Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2018; 52(4): 401-412

İshalli Olgularda Microsporidia Sıklığının Calcofluor Beyazı ve
Uvitex 2B Kemiluminesans Boyama Y�ntemleriyle Araştırılması ve
T�rlerinin Molek�ler Y�ntemle Tiplendirilmesi*

Investigation of Microsporidia Prevalence with Calcofluor White and
Uvitex 2B Chemiluminescence Staining Methods and
Molecular Analysis of Species in Diarrheal Patients

İlkiz OĞUZ KAYA1, Funda DOĞRUMAN AL1, İpek MUMCUOĞLU2

1 Gazi �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

1 Gazi University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

2 Sağlık Bilimleri �niversitesi Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Mikrobiyoloji Laboratuvarı, Ankara.

2 University of Health Sciences, Ankara Numune Training and Research Hospital, Microbiology Laboratory, Ankara, Turkey.

* Bu �alışma, ilk isim yazarın y�ksek lisans tez �alışmasını i�ermekte olup (Proje no: 01/2011-38) Gazi �niversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir.

* Bu �alışma, 18. Ulusal Parazitoloji Kongresi (29 Eyl�l-5 Ekim 2013)'nde s�zl� bildiri olarak sunulmuştur.

�Z

Zorunlu h�cre i�i paraziti olan Microsporidia, ilk kez 1857 yılında Nageli tarafından tanımlanmıştır. Microsporidia filumunda 200 cins ve 1500 t�r bulunmaktadır. Microsporidia t�rlerinin b�cekler, balıklar ve memeliler gibi geniş bir konak �eşitliliği bulunmaktadır. Hayvanlar dışında insanları da enfekte edebildiği ve insanlarda hem semptomatik hem de asemptomatik olarak bulunabildiği g�sterilmiştir. İnsanı enfekte eden sekiz cins bulunmaktadır. Bu cinsler; Anncaliia (Brachiola, Nosema), Encephalitozoon, Entrocytozoon, Microsporidium, Nosema, Pleistophora, Trachipleistophora ve Vittaforma'dır. İnsanlarda en sık enfeksiyon oluşturan t�rler Encephalitozoon intestinalis ve Enterocytozoon bieneusi'dir. Bu �alışmada iki farklı kemiluminesans boya olan uvitex 2B ve calcoflour ile Microsporidia sıklığının belirlenmesi ve etken t�rlerinin molek�ler olarak tiplendirilmesi ama�lanmıştır. Bu ama�la, 2012-2013 yılları arasında Gazi �niversitesi Sağlık Uygulama ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı ile Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarına g�nderilen ishalli 200 hastanın dışkı �rnekleri incelenmiştir. Dışkı �rnekleri kemiluminesan boya olan uvitex 2B ve calcoflour y�ntemleriyle boyanmış ve floresan mikroskobu ile değerlendirme sonucunda Microsporidia sıklığı %38.5 (77/200) olarak saptanmıştır. Kemiluminesans boya olan uvitex 2B ve calcoflour arasında Microsporidia saptama a�ısından istatistiksel olarak m�kemmel bir uyum olduğu belirlenmiştir (Cohen's kappa= 0.881). Uvitex 2B ile calcoflour'un mikroskop sahasındaki Microsporidia sporlarının sayısal yoğunluğuna (az, �ok) ve sporların parlaklıklarına (soluk, parlak) g�re uyumlulukları istatistiksel olarak değerlendirildiğinde, iki boya arasında sporların sayısal yoğunluğunun saptanması a�ısından orta d�zeyde uyum belirlenirken (Cohen's kappa= 0.354), sporların parlaklıklarının belirlenmesi a�ısından herhangi bir uyum saptanmamıştır (Cohen's Kappa= 0.001). �alışmada Microsporidia sıklığının yaş grupları ve kliniklere g�re dağılımında anlamlı bir fark belirlenmemiştir (p> 0.05). Cinsiyete g�re ise Microsporidia sıklığının kadınlarda (%50) erkeklere (%30.8) g�re daha fazla olduğu tespit edilmiştir (p< 0.05). Uvitex 2B ve calcoflour boyaları ile Microsporidia pozitif saptanan 77 �rnekte multipleks nested polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) y�ntemiyle cins ve t�r d�zeyinde tanımlama yapılmıştır. Kemiluminesan boyalarla Microsporidia tespit edilen 77 izolatın multipleks nested PCR ile yedisi (%9.1) E.bieneusi, 70 (%90.9)'i ise Encephalitozoon spp. olarak belirlenmiştir. Microsporidia cinsleri g�z �n�ne alındığında yaş, cinsiyet ve g�nderilen kliniklere g�re Microsporidia sıklığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (p> 0.05). Bu �alışmada 70 adet Encephalitozoon spp.'nin 44'� (%62.9) E.intestinalis, 22'si (%31.4) E.cuniculi ve d�rd� ise (%5.7) E.hellem olarak belirlenmiştir. Encephalitozoon t�rlerinin yaş, cinsiyet ve kliniklerine g�re dağılımında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (p> 0.05). Microsporidia tanısında ilk aşamada dışkı �rneklerinin kemil�minesans boya olan uvitex 2B ve/veya calcoflour boyama y�ntemleriyle incelenmesinin yararlı olacağı sonucuna varılmış ve multipleks nested PCR y�nteminin cins ve t�r belirlenmesinde kullanılmasının yararlı olduğu g�zlenmiştir. �lkemizde dışkı �rneklerinde Microsporidia prevalansının molek�ler analizi ile ilgili az sayıda �alışma bulunmaktadır. İshalli olgularda tedavi se�eneklerinin değerlendirilmesi ve Microsporidia epidemiyolojisinin saptanması i�in molek�ler y�ntemler daha sık kullanılmalıdır.

