Yazdır

Üriner Enterokok İzolatlarının Antibiyotik Direnci ile Virülans Faktörleri Arasındaki İlişki

The Relationship Between Antibiotic Resistance and Virulence Factors in Urinary Enterococcus Isolates

Orhan BAYLAN1, Hasan NAZİK2, Bayhan BEKTÖRE1, Burak Ekrem ÇİTİL1, Deniz TURAN2, Betigül ÖNGEN2,
Mustafa ÖZYURT1, Cengiz Han AÇIKEL3, Tunçer HAZNEDAROĞLU1

1 Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Haydarpaşa Eğitim Hastanesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Servisi, İstanbul.

1 Gulhane Military Medical Academy, Haydarpasa Training Hospital, Department of Medical Microbiology, Istanbul, Turkey.

2 İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul.

2 Istanbul University Faculty of Istanbul Medicine, Department of Medical Microbiology, Istanbul, Turkey.

3 Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Halk Sağlığı Anabilim Dalı, Ankara.

3 Gulhane Military Medical Academy, Department of Public Health, Ankara, Turkey.

ÖZET

Son yıllarda tüm dünyada nozokomiyal enterokok suşlarında artan çoklu antimikrobiyal direnç gelişimi, özellikle virülans faktörleri olmak üzere enterokokların daha iyi incelenmesi gerektiğini ortaya koymuştur. Klinik izolatların virülans faktörleri konusunda halen pek çok şey bilinmemektedir. Bu çalışmada, hastanemizde Ocak 2008-Haziran 2010 ayları arasında yatan hastaların idrar kültürlerinden izole edilen toplam 91 enterokok izolatının (59 E.faecalis, 31 E.faecium ve 1 E.gallinarum) çeşitli antibiyotiklere direnç durumları ve potansiyel virülans faktörlerinin araştırılması amaçlanmış ve aralarında bir ilişkinin var olup olmadığı irdelenmiştir. Bu amaçla, enterokokların virülans faktörlerinden agregasyon faktörü (AF), enterokok yüzey proteini (ESP) ve hiyalüronidazı (HYL) kodlayan genler (sırasıyla asa1, esp, hyl) moleküler yöntemlerle, hemolizin üretimi ve jelatinaz aktivitesi ise fenotipik yöntemlerle araştırılmıştır. Vankomisine dirençli bulunan enterokoklar, ayrıca vanA ve vanB genlerinin varlığı açısından incelenmiştir. E.faecium suşlarından 8 (%25.8)'inin glikopeptidlere dirençli olduğu saptanmış, bunların yedisinin vanA, birinin ise vanA-vanB dışı direnç tipinde olduğu belirlenmiştir. Yüksek düzey gentamisin ve yüksek düzey streptomisin direnci, E.faecium suşlarında sırasıyla %74.2 ve %61.3 iken, E.faecalis suşlarında %22 ve %27.1 olarak tespit edilmiştir. İncelenen suşların hiçbirisinde beta-laktamaz üretimi ve linezolid direnci tespit edilmemiştir. Tetrasiklin, minosiklin, doksisiklin ve streptogramin dışında test edilen antibiyotiklere E.faecium izolatlarının, E.faecalis izolatlarına göre daha dirençli (p< 0.001-0.013), bu dört antibiyotiğe ise daha duyarlı (p< 0.001) oldukları saptanmıştır. E.faecalis izolatlarında esp (p= 0.003) ve asa1 (p< 0.001) gen pozitifliğinin yanı sıra hemolizin üretimi (p= 0.014) ve jelatinaz aktivitesi (p= 0.029), E.faecium izolatlarında ise hyl gen pozitifliği (p< 0.001) anlamlı düzeyde yüksek bulunmuştur. AF ve ESP, sırasıyla %26.7 ve %25.6 pozitiflik oranları ile çalışmamızda en sık saptanan virülans faktörleri olmuştur. İzolatlarımızdan 5 (%5.6)'inin üçer, 16 (%17.8)'sının ikişer ve 37 (%41.1)'sinin ise sadece birer virülans faktörü içerdiği, 32 (%35.6) izolatın ise herhangi bir virülans faktörü içermediği belirlenmiştir. İncelenen virülans faktörlerinden tümünü veya dördünü bir arada içeren izolat saptanmamıştır. Çalışmamızda ayrıca asa1 geni pozitif E.faecalis izolatlarının siprofloksasin (p= 0.001), norfloksasin (p= 0.006) ve levofloksasine (p= 0.001), esp geni pozitif E.faecalis izolatlarının doksisikline (p= 0.043) ve hyl geni pozitif E.faecium izolatlarının ise nitrofurantoine (p= 0.011), söz konusu genleri içermeyen izolatlara göre anlamlı düzeyde daha dirençli oldukları saptanmıştır. Bu çalışma, üriner enterokok izolatlarının antibiyotik direnci ile virülans faktörleri arasındaki ilişkinin incelendiği ülkemizdeki ilk hasta kaynaklı çalışma olma özelliğini taşımaktadır.

Anahtar sözcükler: Yatan hasta; üriner sistem enfeksiyonu; Enterococcus türleri; antimikrobiyal direnç; virülans faktörü.

