g�sterdiği belirlenmiştir. Altı hafta boyunca U937 h�crelerinde parazitin �reme potansiyelinin en d�ş�k olduğu tespit edilmiştir. Bu altı hafta s�re boyunca enfeksiyonun� devam ettiği g�r�lm�şt�r.

TARTIŞMA

E.intestinalis konak h�cre dışında aktif formu bulunmayan, tek h�creli, spor oluşturan zorunlu h�cre i�i parazitidir. Bu nedenle de aksenik k�lt�r� yapılamamaktadır. Konak h�cresi i�inde ve konak h�cresi tarafından oluşturulan bir parazitoforoz vakuol i�erisinde gelişmekte ve �oğalmaktadır. �evresel şartlara diren�li olan spor, �karyotik h�creye polar t�p� ile tutunmakta ve enfektif sporoblast polar t�p aracılığıyla konak h�cresine enjekte edilmektedir16,17. Parazit, konak h�cresine yerleşebilmek i�in, vakuol membran par�alanana kadar, konak�ı h�crenin normal h�cre metabolizmasını ve h�cresel s�re�lerini devre dışı bırakmaktadır18. Parazitoforoz vakuol�n �ok sayıda olgun spor ile dolması sonucunda ise enfekte h�cre ve vakuol par�alanarak sporlar k�lt�r ortamında serbest kalmaktadır11,19.

İnsanda enfeksiyona sebep olan Microsporida t�rlerinin bir�oğunun farklı h�cre hatlarında k�lt�r�n�n yapılabildiği bildirilmektedir11. E.intestinalis imm�n sistemi sağlam kişilerde �ncelikle intestinal sisteme yerleşmekte ve ishale sebep olmaktadır. İmm�n sistemin baskılanması sonucunda ise makrofajlara yerleşmekte ve makrofajları bir ara� gibi kullanarak v�cuda dağılmaktadır. Bu �alışmada� yaygın enfeksiyonlara sebep olan E.intestinalis'in insan orijinli ve parazitin yerleştiği organlara ait olan h�cre hatlarında �reme potansiyeli araştırılmıştır.

Joseph ve Sharma8 yaptıkları bir �alışmada SIRC (tavşan kornea), VERO ve HeLa h�crelerinde parazitin �reme potansiyelini araştırmışlar ve E.intestinalis'in VERO h�cre hattında daha y�ksek �reme potansiyeline sahip olduğunu bulmuşlardır. Ludovisi ve arkadaşları20 RK13 (tavşan b�brek), MDCK (Kanin b�brek) ve VERO h�cre hatları ile yaptıkları �alışmalarında E.intestinalis'in VERO h�cre hattında daha y�ksek �reme potansiyeline sahip olduğunu saptamışlardır. �alışmamızda karşılaştırılması yapılan d�rt h�cre hattından VERO h�crelerinde parazit �reme potansiyelinin en y�ksek olduğu ve altı hafta boyunca yoğun bir şekilde spor �retiminin olduğu g�r�lm�şt�r (Tablo I).

E.intestinalis �ncelikle ince bağırsak enterositlerini enfekte etmektedir. Bu nedenle �alışmamızda CaCo-2 h�creleri se�ilmiştir. VERO ve HEK293 h�creleri ile kıyaslandığında parazitin �reme potansiyelinin d�ş�k olduğu ve aynı zamanda enfeksiyon sonrası h�crelerin y�zeyden kalktığı g�zlenmiştir. Altı hafta boyunca enfeksiyon devam ettirilebilmiş olmasına rağmen spor miktarında azalma olduğu g�r�lm�şt�r.

Biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılan h�cre hatlarından biri olan U937 h�creleri 37 yaşındaki bir erkeğin histiyositik lenfoma dokusundan izole edilmiştir. H�creler gerekli uyaranlarla muamele edildiğinde monositlerin farklılaşması sonucu makrofajlara d�n�şebilmektedir. U937 h�creleri miyeloid bağlantılı h�creler olup uyaranlara bağlı olarak �ok sayıda sitokin ve kimokin sekresyonu yapabilmektedir21. �alışmamızda PMA ile monositler uyarılmış ve makrofajlara farklılaştığı g�zlenmiştir. Diğer h�cre hatları ile kıyaslandığında parazitin bu h�creler i�erisinde �reme potansiyelinin olduk�a d�ş�k olduğu fakat �alışma sonucunda enfekte edilebildiği ve en az altı hafta boyunca enfeksiyonun devam ettiği g�r�lm�şt�r (Tablo I).

HEK293 h�creleri biyoteknoloji ve h�cre biyolojisinde yaygın olarak kullanılmaktadır22. E.intestinalis, imm�n sistemi baskılanmış hastalarda yaygın enfeksiyon oluşturmakta ve bu hastalarda b�brek tutulumu da g�zlenmektedir23,24. Bu nedenle bu �alışmada HEK293 h�creleri se�ilmiştir. �alışmamızda parazitin �reme potansiyelinin HEK293 h�crelerinde olduk�a y�ksek olduğu ve spor sayısının ise altıncı haftada belirgin bir şekilde arttığı g�r�lm�şt�r (Tablo I).

Sonu� olarak; bu �alışmada insan orijinli �� h�cre hattı ile maymun orijinli VERO h�cre hattında E.intestinalis �reme potansiyeli karşılaştırılmıştır. �alışmada yaygın enfeksiyonlara sebep olan parazitin yerleştiği doku ve organlara ait olan h�crelerin parazit ile enfekte edilebildiği ve enfeksiyonun en az altı hafta boyunca devam ettiği g�sterilmiştir. Bu �alışmanın, E.intestinalis ile ilişkili olarak ger�ekleştirilecek farmakoloji, biyokimya, imm�noloji ve genetik alanlarında yer alan bir�ok �alışmaya katkı sağlayacağını d�ş�nmekteyiz.