Anahtar s�zc�kler: Microsporidia; Enterocytozoon bieneusi; Encephalitozoon spp.; ishal.

ABSTRACT

Microsporidia, obligate intracellular parasites, were first defined by Nageli in 1857. Microsporidia phylum consists of 200 genus and 1500 species. They have a wide host spectrum including insects, fish, and mammals. It has been shown that they may also infect humans and may be existed both in symptomatic and asymptomatic forms. There are eight species infecting humans, which include Anncaliia (Brachiola, Nosema), Encephalitozoon, Entrocytozoon, Microsporidium, Nosema, Pleistophora, Trachipleistophor, and Vittaforma. The species most commonly infect humans are Encephalitozoon intestinalis and Enterocytozoon bieneusi. The aim of this study was to determine the prevalence of Microsporidia by using two different chemiluminescence stains, namely uvitex 2B and calcoflour and detect species by molecular analysis in diarrheal patients. For this purpose, we studied stool samples of 200 patients with diarrhea sent to Gazi University Health Practice and Research Hospital, Microbiology Laboratory and Ankara Numune Training and Research Hospital Microbiology Laboratory between 2012-2013. The stool samples were stained with chemiluminescent stains uvitex 2B and calcoflour methods; the Microsporidia prevalence was found to be 38% (77/200) by fluorescent microscopic examination. Statistically an excellent consistency was found between the chemiluminescent stains uvitex 2B and calcoflour (Cohen's kappa= 0.881). A statistical analysis for the consistency of uvitex 2B and calcoflour in terms of numerical density (low, high) and luminescence of spores (dim, bright) showed a moderate consistency between the two stains with respect to determining numerical density of spores (Cohen's kappa= 0.354), while there was no consistency in terms of luminescence of spores (Cohen's Kappa= 0.001). No significant difference was found between the Microsporidia prevalence with respect to age group or clinics (p > 0.05). A sex-based analysis showed that Microsporidia prevalence was more common in women (50%) than men (30.8%) (p< 0.05). In 77 samples that were detected positive for Microsporidia with uvitex 2B and calcoflour stains determination of genus and species level were done by using multiplex nested polymerase chain reaction (PCR) method. With this technique, seven (9.1%) of 77 isolates were detected as E.bieneusi, and 70 (90.9%) as Encephalitozoon spp. When the Microsporidia genus was considered, the Microsporidia prevalence did not show differences with respect to age, sex, and referring clinics (p> 0.05). In our study 44 (62.9%) of 70 Encephalitozoon spp. were E.intestinalis, 22 (31.4%) were E.cuniculi, and 4 (5.7%) were E. hellem. No statistical difference was found in the distribution of Encephalitozoon spp. with age, sex, and referring clinic (p> 0.05). We concluded that examination of stool samples with the chemiluminescent stain uvitex 2B and/or calcoflour would be useful for the initial stage of Microsporidia diagnosis; furthermore, the multiplex nested PCR method was considered useful for determination of genus and species. In our country, there is a small number of molecular reports about Microsporidia prevalence in stool samples. Molecular methods should be used more commonly for the evaluation of treatment options in diarrheal patients and detection of Microsporidia epidemiology.

Keywords: Microsporidia; Enterocytozoon bieneusi; Encephalitozoon spp.; diarrhea.

Geliş Tarihi (Received): 19.06.2018 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 10.09.2018

GİRİŞ

İlk defa ipek b�ceği ve bal arılarının patojeni olarak yaklaşık 150 yıl kadar �nce tanımlanan Microsporidia'lar, doğada yaygın olarak bulunmakta ve hemen hemen t�m vertebralı ve vertebrasız konakları enfekte edebilmektedirler. Microsporidia filumu �nceden "ilkel protozoonlar" olarak tanımlanırken molek�ler filogenetik analizlerde mantarlarla ilişkili olduğu saptanmıştır1,2. Tek h�creli, sporlu, h�cre i�i paraziti olan Microsporidia t�rleri 1.0-3.0 �m x 1.5-4.0 �m boyutlarında k���k canlılardır3. G�n�m�ze kadar Microsporidia filumunun 200'den fazla cinsi ve 1500'den fazla t�r� tanımlanmıştır. İnsanlarda sekiz cinse ait 14 t�r�n �eşitli enfeksiyonlara neden olduğu belirtilmektedir4. En sık g�r�len klinik tablo ishal olup etken olarak Encephalitozoon t�rleri (Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon hellem, Encephalitozoon cuniculi) ve Enterocytozoon bieneusi izole edilmektedir3.

Microsporidia genellikle insan imm�nyetmezlik vir�s� (HIV) ile enfekte olgularda, transplantasyon hastalarında, kemoterapi alanlarda, kronik otoimm�n hastalıklarla ilişkili imm�nyetmezlik olgularında olduğu gibi imm�n sistemi yetersiz bireylerde fırsat�ı enfeksiyonlara neden olmakla birlikte, imm�n yeterli bireylerde de kendini sınırlayan veya asemptomatik olarak seyreden enfeksiyonlar olarak g�r�lmektedir4.