ABSTRACT

Increasing multidrug resistance in nosocomial Enterococcus strains from all over the world recently enhances the need for further investigation of enterococci, especially their virulence factors. There are still many lacking parts about virulence factors of clinical enterococcus isolates. In this study, it was aimed to investigate the antibiotic resistance and the presence of potential virulence factors of 91 Enterococcus strains (59 E.faecalis, 31 E.faecium and 1 E.gallinarum) isolated from urine cultures of inpatients between January 2008-June 2010 in our hospital and also to evaluate whether a correlation existed between antibiotic resistance and potential virulence factors. The genes which encoded virulence factors of enterococci; aggregation substance (AS), enterococcal surface protein (ESP) and hyaluronidase (HYL) (asa1, esp, hyl respectively) were studied by molecular methods and haemolysin production and gelatinase activity were studied by phenotypic methods. Vancomycin-resistant strains were checked for the presence of vanA and vanB genes. Eight (25.8%) E.faecium isolates were found glycopeptide resistant. In seven of these isolates resistance type was vanA and in one it was neither vanA nor vanB. High-level gentamicin and high-level streptomycin resistance rates were 74.2% and 61.3% in E.faecium strains and were 22% ve 27.1% in E.faecalis strains, respectively. Beta-lactamase production and linezolid resistance were not detected in any of the strains. E.faecium isolates were more resistant (p< 0.001-0.013) than E.faecalis isolates to all tested antibiotics except tetracycline, minocycline, doxycycline and streptogramin (p< 0.001). hyl gene positivity (p< 0.001) was found higher in E.faecium isolates whereas esp (p= 0.003) and asa1 (p< 0.001) gene positivity, haemolysin production (p= 0.014) and gelatinase activity (p= 0.029) were higher in E.faecalis isolates. AS and ESP were the most frequent virulence factors, with the rates of 26.7% and 25.6%, respectively. There were 32 (35.6%) strains without any of the investigated virulence factors. We have also detected that asa1 gene positive E.faecalis isolates were more resistant to ciprofloxacin (p= 0.001), norfloxacin (p= 0.006) and levofloxacin (p= 0.001) than asa1 gene negative isolates; esp gene positive E.faecalis isolates were more resistant to doxycycline (p= 0.043) than esp gene negative isolates and hyl gene positive E.faecium isolates were more resistant to nitrofurantoine (p= 0.011) than hyl gene negative isolates. This was the first clinical sample originated study, investigating the corelation between antibiotic resistance and virulence factors in urinary Enterococcus isolates in Turkey.

Key words: Enterococcus spp.; inpatients; urinary tract infection; antimicrobial resistance; virulence factors.

Geliş Tarihi (Received): 06.01.2011 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 06.04.2011

GİRİŞ

İnsan ve hayvanlarda doğal flora üyesi olarak bulunan enterokoklar, günümüzde, başta üriner sistem enfeksiyonu (ÜSE) olmak üzere birçok nozokomiyal enfeksiyonun en yaygın görülen etkenlerindendir1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. Enfeksiyonlardan sorumlu en az 12 enterokok türünün varlığına rağmen en sık E.faecalis ve E.faecium türlerine rastlanmaktadır2.

Enterokokların nozokomiyal ÜSE olan hastalardan izolasyon oranı yıllar içerisinde düzenli artış göstermekte olup son yıllarda saptanma sıklıkları ikinci sıraya yükselmiştir1,2,10,12,15. Tüm dünyada özellikle nozokomiyal enterokok suşlarında giderek artan çoklu antimikrobiyal direnç gelişimi, ciddi sorunlara neden olmaya başlamıştır1,2,8,10,11,14,15. Enterokoklar, birçok beta-laktam antibiyotiğe ve aminoglikozidlere intrinsik olarak ya dirençli ya da toleranslıdırlar13,14. Antibiyotiklere karşı direnç gelişimi, direnç genlerini içeren transpozon veya plazmidlerin kazanılmasıyla veya mutasyonlarla olmaktadır13. Enterokokların antibiyotik direnci ile ilgili konularda yapılan çok sayıdaki çalışmaya rağmen, virülans faktörleri ve patojenite mekanizmaları konularında yapılan çalışmalar yetersiz kalmaktadır2,6,8,10,11,12,13,14,15.

Enterokokların virülansında, genomda bulunan patojenite adaları ve plazmidlerde kodlanan virülans genleri rol oynar. Bu bakterilerin başlıca virülans faktörleri arasında; agregasyon faktörü (AF), enterokok yüzey proteini (ESP), hiyalüronidaz (HYL), hemolizin ve jelatinaz yer almaktadır1,2,3,4,9,10,11,12,13,14,16,17. AF, plazmidlerdeki asa1 geni tarafından kodlanan ve E.faecalis'lerin yüzeyinde eksprese edilen bir glikoproteindir. E.faecalis enfeksiyonlarının başlangıcında rol oynadığı düşünülen AF, bakterinin nötrofil, kalp endokard ve böbrek tübüler hücreleri gibi çeşitli hücre yüzeylerine adezyonunu artırmaktadır1,3,7,8,9,10. Kromozomal esp geni tarafından kodlanan ve hücre duvarı ile ilişkili bir protein olan ESP, esas olarak E.faecalis'in hücre yüzeyinde yer alır. Bakteriyi, konağın bağışıklık sisteminden koruduğu düşünülen ESP, enterokokların üriner sistemde persistansı, kolonizasyonu ve artmış virülansı ile ilişkili bulunmuştur1,2,3,5,6,7,9,10,12,14,15,16. Kromozomal hyl geni tarafından kodlanan ve özellikle E.faecium tarafından sentezlenen HYL, hyalüronik asidi etkileyerek doku hasarına yol açmakta, bağ dokusunun mukopolisakkarid kısmını depolimerize etmekte, böylece enterokokların olduğu kadar toksinlerinin de konak dokusunda yayılmasını kolaylaştırmaktadır10. Ancak HYL'nin ÜSE patogenezindeki rolü tam olarak anlaşılamamıştır10,14,16. Hemolizin, insan, tavşan ve at eritrositlerini parçalayan ve birçok gram-pozitif bakteriye karşı bakterisidal olan bir toksindir7,10,13. Hemolizin, hem ökaryotik hem de prokaryotik hücrelerde lizise neden olmasından dolayı daha çok sitolizin olarak adlandırılır7,9,12. Hemolizin genleri (cyl), genellikle feromona duyarlı plazmidler üzerinde taşınırlar; ancak patojenite adaları içinde bakteriyel kromozoma da entegre olabilirler1,3,9,10,12. Kromozomal gelE geni tarafından kodlanan jelatinaz (metalloproteaz) enzimi ise, kollajen, jelatin, kazein, hemoglobin ve diğer biyoaktif küçük peptidleri hidrolize eden ve hayvan modellerinde endoftalmit ve endokarditi şiddetlendiren hücre dışı bir çinko-endopeptidazdır1,3,5,9,10,13,14,16.