KAYNAKLAR

  1. Curry A. Microsporidiosis, pp: 529-55. In: Cox FEG, Wakelin D, Gillespie SH, Despommier DD (eds). Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections; Parasitology. 10th ed. 2005. ASM Press, Washington, D.C.
  2. Franzen C, M�ller A. Molecular techniques for detection, species differentiation and analysis of Microsporidia. Clin Microbiol Rev 1999; 12(2): 243-85.
  3. Sancak B, Aky�n Y. Microsporidia: genel �zellikleri, enfeksiyonları ve laboratuvar tanısı. Mikrobiyol Bul 2005; 39(4): 513-22.
  4. Hamamcı B, �etinkaya �, Berk V, et al. Prevalence of Encephalitozoon intestinalis and Enterocytozoon bieneusi in cancer patients under chemotherapy. Mikrobiyol Bul 2015; 49(1): 105-13.
  5. T�rk S, Doğruman Al F, Karaman �, et al. İshalli olgularda microsporidia sıklığının farklı boyama y�ntemleriyle araştırılması. Mikrobiyol Bul 2012; 46(1): 85-92.
  6. Karaman U, Sener S, Calık S, et al. Akut ve kronik �rtikerli hastalarda microsporidia pozitiflik oranı. Mikrobiyol Bul 2011; 45(1): 168-73.
  7. �etinkaya �, Hamamcı B, Kaynar L, et al. Kemik iliği transplant hastalarında Encephalitozoon intestinalis ve Enterocytozoon bieneusi varlığının IFA-MAbs y�ntemiyle araştırılması. Mikrobiyol Bul 2015; 49(3): 432-8.
  8. Joseph J, Sharma S. In vitro culture of various species of microsporidia causing keratitis: evaluation of three immortalized cell lines. Indian J Med Microbiol 2009; 27(1): 35-9.
  9. Orenstein JM, Dieterich DT, Kotler DP. Systemic dissemination by a newly recognized intestinal microsporidia species in AIDS. AIDS 1992; 6(10): 1143-50.
  10. Mertens RB, Didier ES, Fishbein MC, et al. Encepahlitozoon cuniculi microsporidiosis: infection of the brain, heart, kidneys, trachea, adrenal glands, and urinary bladder in a patient with AIDS. Mod Pathol 1997; 10(1): 68-77.
  11. Visvesvara GS. In vitro cultivation of microsporidia of clinical importance. Clin Microbiol Rev 2002 Jul; 15(3): 401-13.
  12. Ghamiloui MM, Valadkhani Z, Rahimi F. A study of microsporidiosis in corneal scrapings of keratitis patients referring to Farabi eye hospital, Tehran, Iran in 2013-14. Curr Med Mycol 2015; 1(3): 39-44.
  13. Joveeta J, Vemuganti GK, Sharma S. Microsporidia: emerging ocular pathogen. Indian J Med Microbiol 2006; 23(2): 80-91.
  14. Passmore JS, Lukey PT, Ress SR. The human macrophage cell line U937 as an in vitro model for selective evaluation of mycobacterial antigen-specific cytotoxic T-cell function. Immunology 2001; 102(2): 146-56.
  15. Guizani-Tabbane L, Ben-Aissa K, Belghith M, et al. Leishmania major amastigotes induce p50/c-Rel NF-kappa B transcription factor in human macrophages: involvement in cytokine synthesis. Infect Immun 2004; 72(5): 2582-9.
  16. �etinkaya �, Yazar S, Kuk S, et al. The high prevalence of encephalitozoon intestinalis in patients receiving chemotherapy and children with growth retardation and the validity of real-time PCR in its diagnosis. Turk J Med Sci 2016; 46(4): 1050-8.
  17. Keeling PJ, Fast NM. Microsporidia: biology and evolution of highly reduced intracellular parasites.� Ann Rev Microbiol 2002; 56: 93-116.�
  18. Didier ES, Weiss LM. Microsporidiosis: current status. Curr Opin Infect Dis 2006; 19(5): 485-492.
  19. Scanlon M, Shaw AP, Zhou CJ, et al. Infection by microsporidia disrupts the host cell cycle. J Eukaryot Microbiol 2000; 47(6): 525-31.
  20. Ludovisi A, Rossi P, Onori AM, et al. In vitro growth on different cell lines of four microsporidial species infecting humans. Folia Parasitol (Praha) 1998; 45(4): 329-31.
  21. Harris P, Ralph P.� Human leukemic models of myelomonocytic development: a review of the HL-60 and U937 cell lines. J Leukoc Biol 1985; 37(4): 407-22.
  22. Fischer J, Suire C, Hale-Donze H. Toll-like receptor 2 recognition of the microsporidia Encephalitozoon spp. induces nuclear translocation of NF-kappaB and subsequent inflammatory responses. Infect Immun 2008; 76(10): 4737-44.
  23. Nagpal A, Pritt BS, Lorenz EC, et al. Disseminated microsporidiosis in a renal transplant recipient: case report and review of the literature. Transpl Infect Dis 2013; 15(5): 526-32.
  24. Kicia M, Wesolowska M, Kopacz Z, et al. Prevalence and molecular characteristics of urinary and intestinal microsporidia infections in renal transplant recipients. Clin Microbiol Infect 2016; 22(5): 462. e5-9.

İletişim (Correspondence):

Dr. �ğr. �yesi �lfet �etinkaya,

Erciyes �niversitesi Halil Bayraktar

Sağlık Hizmetleri Meslek Y�ksekokulu,

38039 Kayseri, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 352 207 6666/40012,

E-posta (E-mail): ucetinkaya@erciyes.edu.tr

Yazdır