Microsporidia enfeksiyonlarının kaynağı tam olarak belirlenememiş olsa da insanları enfekte eden t�rlerin genotipleriyle evcil, �iftlik ve doğadaki hayvanlardan izole edilenlerle benzer olması, Microsporidia enfeksiyonunun zoonotik hastalık olarak d�ş�n�lmesini desteklemektedir5,6. Bununla birlikte sporlarla kontamine besin ve suların t�ketilmesinin bulaşta başlıca rol oynadığı da ileri s�r�lmektedir7-10.

Microsporidia tanısında elektron mikroskobu, modifiye trikrom boyama, kitinli spor duvarını hedefleyen floresan boyalar (calcoflour white, uvitex 2B), histokimyasal incelemeler, imm�nfloresan antikor y�ntemi ve son yıllarda yaygınlaşan molek�ler y�ntemler kullanılmaktadır3.

Bu �alışmada, gastrointestinal şikayetleri nedeniyle dışkı incelemesi i�in g�nderilen toplam 200 ishalli dışkı �rneğinde Microsporidia sıklığının saptanması ve t�rlerinin molek�ler y�ntemlerle belirlenmesi ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

Bu �alışma, Gazi �niversitesi Etik Kurul onayı ile ger�ekleştirildi (Tarih: 26.08.2010 ve Karar No: 14).

Gazi �niversitesi Sağlık Uygulama ve Araştırma Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı'na ve Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı'na Aralık 2011-Ocak 2013 tarihleri arasında gastrointestinal şikayetleri nedeniyle dışkı incelemesi i�in g�nderilen toplam 200 ishalli dışkı �rneği �alışmaya dahil edildi. Her �rnek i�in formol-eter �oklaştırma y�ntemi uygulandı11. �oklaştırma yapılan �rnekler + 4�C'de uvitex 2B ve calcoflour boyama y�ntemi yapılıncaya kadar saklandı. Uvitex 2B ve calcoflour boyama y�ntemi i�in lama yayılan �rnekler kurutulduktan sonra metil alkol ile 10 dakika s�reyle tespit edildi.

Calcoflour boyama i�in "Fluorescent Brightener 28" (Sigma, Almanya), %0.1'lik olarak "phosphate buffered saline (PBS)" tablet (Oxoid, İsvi�re) ile sulandırılarak hazırlandı. Evan's mavisi (Sigma, Almanya) ise %5'lik olarak PBS ile sulandırılarak hazırlandı. Calcofluor boyama, sırasıyla 3 dakika calcofluor ile boyama, 1-2 sn distile su ile yıkama, 30 sn Evan's mavisi ile boyama ve 1-2 sn distile su ile yıkama basamakları şeklinde uygulandı12,13. Uvitex 2B boyama i�in ise; uvitex 2B (Polysciences Inc., İngiltere), %1'lik� Evan's mavisi ise %0.5'lik olarak PBS ile sulandırılarak hazırlandı. Uvitex 2B boyama, sırasıyla 10 dakika uvitex 2B ile boyama, 1-2 sn PBS ile yıkama, 1 dakika Evan's mavisi ile boyama ve 1-2 sn PBS ile yıkama basamakları şeklinde uygulandı. Preparatlar kuruduktan sonra immersiyon yağı ile floresan mikroskopta 395-415 nm dalga boyunda x100'l�k objektifle incelendi12,13. T�r tayini yapabilmek i�in boyama y�ntemleri ile Microsporidia spp. saptanan �rneklerin -20˚C'de saklanan alikotlanmış dışkılarından ticari kit kullanılarak (Qiagen Mini Stool Kit, Almanya) DNA izolasyonu yapıldı. Bu ama�la 2 ml'lik ependorflara 180-220 mg dışkı konularak, �zerine 200 �l PBS eklendi ve 20 �l (1.5 U/�l) zymolase (Seikagaku Bio Busines, Japonya) eklendikten sonra 37˚C'de 30 dakika ink�be edildi. Bu işlem sonrasında �retici firmanın �nerileri doğrultusunda DNA izolasyonu yapıldı.

Elde edilen DNA �rneklerinden E.bieneusii ve Encephalitozoon t�rlerinin belirlenmesi multipleks nested PCR y�ntemiyle yapıldı. Bu ama�la kullanılan oligon�kleotit primer dizileri Tablo I'de sunuldu14,15.


Tablo I

Multipleks nested PCR y�nteminde ilk d�ng�de MSP-1, MSP-2A, MSP-2B primerleri kullanılırken, ikinci d�ng�de ise MSP-3, MSP-4A, MSP-4B primerleri kullanıldı ve Katzwinkel-Wladarsch ve arkadaşlarının tanımladığı ısı d�ng� programlarıyla ve karışım i�eriğiyle DNA �oğaltıldı14.

Multipleks nested PCR sonrasında �oğaltılan �r�nler, y�kleme tamponu ile karıştırıldıktan sonra %1.5'lik agaroz jele y�klendi. Etidyum brom�r (2 �l/ml) i�eren 1 x Tris-Borik asit-EDTA tamponunda 15 dakika bekletildikten sonra amplikon b�y�kl�klerine g�re E.bieneusi i�in 500 bp, E.intestinalis i�in 300 bp, E.cuniculi i�in 310 bp, E.hellem i�in ise 320 bp uzunlukta g�zlenen bantlar g�r�nt�lendi.