Bu çalışmada, İstanbul'da bulunan 1000 yatak kapasiteli eğitim hastanemizde Ocak 2008-Haziran 2010 arası dönemde yatan hastaların idrar kültürlerinden izole edilen enterokok suşlarının çeşitli antibiyotiklere direnç durumları ile potansiyel virülans faktörlerinin belirlenmesi ve antibiyotik direnç durumları ile virülans faktörleri arasında bir ilişkinin irdelenmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla, enterokokların virülans faktörlerinden asa1, esp ve hyl genleri moleküler yöntemlerle, hemolizin üretimi ve jelatinaz aktivitesi ise fenotipik yöntemlerle araştırılmıştır. Çalışmamızda aynı zamanda vankomisine dirençli bulunan enterokoklar, vanA ve vanB genlerinin varlığı açısından incelenmiştir.

GEREÇ ve YÖNTEM

Hastalar

Çalışmaya, hastanemizin farklı servislerinde ≥ 3 gün yatan, üriner sistem şikayetleri nedeniyle yapılan idrar kültürlerinde saf kültür olarak ≥ 105 cfu/ml enterokok cinsi bakteri üreyen ve klinik olarak komplike olmamış alt ÜSE tanısı konan 91 hasta (53 erkek, 38 kadın) alındı.

Bakterilerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Yatan hastaların uygun koşullarda alınarak laboratuvarımıza gönderilen orta akım idrar örnekleri, %5'lik koyun kanlı agar (Salubris, Türkiye) ve eozin metilen mavisi agar (Salubris, Türkiye) besiyerlerine ekildi ve 37°C'de 24 saat inkübe edildi. Gram-pozitif kok morfolojisinde, katalaz testi negatif kolonilerden alınarak %40'lık safra tuzu içeren eskülin agar (Merck, Almanya) ve %6.5'lik NaCl eklenmiş beyin kalp infüzyon buyyona (HiMedia, Hindistan) ekimler yapıldı. Ayrıca suşlara pirolidonil arilamidaz (PYR) (Oxoid, İngiltere) testi uygulandı. Eskülin besiyerini karartan, %6.5'lik NaCl içeren besiyerinde üreyebilen ve PYR testi pozitif bakteriler, enterokok cinsi olarak tanımlandı. İzolatların tür düzeyinde tanımlanması, VITEK 2 Compact otomatize sisteminin (bioMerieux, Fransa) GP kolorimetrik tanımlama kartları kullanılarak yapıldı.

Duyarlılık Testi

Tür düzeyinde tanımlanan 91 enterokok suşunun antibiyotiklere direnç durumları, "Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)"18 önerileri doğrultusunda Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi ile Mueller Hinton agar (Salubris, Türkiye) besiyeri kullanılarak araştırıldı. Duyarlılık testlerinde, vankomisin (30 µg), tetrasiklin (30 µg), rifampin (5 µg), penisilin G (10 µg), siprofloksasin (5 µg), levofloksasin (5 µg), norfloksasin (10 µg), teikoplanin (30 µg), ampisilin (10 µg), minosiklin (30 µg), doksisiklin (30 µg), nitrofurantoin (300 µg), yüksek düzey gentamisin (120 µg) ve yüksek düzey streptomisin (300 µg) diskleri (Bioanalyse, Türkiye) ile linezolid (30 µg), kinopristin/dalfopristin (streptogramin) (15 µg), fosfomisin trometamin (200 µg fosfomisin + 50 µg glikoz–6-fosfat) diskleri (Oxoid, İngiltere) kullanıldı. Beta-laktamaz aktivitesi, kromojenik nitrosefin diski (Cefinase, Becton Dickinson BBL, ABD) ile araştırıldı.

Moleküler Testler

Defibrine %5'lik koyun kanı ile zenginleştirilmiş Colombia agarın (Oxoid, İngiltere) bir gecelik inkübasyonu sonrasında oluşan kolonilerden alınan bir öze dolusu bakteri, DNA ekstraksiyonu için 1 ml steril distile su içinde süspanse edildi. Bakteri süspansiyonları, beş dakika kaynatıldı ve santrifüj edildi. DNA amplifikasyonu yapılıncaya kadar süpernatanlar -20°C'de saklandı.

Enterokok izolatlarının esp, asa1 ve hyl virülans genlerinin amplifikasyonu, ısı döngü cihazı (TP 600 Takara, Japonya) kullanılarak gerçekleştirildi. esp gen bölgesinin [954 baz çifti (bç)] amplifikasyonu, Shankar ve arkadaşlarının12 tarif ettiği şekilde esp11 (5'-TTGCTAATGCTAGTCCACGACC-3') ve esp12 (5'-GCGTCAACACTTGCATTGCCGAA-3') primerleri kullanılarak; asa1 (375 bç) ve hyl (276 bç) genlerinin amplifikasyonu ise Vankerckhoven ve arkadaşlarının3 tarif ettiği multipleks polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile sırasıyla asa11 (5'-GCACGCTATTACGAACTATGA-3')/asa12 (5'-TAAGAAAGAACATCACCACGA-3') ve hyln1 (5'-ACAGAAGAGCTGCAGGAAATG-3')/hyln2 (5'-GACTGACGTCCAAGTTTCCAA-3') primerleri kullanılarak yapıldı. vanA geni (732 bç), vanA1 (5'GGGAAAACGACAATTGC3') ve vanA2 (5'-GTACAATGCGGCCGTTA-3'); vanB geni (1145 bç) ise vanB (5'-GTGCTGCGAGATACCACAGA-3') ve vanBrev (5'-CGAACACCATGCAACATTTC-3') primerleri kullanılarak araştırıldı11. vanA ve vanB genleri için PCR, 94°C'de 5 dakika başlangıç denatürasyonunu takiben 94°C'de 1 dakika denatürasyon, 54°C'de 1 dakika bağlanma, 72°C'de 1 dakika uzama döngülerinin 30 kez tekrarlanmasıyla ve 72°C'de 10 dakika son bir uzama döngüsü şeklinde gerçekleştirildi.

Amplifikasyon sonrası PCR ürünlerinin 12 µl'si alınarak 5 µl jel yükleme tamponuyla karıştırıldı ve %1.5'lik jel içerisine yüklenerek 90 V akım altında 45 dakika süreyle elektroforez uygulandı. Moleküler belirteç olarak 100 bç'lik DNA (Biomatik Corp., Kanada) kullanıldı (Şekil 1A).