Verilerin istatistiksel analizi SPSS 15.0 istatistik programı kullanılarak ger�ekleştirildi. İki farklı kemiluminesans boya uyumluluğu Cohen's Kappa testi ile değerlendirildi.

BULGULAR

�alışmaya dahil edilen 200 olgunun 80(%40)'i kadın, 120(%60)'si erkek hastalardan oluşmuştur. Hastaların 0-87 yaş aralığında olduğu saptanmıştır. �rnekler 35 farklı klinikten g�nderilmiştir ancak istatistiksel analiz y�ntemlerinin uygulanabilmesi i�in 35 klinik;� dahili bilimler (n= 130, %65), cerrahi bilimler (n= 15, %7.5) ve pediatri polikliniği (n= 55, %27.5) olmak �zere �� b�l�mde gruplandırılmıştır. Bu gerek�e ile olgular �� farklı yaş grubuna ayrılmış ve yaş grupları; 0-18, 19-45 ve 45 yaş �zeri olarak belirlenmiştir. Buna g�re, 0-18 yaş aralığında 64 (%32), 19-45 yaş aralığında 64 (%32), 45 yaş �zerinde 72 (%36) olgu yer almıştır.

Kadınların %50'sinde erkeklerin %30.8'sinde Microsporidia pozitifliği belirlenmiş ve kadınlardaki Microsporidia sıklığının y�ksek olması istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (Yate's d�zeltmeli ki-kare testi, p< 0.05).

Yaş gruplarına g�re Microsporidia sıklığı değerlendirildiğinde; 0-18 yaş aralığında %39.7, 19-45 yaş aralığında %38.5, 45 yaş ve �zerinde %37.5 olarak belirlenmiş ve yaş gruplarına g�re Microsporidia pozitifliği a�ısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (Pearson ki-kare testi, p> 0.05).

Klinik servislere g�re Microsporidia saptanma sıklığı değerlendirildiğinde; dahili bilimlerden g�nderilen 130 hastanın %36.2'sinde, cerrahi bilimlerden g�nderilen 15 hastanın 7 (%46.7)'sinde ve pediatri polikliniğinden g�nderilen 55 hastanın %41.8'inde pozitiflik saptanmış, klinik gruplara g�re Microsporidia pozitifliği a�ısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark belirlenmemiştir (Pearson ki-kare testi, p> 0.05).

�alışmamızda cinsiyet, yaş ve klinik gruplara g�re E.bieneusi ve Encephalitozoon spp. saptanması a�ısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark tespit edilmemiştir (Pearson ki-kare testi, p> 0.05). Bununla birlikte, E.bieneusi saptanan �rnek sayısı �ok az olduğu i�in bu konuda genelleme yapılması da m�mk�n olmamıştır.

Dışkı �rneklerinin uvitex 2B ve calcoflour boyalarıyla hazırlanan preparatlarının floresan mikroskobuyla incelenmesinde, Microsporidia sporları parlak turkuaz renkli sporlar şeklinde g�r�lm�şt�r (Resim 1,2). Bazı preparatlarda sporun bir ucunda polar filamentten dolayı daha koyu boyanma olduğu tespit edilmiştir (Resim 3).


Resim 1

Resim 2

Resim 3

İki farklı kemiluminesans boyama ile toplam 200 preparat değerlendirilmiş ve uvitex 2B ile incelen �rneklerin 76 (%38)'sında, calcoflour beyazı ile 67 (%33.5)'sinde Microsporidia saptanmıştır. Uvitex 2B boyama y�nteminin saptayıp, calcoflour boyama y�nteminin saptayamadığı 10 �rnek, calcoflour boyama y�nteminin saptayıp, uvitex 2B boyama y�nteminin saptayamadığı bir �rnek belirlenmiştir. Her iki boya ile 66 �rnekte pozitiflik bulunmuştur. İki kemiluminesans boyanın uyumuna bakıldığında calcoflour ile uvitex 2B boyma y�ntemleri arasında m�kemmel bir uyum olduğu saptanmıştır (Cohen's kappa= 0.881). Microsporidia yoğunluğunu belirleme a�ısından her iki boyama y�ntemi arasındaki uyum d�ş�k-orta d�zeyde (Cohen's kappa= 0.354) saptanırken, parlaklıkları değerlendirildiğinde aralarında herhangi bir uyum olmadığı belirlenmiştir (Cohen's kappa= 0.000). Uvitex 2B ile calcoflour boyasına g�re daha parlak g�r�nt� elde edildiği saptanmıştır (p< 0.05).

Her iki boyama y�ntemiyle incelenen 200 �rneğin 77 (%38.5)'sinde Microsporidia tespit edilmiştir. T�r ayrımını yapabilmek amacıyla multipleks nested PCR y�ntemi kullanılmış ve 77 �rneğin t�m� multipleks nested PCR ile tanımlanmıştır. Buna g�re 77 �rneğin 7 (%9.1)'si E.bieneusi, 70 (%90.9)'i Encephalitozoon spp. olarak belirlenmiştir. Encephalitozoon spp. olarak tanımlanan �rneklerin 44 (%62.9)'� E.intestinalis, 22 (%31.4)'si E. cuniculi, 4 (%5.7)'� E.hellem olarak tanımlanmıştır (Resim 4,5).


Resim 4

Resim 5

TARTIŞMA

Microsporidia enfeksiyonları AIDS hastalığından �nce insanlarda nadiren tanımlanırken, �zellikle son 20 yılda tanı y�ntemlerinin gelişmesiyle yalnız bağırsaklarda değil aynı zamanda farklı organ ve dokularıda tutabilen ve sistemik yayılımla seyreden enfeksiyonları dikkat �ekmeye başlamıştır16. Gerek HIV ile enfekte imm�nyetmezliği olan olgularda gerekse HIV ile enfekte olmayan ancak imm�nyetmezliği olan olgularda (organ transplant alıcıları, diğer malign hastalığı olanlar, diyabetli olgular), �ocuklarda, yaşlılarda, bağışıklığı yeterli olan hastalarda enfeksiyonlara neden olmaktadır4,16.

İshal olgularının yaklaşık yarısında etyolojik etken tanımlanamamaktadır. Microsporidia t�rlerinde mevcut tanı g��l�kleri ve rutin laboratuvarlarda uygun testlerin olmaması bu durumda �nemli rol oynamaktadır4.

Bağışıklığı yeterli olan olgularda Microsporidia enfeksiyonlarının asemptomatik seyreden ve kendini sınırlayan enfeksiyonlar olduğu d�ş�n�lmekle birlikte, AIDS olgularının %30-70'inde ishal ataklarına neden olabildiği bildirilmektedir4.

İran'da AIDS, hematolojik malignansi, hemodiyaliz ve b�brek nakil olgularının toplam 310 dışkı �rneğinde modifiye trikrom (Weber) y�ntemi ve multipleks nested PCR y�ntemi ile sırasıyla %30 ve %28.4 sıklığında Microsporidia pozitifliği saptanmıştır. Microsporidia'ların %70.4'� E.bieneusi, %29.6'sı ise Encephalitozoon t�rleri olarak belirlenmiştir. Encephalitozoon t�rlerinin 19'u E.intestinalis, d�rd� E.hellem, ��� E.cuniculi olarak tanımlanmıştır17.

Diğer bir �alışmada ise HIV pozitif olgularda %11.6 E.bieneusi pozitifliği saptanırken, HIV negatif olgularda pozitiflik saptanamamıştır18. Başka bir �alışmada ise HIV pozitif olgularda Microsporidia prevalansı %36 olarak belirlenmiş, E.intestinalis t�r� baskın t�r olarak saptanmıştır19.

Hindistan'da multipleks nested PCR, modifiye trikrom boyama ve calcoflour boyama y�ntemleriyle ishalli ve ishalsiz HIV pozitif olgular ile ishalli HIV negatif olgular ve sağlıklı olgularda Microsporidia sıklığı araştırıldığında, 395 olgunun dışkı �rneğinde modifiye trikrom boyama y�ntemiyle %5.6, calcoflour beyazı boyama y�ntemiyle %24.8, PCR ile %14.4 Microsporidia pozitifliği (E.intestinalis n= 40, E.bieneusi n= 17) saptanmıştır. Microsporidia varlığı PCR y�ntemiyle HIV pozitif ishalli olgularda %30.4, HIV pozitif ishalsiz olgularda %7.6, HIV negatif ishalli olgularda ise %12.7 olarak saptanmış, sağlıklı kişilerin hi�birinde parazit belirlenememiştir20. Kahnduja ve arkadaşları21 ise HIV pozitif olgularda Microsporidia pozitifliğini sağlıklı kontrollere g�re anlamlı d�zeyde y�ksek olarak belirlemişler ve sadece E.bieneusi saptadıklarını (%1.8), Encephalitozoon spp. belirlemediklerini bildirmişlerdir. Araştırmacılar Microsporidia pozitifliğinin ishalli HIV pozitif olgularda daha yaygın olduğunu belirlemişlerdir.

Weber modifiye trikrom boyama, calcoflour ve akridin oranj boyama y�ntemleriyle ishalli olgularda %9.8 sıklığında Microsporidia pozitifliği belirlediğimiz daha �nceki �alışmamızda, Microsporidia sıklığında erişkin ve �ocuk yaş grubu ile cinsiyet farklılığı a�ısından istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmamıştır. Bununla birlikte, pratik bir y�ntem olan calcoflour boyama y�nteminin modifiye trikrom ile �ok g��l� seviyede tutarlılık g�sterdiği, duyarlılık ve �zg�ll�ğ�n�n y�ksek olduğu belirlenmiştir12. Diğer bir �alışmamızda ise, modifiye trikrom, calcoflour ve uvitex 2B boyama y�ntemleriyle Microsporidia akut ishalli olgularda %27, kronik ishalli olgularda %34.1 ve ilgin� olarak sağlıklı g�n�ll�lerde %45.5 sıklığında saptanmış, yine şaşırtıcı olarak yaş ilerledik�e ve katı dışkılarda pozitifliğin arttığı g�zlenmiştir13. Bu �alışmamızda ise kadınlarda Microsporidia pozitifliği daha y�ksek olarak saptanırken (p< 0.05) yaş grupları arasında bir fark belirlenmemiştir.