Şekil 1

Fenotipik Testler

Suşlar, %5 defibrine taze insan kanı eklenmiş Colombia kanlı agar (Oxoid, İngiltere) plaklarına ekildi. Suşlardaki hemolizin varlığı, plaklar 37°C'de, 48 saat inkübe edildikten sonra kolonilerin etrafında beta-hemolitik reaksiyon oluşumu ile belirlendi (Şekil 1B). Jelatinaz aktivitesi ise %1.5 "skim milk" ile zenginleştirilmiş triptik soy agarda (Oxoid, İngiltere) üreyen koloniler etrafında berrak bir halo görülmesi ile saptandı (Şekil 1C).

Kalite Kontrol

Aynı hastaya ait farklı idrar örneklerinden izole edilmiş benzer antibiyotik duyarlılık paterni gösteren enterokok suşları değerlendirmeye alınmadı. Kalite kontrol amacıyla Staphylococcus aureus ATCC 25923 ve E.faecalis ATCC 29212 standart suşları kullanıldı.

İstatistiksel Analiz

Bu çalışmada E.gallinarum izolatı, tek olarak izole edildiğinden istatistiksel analizlere dahil edilmedi. İstatistiksel analiz, SPSS for Windows Version 17.0 (SPSS Inc., ABD) kullanılarak yapıldı. Direnç oranları ve virülans faktörlerinin dağılımı, ki kare ve Fisher kesin testi ile karşılaştırıldı ve p< 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

BULGULAR

Çalışmaya alınan 91 üriner enterokok izolatının 59 (%64.8)'u E.faecalis, 31 (%34.1)'i E.faecium ve 1 (%1.1)'i E.gallinarum olarak tanımlanmıştır. E.faecalis ve E.faecium izolatlarının test edilen antibiyotiklere direnç durumları Tablo I'de sunulmuştur. Çalışmamızda linezolide dirençli suş saptanmamış ve enterokok türleri arasında fosfomisin direnci bakımından istatistiksel bir farklılık tespit edilmemiştir. Tetrasiklin, minosiklin, doksisiklin ve streptogramin dışında test edilen antibiyotiklere E.faecium izolatlarının E.faecalis izolatlarına göre daha dirençli (p< 0.001-0.013), bu dört antibiyotiğe ise daha duyarlı (p< 0.001) oldukları saptanmıştır. İzolatların hiçbirisinde beta-laktamaz üretimi saptanmamıştır.


Tablo I

Sekiz (%25.8) E.faecium suşunun fenotipik olarak hem vankomisin hem de teikoplanine dirençli olduğu saptanmış; moleküler çalışma sonunda yedisinin vanA, birinin ise vanA-vanB dışı direnç tipinde olduğu belirlenmiştir. Glikopeptidlere dirençli E.faecium izolatlarının tamamının penisilin G, ampisilin, siprofloksasin, levofloksasin, rifampin, yüksek düzey streptomisin (YDS) ve yüksek düzey gentamisin (YDG)'e dirençli; linezolid ve streptogramine ise duyarlı oldukları saptanmıştır. İzole edilen 59 E.faecalis suşunun ise tamamının vankomisine ve teikoplanine duyarlı olduğu tespit edilmiştir.

E.faecium izolatlarında YDG ve YDS direnci sırasıyla %74.2 ve %61.3 iken, E.faecalis izolatlarında %22 ve %27.1 olarak belirlenmiştir. Hem YDG hem de YDS direnci gösteren izolatların oranı, E.faecium ve E.faecalis izolatları içinde sırasıyla %54.8 (17/31) ve %13.6 (8/59) olarak saptanmıştır.

İzole edilen tek E.gallinarum suşunun ampisilin, tetrasiklin, doksisiklin, minosiklin, fosfomisin, vankomisin, teikoplanin, YDS, linezolid ve streptogramine duyarlı; penisilin G, rifampin, nitrofurantoin, YDG, siprofloksasin, norfloksasin ve levofloksasine ise dirençli olduğu tespit edilmiştir. Bu tek E.gallinarum izolatının araştırılan hiçbir virülans faktörünü içermediği tespit edilmiş, diğer izolatlarda virülans faktörlerinin dağılımı ise Tablo II'de verilmiştir. AF ve ESP, sırasıyla %26.7 ve %25.6 pozitiflik oranları ile en sık saptanan virülans faktörleri olmuştur. İstatistiksel analizde, E.faecalis izolatlarında esp (p= 0.003) ve asa1 (p< 0.001) gen pozitifliğinin yanı sıra hemolizin üretimi (p= 0.014) ve jelatinaz aktivitesi (p= 0.029), E.faecium izolatlarında ise hyl gen pozitifliği (p< 0.001) anlamlı düzeyde yüksek bulunmuştur. İncelenen virülans faktörlerinden tümünü veya dördünü içeren herhangi bir enterokok izolatı saptanmamıştır. İzolatlardan 5 (%5.6)'inin üçer, 16 (%17.8)'sının ikişer ve 37 (%41.1)'sinin sadece birer virülans faktörü içerdiği, 32 (%35.6)'sinin ise herhangi bir virülans faktörü içermediği izlenmiştir.


Tablo II

İzolatların antibiyotiklere direnç durumları ile içerdikleri virülans faktörleri arasındaki istatistiksel ilişki, E.faecalis için Tablo III, E.faecium için ise Tablo IV'de sunulmuştur. Antibiyotiklere orta duyarlı olarak saptanan suşların düşük sayıda olmaları nedeniyle Tablo III ve IV'ün istatistiksel analizinde duyarlı suşlarla birlikte değerlendirilmiştir. Çalışmamızda, asa1 geni pozitif E.faecalis izolatlarının siprofloksasin (p= 0.001), norfloksasin (p= 0.006) ve levofloksasine (p= 0.001); esp geni pozitif E.faecalis izolatlarının doksisikline (p= 0.043) söz konusu genleri içermeyen izolatlara göre anlamlı düzeyde daha dirençli oldukları saptanmıştır. Aynı şekilde hyl geni pozitif E.faecium izolatlarında nitrofurantoin (p= 0.011) direncinin, hyl geni negatif olanlara göre anlamlı düzeyde yüksek bulunduğu tespit edilmiştir. Geri kalan enterokok türlerinin diğer antibiyotiklere dirençlilik durumları ile içerdikleri virülans faktörleri arasında istatistiksel bir ilişki (p> 0.05) kurulamamıştır.


Tablo III


Tablo IV

TARTIŞMA

İnsan enterokok enfeksiyonlarının baskın türü E.faecalis olup, klinik enfeksiyonların yaklaşık %75-90'ından sorumlu tutulmakta; geri kalanın çoğunluğunu ise E.faecium oluşturmaktadır2,4,5,8,10,12,19. Hareketli enterokokların (E.gallinarum, E.casseliflavus) izolasyon oranları ise oldukça düşüktür (< %2)2. Çalışmamızda izole edilen enterokokların %64.8'ini E.faecalis, %34.1'ini E.faecium ve %1.1'ini E.gallinarum oluşturmuştur. Antibiyotiklere E.faecalis'ten daha dirençli olan E.faecium'un hastanemizde yüksek oranda izole edilmiş olması, uygun enfeksiyon kontrol önlemlerinin alınabilmesi için enterokokların tür düzeyinde tanımlanması gerekliliğini ortaya koymaktadır.

Klasik bir virülans faktörü olmamasına rağmen, enterokokların çoklu antimikrobiyal ajanlara geliştirdiği direnç, hayatta kalmalarını ve çoğalmalarını kolaylaştırır2. Enterokok türlerinin, antibiyotikleri hücre içine alabilmeleri için gerekli olan enerjiyi üretecek sitokrom enzimlerine sahip olmamaları, aminoglikozidlerin düşük konsantrasyonlarına doğal direnç göstermelerine neden olur10. Çalışmamızda, tetrasiklin, minosiklin, doksisiklin ve streptogramin dışında test edilen antibiyotiklere E.faecium izolatlarının E.faecalis izolatlarına göre daha dirençli (p< 0.001-0.013), bu dört antibiyotiğe ise daha duyarlı (p<0.001) oldukları saptanmıştır (Tablo I). Fosfomisine direnç bakımından türler arasında istatistiksel bir farklılık saptanmamıştır. İzolatlarımızın hiçbirisi, olasılıkla yeni ruhsat alması ve sınırlı kullanılmaları nedeniyle linezolide dirençli bulunmamıştır. E.faecium suşlarının, ampisilin (%77.4), penisilin (%96.8) ve vankomisinin (%25.8) yanı sıra yüksek düzey gentamisin (%74.2) ve yüksek düzey streptomisine (%61.3) değişik oranlarda dirençli oldukları saptanmıştır. Beta-laktam ve glikopeptidler gibi hücre duvarına etkili antibiyotiklere karşı gelişen direncin sıklıkla yüksek düzey aminoglikozid direnci ile birlikte bulunması, aralarındaki sinerjik etkinin kaybolmasına ve sonuçta ciddi enterokok enfeksiyonlarında tedavi seçeneklerinin azalmasına neden olmaktadır4,9. Bu bakımından sözkonusu direnç oranlarımız uyarı niteliğindedir. Mato ve arkadaşlarının19 ampisiline dirençli 97 izolatın hiçbirisinde beta-laktamaz üretimi saptamamalarına benzer olarak, çalışmamızda incelenen 91 enterokok suşunun hiçbirisinde beta-laktamaz üretimi tespit edilmemiştir.

Nozokomiyal enfeksiyonların önemli etkenlerinden olan glikopeptidlere dirençli enterokoklar, özellikle de E.faecium suşları, tedavide etkin antibiyotiklerin çoğuna sıklıkla dirençli olup morbidite ve mortalite artışına yol açmaktadır3,16. Çalışmamızda fenotipik olarak hem vankomisin hem de teikoplanine dirençli toplam 8 (%25.8) E.faecium suşu bulunmasına rağmen, bunlardan yedisinin vanA genine sahip olduğu, ancak birisinin tanımlanmış vanA veya vanB direnç genlerine sahip olmadığı gözlenmiştir. Ayrıca bu sekiz vankomisin/teikoplanin dirençli suşun aynı zamanda siprofloksasin, ampisilin, penisilin G ve rifampinin yanı sıra aminoglikozidlere de yüksek düzey direnç geliştirdikleri tespit edilmiştir. Bu durum, glikopeptid dirençli enterokok suşlarının oluşturduğu enfeksiyonların ampirik tedavilerinin büyük olasılıkla yetersiz kalacağını göstermektedir. Glikopeptidlere dirençli sekiz suşun tamamının linezolid ve streptogramine duyarlı oldukları saptanmıştır.

Nozokomiyal enterokok enfeksiyonlarının gelişiminde iki basamaklı bir süreçten söz edilmektedir. Yatan hastalarda, öncelikle antibiyotik direnci olan ve çeşitli virülans faktörlerini barındıran hastane kaynaklı enterokoklar ile asemptomatik gastrointestinal kolonizasyon gelişmekte; daha sonra enterik floranın antibiyotiklerle baskılanması sonucu söz konusu dirençli suşlar, hastaların gastrointestinal sisteminde yaygınlaşmaktadır. Bir grup hastada, doğrudan ya da dolaylı olarak doku invazyonu ile sistemik yayılım gelişebilmektedir. Bu süreçlerde virülans faktörlerinin işlev gördükleri sanılmaktadır2. Sonuçta enterokok enfeksiyonlarının gelişiminde, adezyon, translokasyon ve bağışıklık sisteminden kaçışı içeren çeşitli virülans özellikleri etkin olmaktadır4. Çalışmamızda, üriner E.faecalis izolatlarının %40.7'sinde asa1, %35.6'sında esp ve %1.7'sinde hyl geni pozitifliği saptanmış; %22'sinin jelatinaz ve %16.9'unun hemolizin ürettiği belirlenmiştir (Tablo II). E.faecium klinik izolatları dikkate alındığında ise; hyl ve esp gen pozitifliği sırasıyla %38.7 ve %6.5 olarak bulunmuş; suşların %3.2'sinde jelatinaz aktivitesi saptanmış; asa1 gen pozitifliği ve hemolizin üretimi tespit edilmemiştir (Tablo II). Çalışmamızda asa1 (p< 0.001) ve esp (p= 0.003) gen pozitifliğinin yanı sıra jelatinaz aktivitesi (p= 0.029) ve hemolizin üretimi (p= 0.014) E.faecalis izolatlarında, hyl geni pozitifliği (p< 0.001) ise E.faecium izolatlarında anlamlı düzeyde yüksek bulunmuştur. Bu durum, diğer çalışmalar ile paralellik göstermektedir7,8,9,19.