Bağışıklığı yeterli, gastrointestinal şikayeti olan erişkinlerde modifiye trikrom ve calcoflour y�ntemleriyle %6.5 sıklığında Microsporidia saptanan bir �alışmada, yaş ve cinsiyetle ilişkisi g�sterilememiş, klinik olarak dispepsi ile ilişkisi olduğu belirlenmiştir22. Aynı �alışmada gastrointestinal şikayeti olan bağışıklığı yeterli �ocuklarda aynı boyalara kullanılarak %7.8 Microsporidia pozitifliği saptanmıştır23.

Başka bir �alışmada gastrointestinal şikayetleri olan kanserli olgular ile kanserli olmayan olgularda modifiye trikrom ve calcoflour boyama y�ntemleriyle Microsporidia pozitifliği a�ısından istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmıştır (p< 0.01)24.�

Microsporidia tanısında yaygın olarak kullanılan boyama tekniklerinin PCR y�ntemine g�re duyarlılığının, �zg�ll�ğ�n�n ve tanı etkinliğinin daha d�ş�k olduğu, boyama y�ntemleriyle PCR uyumunun da orta d�zeyde olduğu belirtilmektedir. Aynı zamanda PCR y�ntemiyle Microsporidia t�rlerinin tanımlanması m�mk�n olmaktadır20. Dışkıda artefaktların ve h�cre duvarında bulunan kitin yapısı nedeniyle mayaların calcoflour ile boyanma �zelliklerinin olması yanlış pozitifliğin ve negatifliğin sebebi olabilmektedir25.

Boyama y�ntemlerinin d�ş�k duyarlılık ve �zg�ll�kte olması ve tecr�be gerektirmesi nedeniyle daha pratik olan imm�nfloresan antikor (IFA) y�nteminin RFLP-PCR ile karşılaştırıldığı bir �alışmada, IFA y�nteminin Microsporidia tanısını %95.2 duyarlılık ve %100 �zg�ll�kle ger�ekleştirdiği saptanmıştır. Bu y�ntem pratik olması ve yoğun tecr�be gerektirmemesine rağmen, d�ş�k b�t�eli ve floresan mikroskobu olmayan laboratuvarlarda kullanım şansı bulması m�mk�n olmamaktadır26. Diğer bir �alışmada IFA y�ntemiyle kemik iliği transplant alıcılarının %25.5'inde E.intestinalis, %4'�nde E.bieneusi ve %9.5'inde� iki t�r birden olmak �zere, toplam %39'unda Microsporidia pozitifliği saptanmıştır. Bu oranlar sağlıklı kontrol grubu i�in sırasıyla %5, %2.5, %3.8 ve %11.3 olarak tespit edilmiştir. Hasta ve kontrol gruplarında saptanan pozitiflik oranları arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Aynı �alışmada hasta grubunda pozitif bulunan 78 hastanın 67 (%85.9)'sinin ishalli olduğu izlenmiş; ishal varlığı ile parazit pozitifliği arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişkinin olduğu g�r�lm�şt�r27. Bizim �alışmamızda da t�m olgular ishalli olup Microsporidia pozitifliğimiz %38.5 gibi y�ksek bir oran olarak belirlenmiştir. Bu sonu� diğer �alışmalarda olduğu gibi ishalle Microsporidia ilişkisini ortaya koymaktadır. Kemoterapi alan kanserli olgularda da IFA-MAb y�ntemi ile hastaların 43 (%46.2)'�nde. E.intestinalis, 9 (%9.7)'unda E.bieneusi ve 13 (%14)'�nde karışık enfeksiyon olmak �zere toplam 65 (%69.9) olguda pozitiflik saptanmış; kontrol grubunda ise 2 (%6.7) E.intestinalis, 1 (%3.3) E.bieneusi ve 2 (%6.7) karışık enfeksiyon olmak �zere toplam 5 (%16.7) pozitif sonu� alınmıştır. Hasta ve kontrol grubunun pozitiflik oranları arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p< 0.05). İshalli hastalardan %68.6 (35/51)'sının Microsporidia ile enfekte olduğu izlenmiş; Microsporidia pozitiflik oranı ishali olan ve olmayan olgular arasında anlamlı fark g�sterilmiştir (p< 0.05). T�m y�ntemlerin birlikte uygulandığı 50 �rnek değerlendirildiğinde; Microsporidia pozitiflik oranları IFA-MAb y�ntemi ile %66 (n= 33), modifiye trikrom boyama ile %34 (n= 17), aside diren�li trikrom boyama ile %24 (n= 12) ve calcoflour boyama ile %42 (n= 21) olarak belirlenmiştir28.

�alışmamızda calcoflour ve uvitex 2B'nin kullanıldığı her iki boyama y�ntemiyle incelenen 200 �rneğin 77 (%38.5)'sinde Microsporidia tespit edilmiştir. T�r ayrımını yapabilmek amacıyla multipleks nested PCR y�ntemi kullanılmış ve 77 �rneğin t�m� multipleks nested PCR ile tanımlanmıştır. Buna g�re 77 �rneğin 7 (%9.1)'si E.bieneusi, 70 (%90.9)'i Encephalitozoon spp. olarak belirlenmiştir. Encephalitozoon spp. olarak tanımlanan �rneklerin 44 (%62.9)'� E.intestinalis, 22 (%31.4)'si E.cuniculi, 4 (%5.7)'� E.hellem olarak tanımlanmıştır.

Pakistan'da t�r spesifik primerlerle yapılan PCR ve sonrasında DNA dizi analizi ile kronik ishalli olgularda %5, hepatosel�ler karsinomlularda %17 ve sağlıklı olgularda %1.4 sıklığında E.intestinalis belirlenmiş, olguların hi�birinde E.bieneusi tespit edilmemiştir29. Bu sonu� bizim de Microsporidia t�rleri i�inde E.bieneusi'nin az sayıda saptanması bulgusuyla uyumluluk g�stermektedir. İlgin� olarak bu durumla �elişecek şekilde Malezya'da sosyoekonomik d�zeyi d�ş�k, sanitasyon koşulları yetersiz b�lgede yaşayan bağışıklığı yeterli bireylerde PCR ile E.bieneusi %3.8 sıklığında saptanmış, �rneklerin hi�birinde
E.intestinalis belirlenememiştir30.

Cinsiyetler arasında Microsporidia pozitifliğinin saptanması a�ısından istatistiksel olarak fark saptanmayan �alışmalar bulunmasına rağmen �alışmamızda Microsporidia pozitifliği kadınlarda erkeklerden anlamlı olarak daha y�ksek belirlenmiştir (p< 0.05)27,28. Ashikin ve arkadaşları30 ise E.bieneusi pozitifliğini erkeklerde (%5.12), kadınlardan (%2.66) daha y�ksek olarak belirlerken, �alışmada yalnızca E.bieneusi t�r� araştırılmış ve katı dışkılarda pozitifliğin daha sık olduğunu saptanmıştır.

Dışkı �rneklerinden DNA izolasyonunda �zellikle Microsporidia spor duvarının etkili bir şekilde par�alanması DNA eldesinde �nemli bir aşamayı oluşturmaktadır. Bu konuda standart bir y�ntem bulunmaması �alışmaların karşılaştırılmasında zorluk yaratmaktadır31. Farklı prevalans sonu�larının alınması ve t�r dağılımındaki değişkenlik; farklı coğrafik b�lgelerde yapılan �alışmalar, kullanılan y�ntemler, se�ilen primerler, bazı �alışmalarda yalnız E.bieneusi ve E.intestinalis'in araştırılması, �alışmaya alınan dışkı �rneklerinin ishalli olup olmaması, �alışmaya dahil edilen olguların klinik �zellikleri nedeniyle farklılık g�stermektedir. �alışmalar imm�nyetmezlikli olguların yanında bağışık olgularda da Microsporidia t�rlerinin ishal etkeni olabileceğini g�stermektedir12,13,30.

Sonu� olarak, bu �alışmada ishalli dışkı �rneklerinde Microsporidia tanısında kemiluminesans boya olan uvitex 2B ve/veya calcoflour boyama y�ntemlerinin pratik ve hızlı olması nedeniyle ilk tarama testi olarak kullanılmasının faydalı olacağı ve multipleks nested PCR y�nteminin cins ve t�r belirlenmesinde yararlı olduğu sonucuna varılmıştır. �lkemizde insanlarda Microsporidia sıklığı ile ilgili az sayıda �alışma bulunmaktadır. Yapılan �alışmalarda genellikle mikroskobik y�ntemler kullanılmıştır12,13,22,23,27,28. Bu �alışma, �lkemizde ishalli olgularda multipleks nested PCR ile Microsporidia t�r tayininin yapıldığı ilk �alışmadır. Tanı ve tedavi se�eneklerinin belirlenmesi ve Microsporidia epidemiyolojisi a�ısından t�rlerin tespiti i�in molek�ler y�ntemlerin yaygınlaşması gerekmektedir.

Teşekk�r

Pozitif kontrol olarak kullanılan E.bieneusi ve Encephalotizoon spp. t�rlerini sağladıkları i�in Elizabeth Didier ve Lisa Bowers'a teşekk�r ederiz.