Guzman ve arkadaşları20 ÜSE'li hastalardan izole edilen E.faecalis'lerin in vitro ortamda üriner sistem epitel hücrelerine yapıştığını göstermişler ve bu yapışmadan bakteri hücre duvarında bulunan AF gibi karbonhidrat antijenlerinin sorumlu olduğunu ileri sürmüşlerdir. Çalışmamızda asa1 gen pozitifliği E.faecium izolatlarında saptanmazken, E.faecalis izolatlarında %40.7 gibi yüksek bir oranda bulunmuştur. Bu durum asa1'in E.faecalis için önemli bir virülans faktörü olduğunu düşündürmekte, yapılan diğer çalışmalar da bu görüşü desteklemektedir7,9,21,22.

Hallgren ve arkadaşları7, esp geni pozitifliğini E.faecium izolatlarında %71 (15/21), E.faecalis izolatlarında %73 (69/94) olarak bildirmişler; Jankoska ve arkadaşları23 da, ESP'nin E.faecalis suşlarında en sık (38/50; %76) saptanan virülans faktörü olduğunu ifade etmişlerdir. Çalışmamızda esp geni pozitifliği E.faecalis ve E.faecium suşlarında sırasıyla %35.6 ve %6.5 olarak tespit edilmiştir. E.faecalis izolatlarında saptadığımız oran, esp geni varlığını %26.5-60 arasında belirleyen çalışmalar8,9,24,25 ile uyumlu iken; E.faecium izolatlarında bulduğumuz oran, esp geni varlığını %21-58 arasında bildiren diğer bazı çalışmalara8,9,24 göre düşüktür. Ancak literatürde klinik E.faecium izolatlarında esp genini saptamayan bir çalışma12 da mevcuttur. Sonuçta, gerek enfeksiyonlardan gerekse çevreden ve sağlıklı insanların florasından izole edilen E.faecalis suşlarında esp geni varlığı, yaygın görülen bir özellik olarak karşımıza çıkmaktadır6,9,21,22,24,26.

Çalışmamızda E.faecalis suşlarında saptadığımız %1.7'lik hyl gen pozitifliği oranına göre E.faecium suşlarında tespit ettiğimiz %38.7'lik yüksek oran dikkat çekmektedir. E.faecium suşlarında hyl gen sıklığının Avrupa'da %3-71 oranları arasında değiştiği belirtilmektedir3,16,26.

Yapılan çalışmalarda, E.faecalis suşlarında hemolizin gen pozitifliği ve beta-hemolitik etkinlik sırasıyla %13 ve %26 olarak bildirilirken, E.faecium izolatlarında bu özelliğe rastlanmadığı belirtilmektedir7,22. Çalışmamızda E.faecalis suşlarında saptadığımız %16.9'luk hemolizin üretimi, diğer çalışmalarda9,22,27 elde edilen veriler ile (%11-33) uyumludur. E.faecium izolatlarımızın hiçbirisinde hemolizin üretiminin tespit edilmemiş olması da, diğer çalışmalar7,9,22 ile benzerlik göstermektedir. Çoğu sitolitik suş, aynı zamanda AF de üretmektedir; dolayısıyla büyük olasılıkla bu iki virülans faktörü, sinerjik olarak davranmaktadır2. E.faecalis izolatlarımızdaki asa1 geni pozitifliği %40.7 bulunurken, hemolizin üretimi bulunan 10 E.faecalis izolatımızın dokuzunun asa1 geni içermesi (%90), bu görüşü destekler niteliktedir.

Kommensal E.faecium suşları ile kıyaslandığında klinik izolatlarda gelE gen pozitifliğinin belirgin olarak daha sık saptandığını bildiren çalışmaların6,25 yanı sıra, sebze kaynaklı E.faecium izolatlarının %45.5'inde, su kaynaklı izolatların %33.3'ünde gelE geninin bulunduğunu, klinik örneklerden izole edilen izolatların ise hiçbirisinde gelE geni saptanmadığını ileri süren bir çalışma22 da bulunmaktadır. Bir çalışmada3 ise, gelE geninin 12 E.faecalis endokardit suşunun tamamında (%100), 19 dışkı suşunun ise ancak 10'unda (%52.6) saptanmış olması, virülans ve hastalıkta jelatinazın önemini göstermekte ve biyofilm oluşumunda etkin olabileceğini düşündürmektedir. Klibi ve arkadaşları9, jelatinaz aktivitesini E.faecalis izolatlarının %65 (22/36)'inde saptarken, 12 E.faecium izolatının hiçbirisinde tespit edememişlerdir. Çalışmamızda E.faecalis izolatlarında saptanan %22'lik jelatinaz aktivitesinin E.faecium izolatlarında düşük olması (%3.2), diğer çalışmalardaki8,9,14,16,17,21 veriler ile uyumludur.

AF ve ESP gibi virülans faktörlerinin, konjugasyon sırasında verici ve alıcı bakteriler arasında virülans ve antibiyotik direnç genlerini içeren konjugatif plazmidlerin transferini kolaylaştırdıkları düşünülmekte, esp ve asa1 gen pozitifliği ile plazmidlerle kazanılan antimikrobiyal direnç arasındaki bir ilişkiden kuşkulanılmaktadır3,7,9,10,13,14,15. Sekiz Avrupa ülkesindeki 13 farklı hastanede yatan hastaların çeşitli klinik örneklerinden izole edilen 135'i vankomisine dirençli toplam 271 E.faecium izolatı ile yapılan bir çalışmada, multipleks PCR yöntemi ile esp pozitifliği %65, hyl pozitifliği ise %17 oranında saptanmış; asa1, gelE ve cylA genleri tespit edilememiştir3. Söz konusu çalışmada, esp gen pozitifliği ile vankomisin direnci (duyarlı suşların %53'ünde, dirençli suşların %77'sinde) arasında anlamlı bir ilişkinin bulunduğu belirlenmiştir3. Klibi ve arkadaşları9, esp gen pozitifliği ile gentamisin direnci arasında; Billström ve arkadaşları14 da esp gen pozitifliği ile ampisilin, siprofloksasin ve imipenem direnci arasında bir ilişkiden bahsetmişler, Vergis ve arkadaşları13 ise jelatinaz aktivitesi ile yüksek düzey gentamisin direnci arasında anlamlı bir ilişki tespit etmişlerdir.

Enterokokların antibiyotik direnci ile virülans faktörleri arasındaki ilişki, ülkeden ülkeye değişmektedir. Örneğin; Vankerckhoven ve arkadaşları3, esp gen pozitifliğini İtalya'da izole edilmiş vankomisine duyarlı (VS) suşların %68'inde, vankomisine dirençli (VR) suşların %91'inde (p< 0.05) saptamışlar; hyl gen pozitifliğini ise İngiltere'de izole edilmiş VS suşların %29'unda ve VR suşların %71'inde (p< 0.05) tespit etmişlerdir. Ancak aynı çalışmada3, Avusturya, Belçika, Fransa, Yunanistan, İspanya ve Hollanda'dan toplanan 11'i vankomisine dirençli 114 E.faecalis suşunda esp (%45) ve hyl (%17) gen pozitifliklerinin, İtalya ve İngiltere izolatlarından farklı olarak VS suşlarda (sırasıyla %48 ve %18), VR suşlara göre (sırasıyla %18 ve %9) daha yüksek bulunduğu açıklanmıştır. Literatürde VS E.faecium suşlarının dirençli suşlardan daha fazla esp geni içerdiğini vurgulayan başka çalışmalar8,28,29 olduğu gibi, eşit düzeyde bulunduğunu ileri süren çalışmalar da26,30 mevcuttur.

Bazı çalışmalarda esp ve hyl gen sıklığının, hem ampisilin hem de vankomisine dirençli (AR-VR) E.faecium suşlarında, ampisiline duyarlı vankomisine dirençli (AS-VR) suşlardan daha fazla görüldüğü vurgulanmıştır3,28,29. Vankerckhoven ve arkadaşları3, esp gen pozitifliğini AS-VR suşların %42'sinde, AR-VR suşların ise %85'inde (p< 0.05) tespit etmişlerdir. Aynı çalışmada3 hyl gen pozitifliği, AS-VR suşların %2'sinde ve AR-VR suşların %15'inde (p< 0.05) saptanmıştır. Çalışmamızda izole edilen vankomisine dirençli sekiz E.faecium suşunun tamamı ampisiline dirençli bulunduğundan bu özellik incelenememiştir. Bulgularımız, asa1 geni pozitif E.faecalis izolatlarının siprofloksasin (p= 0.001), norfloksasin (p= 0.006) ve levofloksasine (p= 0.001); esp geni pozitif E.faecalis izolatlarının doksisikline (p= 0.043); hyl geni pozitif E.faecium izolatlarının ise nitrofurantoine (p= 0.011), söz konusu genleri taşımayan izolatlara göre anlamlı düzeyde daha dirençli olduklarını ortaya koymuştur. Çalışmamız kapsamında yer alan enterokok suşlarının, diğer antibiyotiklere dirençlilik durumları ile içerdikleri virülans faktörleri arasında istatistiksel bir ilişki (p> 0.05) tespit edilememiştir.

Sonuç olarak, virülans faktörlerinin yaygınlığı ve antibiyotik direnci ile ilişkilerinin, çalışılan örneklerin kaynağına (klinik, fekal veya çevresel), enterokokların tür dağılımına ve çalışmanın yapıldığı ülkelere göre değişkenlik gösterdiği anlaşılmaktadır3,9,13,14. Bu çalışma, araştırmalarımıza göre üriner enterokok izolatlarının antibiyotiklere direnç durumları ile virülans faktörleri arasındaki ilişkisinin incelendiği ülkemizdeki hasta kaynaklı ilk çalışmadır. Enterokok türlerinin nozokomiyal patojen olarak artan önemi ve özellikle glikopeptidler olmak üzere antibiyotiklere direncin artan sıklığı göz önüne alındığında, enterokokların invazifliği ve hastalığın şiddeti ile ilişkili virülans faktörlerin tanımlanması ve bu virülans faktörlerinin antibiyotiklerle ilişkilerinin ortaya konması, gelecek araştırmaların önemli konusu olacaktır.