KAYNAKLAR

  1. Weiss LM, Edlind TD, Vossbrinck CR, et al. Microsporidian molecular phylogeny: the fungal connection. J Eukaryot Microbiol 1999; 46(5): 17S-18S.
  2. James TY, Kauff F, Schoch CL, et al. Reconstructing the early evolution of fungi using a six-gene phylogeny. Nature 2006; 443(7113): 818-22.
  3. Didier ES, Weiss LM. Intestinal microsporidiosis. Curr Opin Infect Dis 2006; 19(5): 485-92.
  4. Field AS, Milner DA Jr. Intestinal microsporidiosis. Clin Lab Med 2015; 35(2): 445-59.
  5. Leśniańska K, Perec-Matysiak A. Wildlife as an environmental reservoir of Enterocytozoon bieneusi� (microsporidia)- analyses of data based on molecular methods. Ann Parasitol 2017; 63(4): 265-81.
  6. Javanmard E, Mirjalali H, Niyyati M, et al. Molecular and phylogenetic evidences of dispersion of human-infecting microsporidia to vegetable farms via irrigation with treated wastewater: one-year follow up. Int J Hyg Environ Health 2018; 221(4): 642-51.
  7. Mathis A, Weber R, Deplazes P. Zoonotic potential of the Microsporidia. Clin Microbiol Rev 2005; 18(3): 423-45.
  8. Mehlhorn H. Microsporidia, pp: 123-128 In: Human Parasites, Diagnosis, Treatment, Prevention. 2016, Springer, Switzerland.
  9. Karaman �, Kol�ren Z, Seferoğlu O, et al. Presence of parasites in environmental waters in Samsun and Its districts. Turkiye Parazitol Derg 2017; 41(1): 19-21.
  10. Chen JS, Hsu BM, Tsai HC, et al. Molecular surveillance of Vittaforma-like Microsporidia by a small-volume procedure in drinking water source in Taiwan: evidence for diverse and emergent pathogens. Environ Sci Pollut Res Int� 2018; 25(19): 18823-37.
  11. Garcia LS. Macroscopic and Microscopic examination of fecal specimens, pp:32-41, In: Diagnostic Medical Parasitology. 2016, 6th ed. ASM Press, USA.
  12. T�rk S, Doğruman Al F, Karaman U, et al. Investigation of Microsporidia prevalence by different staining methods in cases of diarrhea. Mikrobiyol Bul 2012; 46(1): 85-92.
  13. Mumcuoglu I, Cetin F, Dogruman Al F, et al. Prevalence of Microsporidia in healthy individuals and immunocompetent patients with acute and chronic diarrhea. Infect Dis (Lond) 2016; 48(2): 133-7.
  14. Katzwinkel-Wladarsch S, Deplazes P, Weber R, et al. Comparison of polymerase chain reaction with light microscopy for detection of Microsporidia in clinical specimens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1997; 16(1): 7-10.
  15. Franzen C, M�ller A. Molecular techniques for detection, species differentiation, and phylogenetic analysis of Microsporidia. Clin Microbiol Rev 1999; 12(2): 243-85.
  16. Didier ES, Weiss LM. Microsporidiosis: not just in AIDS patients. Curr Opin Infect Dis 2011; 24(5): 490-5.
  17. Tavalla M, Mardani-Kateki M, Abdizadeh R, et al. Molecular identification of Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon spp. in immunodeficient patients in Ahvaz, Southwest of Iran. Acta Trop 2017; 172: 107-12.
  18. Liu H, Jiang Z, Yuan Z et al. Infection by and genotype characteristics of Enterocytozoon bieneusi in HIV/AIDS patients from Guangxi Zhuang autonomous region, China. BMC Infect Dis 2017; 17(1): 684.
  19. Rivero-Rodr�guez Z, Hern�ndez Sierra A, Arr�iz N, et al. Prevalence of Encephalitozoon intestinalis and Enterocytozoon bieneusi in HIV positive patients to Maracaibo, Venezuela. Invest Clin 2013; 54(1): 58-67.
  20. Saigal K, Khurana S, Sharma A, et al. Comparison of staining techniques and multiplex nested PCR for diagnosis of intestinal microsporidiosis. Diagn Microbiol Infect Dis 2013; 77(3): 248-9.
  21. Khanduja S, Ghoshal U, Agarwal V, et al. Identification and genotyping of Enterocytozoon bieneusi among human immunodeficiency virus infected patients. J Infect Public Health 2017; 10(1): 31-40.
  22. Atambay M, Karaman U, Daldal N, et al. The prevalence of Microsporidium among adult patients admitted to the parasitology laboratory at the Inonu University Turgut Ozal Medical Center. Turkiye Parazitol Derg 2008; 32(2): 113-5.
  23. Calik S, Karaman U, Colak C. Prevalence of microsporidium and other intestinal parasites in children from Malatya, Turkey. Indian J Microbiol 2011; 51(3): 345-9.
  24. Karaman U, Atambay M, Daldal N, et al. The prevalence of microsporidium among patients given a diagnosis of cancer. Turkiye Parazitol Derg 2008; 32(2): 109-12.
  25. Garcia LS. Intestinal Protozoa (Coccidia), Microsporidia, Algae, pp: 648-662. In: Diagnostic Medical Parasitology. 2016, 6th ed. ASM Press, USA.
  26. Ghoshal U, Khanduja S, Pant P, et al. Evaluation of immunoflourescence antibody assay for the detection of Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon intestinalis. Parasitol Res 2016; 115(10): 3709-13.
  27. �etinkaya �, Hamamcı B, Kaynar L, et al. Investigation of the presence of Encephalitozoon intestinalis and Enterocytozoon bieneusi in bone marrow transplant patients by IFA-MAbs method. Mikrobiyol Bul 2015; 49(3): 432-8.
  28. Hamamcı B, �etinkaya �, Berk V, et al. Prevalence of Encephalitozoon intestinalis and Enterocytozoon bieneusi in cancer patients under chemotherapy. Mikrobiyol Bul 2015; 49(1): 105-13.
  29. Yakoob J, Abbas Z, Beg MA, et al. Microsporidial infections due to Encephalitozoon intestinalis in non-HIV-infected patients with chronic diarrhoea. Epidemiol Infect 2012; 140(10): 1773-9.
  30. Ashikin A, Al-Mekhlafi HM, Moktar N, et al. Molecular detection and species identification of Enterocytozoon bieneusi isolated from immunocompetent Orang Asli in Malaysia. Parasitol Int 2017; 66(2): 163-5.
  31. �etinkaya �, Charyyeva A, Sivcan E, et al. Evaluation of four commercial DNA extraction kits for the detection of Microsporidia and the importance of pretreatments in DNA isolation. Acta Parasitol 2018; 63(2): 386-92.

İletişim (Correspondence):

Prof. Dr. Funda Doğruman Al,

Gazi �niversitesi Tıp Fak�ltesi Tıbbi,

Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

06500, Beşevler, Ankara, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 312 202 4625,

E-posta (E-mail): alfunda@yahoo.com

Yazdır