KAYNAKLAR

  1. Seno Y, Kariyama R, Mitsuhata R, Monden K, Kumon H. Clinical implications of biofilm formation by Enterococcus faecalis in the urinary tract. Acta Med Okayama 2005; 59(3): 79-87. [Özet] [PDF]
  2. Sood S, Malhotra M, Das BK, Kapil A. Enterococcal infections & antimicrobial resistance. Indian J Med Res 2008; 128(2): 111-21. [Özet] [PDF]
  3. Vankerckhoven V, Van Autgaerden T, Vael C, et al. Development of a multiplex PCR for the detection of asa1, gelE, cylA, esp, and hyl genes in enterococci and survey for virulence determinants among European hospital isolates of Enterococcus faecium. J Clin Microbiol 2004; 42(10): 4473-9. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  4. Vankerckhoven V, Huys G, Vancanneyt M, et al. Genotypic diversity, antimicrobial resistance, and virulence factors of human isolates and probiotic cultures constituting two intraspecific groups of Enterococcus faecium isolates. Appl Environ Microbiol 2008; 74(14): 4247-55. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  5. Mohamed JA, Huang DB. Biofilm formation by enterococci. J Med Microbiol 2007; 56(12): 1581-8. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  6. Creti R, Imperi M, Bertuccini L, et al. Survey for virulence determinants among Enterococcus faecalis isolated from different sources. J Med Microbiol 2004; 53(1): 13-20. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  7. Hallgren A, Claesson C, Saeedi B, Monstein HJ, Hanberger H, Nilsson LE. Molecular detection of aggregation substance, enterococcal surface protein, and cytolysin genes and in vitro adhesion to urinary catheters of Enterococcus faecalis and E.faecium of clinical origin. Int J Med Microbiol 2009; 299(5): 323-32. [Özet]
  8. Dupre I, Zanetti S, Schito AM, Fadda G, Sechi LA. Incidence of virulence determinants in clinical Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis isolates collected in Sardinia (Italy). J Med Microbiol 2003; 52(6): 491-8. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  9. Klibi N, Ben Slama K, Saenz Y, et al. Detection of virulence factors in high-level gentamicin-resistant Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium isolates from a Tunisian hospital. Can J Microbiol 2007; 53(3): 372-9. [Özet]
  10. Fisher K, Phillips C. The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus. Microbiology 2009; 155(6): 1749-57. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  11. Ozmen Toğay S, Celebi Keskin A, Açık L, Temiz A. Virulence genes, antibiotic resistance and plasmid profiles of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium from naturally fermented Turkish foods. J Appl Microbiol 2010; 109(3): 1084-92. [Özet]
  12. Shankar V, Baghdayan AS, Huycke MM, Lindahl G, Gilmore MS. Infection-derived Enterococcus faecalis strains are enriched in esp, a gene encoding a novel surface protein. Infect Immun 1999; 67(1): 193-200. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  13. Vergis EN, Shankar N, Chow JW, et al. Association between the presence of enterococcal virulence factors gelatinase, hemolysin, and enterococcal surface protein and mortality among patients with bacteremia due to Enterococcus faecalis. Clin Infect Dis 2002; 35(5): 570-5. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  14. Billström H, Lund B, Sullivan A, Nord CE. Virulence and antimicrobial resistance in clinical Enterococcus faecium. Int J Antimicrob Agents 2008; 32(5): 374-7. [Özet]
  15. Shankar N, Lockatell CV, Baghdayan AS, Drachenberg C, Gilmore MS, Johnson DE. Role of Enterococcus faecalis surface protein Esp in the pathogenesis of ascending urinary tract infection. Infect Immun 2001; 69(7): 4366-72. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  16. Worth LJ, Slavin MA, Vankerckhoven V, Goossens H, Grabsch EA, Thursky KA. Virulence determinants in vancomycin-resistant Enterococcus faecium vanB: clonal distribution, prevalence and significance of esp and hyl in Australian patients with haematological disorders. J Hosp Infect 2008; 68(2): 137-44. [Özet]
  17. Coque TM, Patterson JE, Steckelberg JM, Murray BE. Incidence of hemolysin, gelatinase, and aggregation substance among enterococci isolated from patients with endocarditis and other infections and from feces of hospitalized and community-based persons. J Infect Dis 1995; 171(5): 1223-9. [Özet]
  18. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 18th Informational Supplement, 2009. CLSI Document M100-S19. CLSI, Wayne, PA.
  19. Mato R, Almeida F, Pires R, Rodrigues P, Ferreira T, Santos-Sanches I. Assessment of high-level gentamicin and glycopeptide-resistant Enterococcus faecalis and E.faecium clonal structure in a Portuguese hospital over a 3-year period. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009; 28(7): 855-9. [Özet]
  20. Guzman CA, Pruzzo C, Plate M, Guardati MC, Calegari L. Serum dependent expression of Enterococcus faecalis adhesins involved in the colonization of heart cells. Microb Pathog 1991; 11(6): 399-409. [Özet]
  21. Eaton TJ, Gasson MJ. Molecular screening of Enterococcus virulence determinants and potential for genetic exchange between food and medical isolates. Appl Environ Microbiol 2001; 67(4): 1628-35. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  22. Abriouel H, Omar NB, Molinos AC, et al. Comparative analysis of genetic diversity and incidence of virulence factors and antibiotic resistance among enterococcal populations from raw fruit and vegetable foods, water and soil, and clinical samples. Int J Food Microbiol 2008; 123(1-2): 38-49. [Özet]
  23. Jankoska G, Trajkovska-Dokic E, Panovski N, Popovska-Jovanovska K, Petrovska M. Virulence factors and antibiotic resistance in Enterococcus faecalis isolated from urine samples. Prilozi 2008; 29(1): 57-66. [Özet]
  24. Di Rosa R, Creti R, Venditti M, et al. Relationship between biofilm formation, the enterococcal surface protein (Esp) and gelatinase in clinical isolates of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium. FEMS Microbiol Lett 2006; 256(1): 145-50. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  25. Waar K, Muscholl-Silberhorn AB, Willems RJ, Slooff MJ, Harmsen HJ, Degener JE. Genogrouping and incidence of virulence factors of Enterococcus faecalis in liver transplant patients differ from blood culture and fecal isolates. J Infect Dis 2002; 185(5): 1121-7. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  26. Rice LB, Carias L, Rudin S, et al. A potential virulence gene, hylEfm, predominates in Enterococcus faecium of clinical origin. J Infect Dis 2003; 187(3): 508-12. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  27. Huycke MM, Spiegel CA, Gilmore MS. Bacteremia caused by hemolytic, high-level gentamicin-resistant Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother 1991; 35(8): 1626-34. [Özet] [PDF]
  28. Leavis HL, Willems RJ, Top J, et al. Epidemic and non-epidemic multidrug-resistant Enterococcus faecium. Emerg Infect Dis 2003; 9(9): 1108-15. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  29. Coque TM, Willems R, Canton R, Del Campo R, Baquero F. High occurence of esp among ampicillin-resistant and vancomycin-susceptible Enterococcus faecium clones from hospitalized patients. J Antimicrob Chemother 2002; 50(6): 1035-8. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  30. Woodford N, Soltani M, Hardy KJ. Frequency of esp in Enterococcus faecium isolates. Lancet 2001; 358(9281): 584.

İletişim (Correspondence):

Doç. Dr. Orhan Baylan,

Gülhane Askeri Tıp Akademisi,

Haydarpaşa Eğitim Hastanesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Servisi,

34668 Üsküdar, İstanbul, Türkiye.

Tel (Phone): +90 216 542 2700,

E-posta (E-mail): dr_obaylan@yahoo.com

Yazdır