Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2016; 50(3): 382-391

Gıda K�kenli Patojen Olmayan ve Patojenik Salmonella enterica Suşlarının
Antit�m�rijenik Etkilerinin MEF, DU145 ve HeLa H�cre K�lt�rlerinde İncelenmesi*

Investigation of Antitumorigenic Effects of Food-Borne Non-Pathogenic and
Pathogenic Salmonella enterica Strains on MEF, DU145 and HeLa Cell Lines

Gamze ALTINTAŞ KAZAR1, Ece ŞEN2,3

1 Trakya �niversitesi Fen Fak�ltesi, Biyoloji B�l�m�, Molek�ler Biyoloji Anabilim Dalı, Edirne.

1 Trakya University Faculty of Sciences, Department of Biology, Molecular Biology Section, Edirne, Turkey.

2 Trakya �niversitesi Fen Fak�ltesi, Biyoloji B�l�m�, Temel ve End�striyel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Edirne.

2 Trakya University Faculty of Sciences, Department of Biology, Basic and Industrial Microbiology Section, Edirne, Turkey.

3 Trakya �niversitesi Fen Bilimleri Enstit�s�, Biyoteknoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Edirne.

3 Trakya University, Institute of Natural Sciences, Biotechnology and Genetics Department, Edirne, Turkey.

* Bu �alışma, Trakya �niversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi (T�BAP) tarafından 2014-65 numaralı proje ile maddi olarak desteklenmiştir. Ayrıca ilk yazar TÜBİTAK 2211-A Yurt İçi Doktora Burs Programı kapsamında desteklenmiştir.

�Z

Kanser tedavisinde kullanılan temel uygulamalar, t�m kanser h�crelerinin yok edilmesinde� başarısız olabilir; sağlıklı h�crelere karşı toksisite g�sterebilir ve anti-t�m�r ila�lara karşı gelişen diren� metastaza yatkınlığı artırabilir. Bakteriyel terapilerin avantajı, se�ici toksisite, dış sinyallere yanıt verebilme ve mikro�evreye duyarlılık sayesinde t�m�rlerin se�ici bir şekilde yok edilmesidir. Kanser tedavisinde sıklıkla araştırılan bakteriler Salmonella t�rleri ve �zellikle de S.Typhimurium'dur. Bu �alışmanın amacı, gıda k�kenli patojen olan ve olmayan Salmonella enterica suşlarının, �eşitli h�cre k�lt�rleri �zerindeki antit�m�rijenik etkilerinin araştırılmasıdır. �alışmada, Edirne ilinde satışa sunulan tavuk karkaslarından izole edilen patojen olmayan Salmonella Enteriditis (A17) ve patojenik Salmonella Telaviv (A22) suşları ile standart Salmonella Typhimurium ATCC 14028 suşu kullanılmıştır. ATCC k�kenli MEF (fare embriyonik fibroblast), DU145 (insan prostat kanseri) ve HeLa (insan servikal kanseri) h�cre k�lt�rleri, Salmonella suşları ile, MOI [Multiplicity of infection; Enfeksiyon �arpanı (bakteri sayısı:h�cre sayısı)]� 1000:1, 100:1, 10:1, 1:1, 0.1:1 oranlarında kok�lt�ve edilmiş; h�cre canlılıkları kolorimetrik MTT sitotoksisite testi ile �l��lm�ş; apoptoza giren h�cre y�zdeleri "Tali� Apoptosis Kit - Annexin V Alexa Fluor� 488" kiti (Invitrogen, Molecular Probes, Life Technologies, ABD) ile değerlendirilmiş ve kaspaz-3 aktiviteleri, kolorimetrik proteaz ApoTarget� Kit (Invitrogen, BioSource International, ABD) ile belirlenmiştir. �alışmada, patojen olmayan S.Enteriditis (A17) suşunun h�cre canlılığını, h�cre k�lt�rleri i�in ortalama %70 civarına d�ş�r�rken, patojenik olan S.Telaviv (A22) ve standart S.Typhimurium ATCC 14028 suşlarının ortalama %80'e kadar d�ş�rebildiği g�sterilmiştir. Bu bulgunun aksine, patojenik S.Telaviv (A22) suşunun, patojen olmayan S.Enteriditis (A17) ve S.Typhimurium ATCC 14028 suşlarına g�re apoptozu daha etkili bir bi�imde tetiklediği saptanmıştır. Patojenik S.Telaviv (A22) suşu tarafından ind�klenen apoptoza giren h�cre y�zdesi %15 civarında olurken, patojen olmayan S.Enteriditis (A17) ve S.Typhimurium ATCC 14028 suşları i�in %5 civarında kalmıştır. Benzer şekilde, kaspaz-3 aktivitesini g�steren ortalama OD405 değerleri, patojen olmayan S.Enteriditis (A17) ve S.Typhimurium ATCC 14028 suşları i�in 0.01 civarında kalırken, patojenik S.Telaviv (A22) suşu i�in 0.02'ye yaklaşmış ve kontrol grubuna g�re iki kat artış g�stermiştir. �alışmamızın sonu�ları, gıda k�kenli patojenik S.Telaviv (A22) suşunun kaspaz-3 aktivitesini artırdığını ve apoptozu tetiklediğini g�stermesi ve ayrıca S.Enteriditis (A17) suşunun DU145 (insan prostat kanseri) h�creleri �zerinde se�ici sitotoksisitesi olduğunun belirlenmesi a�ısından �nem taşımaktadır.

Anahtar s�zc�kler: Salmonella; antit�m�r etki; bakteriyel terapi; apoptoz; sitotoksisite.

ABSTRACT

Basic applications in cancer therapy may fail to eradicate cancer cells completely, they can show toxic affects to healthy cells and development of resistance to antitumor agents may increase tendency to metastasis. Bacterial therapies have the advantage of specific targetting of tumors by selective toxicity, responsiveness to external signals, self-propelling capacity, and the sense of microenvironment. The most interest on the bacterial cancer therapy is about Salmonella spp. with a special emphasis of S.Typhimurium. The aim of this study was to investigate the antitumorigenic effects of food-borne non-pathogenic and pathogenic Salmonella enterica strains on different cell cultures. Non-pathogenic Salmonella Enteriditis (A17) and pathogenic Salmonella Telaviv (A22) strains isolated from chicken carcasses which were put on the market in Edirne province (located at Thrace region of Turkey), and Salmonella Typhimurium ATCC 14028 strain were used in the study. ATCC-derived MEF (mouse embryonic fibroblasts), DU145 (human prostate cancer cells), and HeLa (human cervical cancer cells) cell lines were cocultivated with Salmonella strains of MOI (Multiplicity of infection; number of bacteria:number of cell) of 1000:1, 100:1, 10:1, 1:1, 0.1:1. The cell viability was measured by colorimetric MTT cytotoxicity assay, the percentage of apoptosis was assessed by Tali� Apoptosis Assay-Annexin V Alexa Fluor� 488 kit (Invitrogen, Molecular Probes, Life Technologies, USA), and the caspase-3 activity was determined by colorimetric protease ApoTarget� kit (Invitrogen, BioSource International, USA). It was shown that non-pathogenic S.Enteriditis (A17) decreased cell viability approximately to 70%, wheras patogenic S.Telaviv (A22) and standart S.Typhimurium ATCC 14028 strains reduced cell viability approximately to 80%. Adversely, it was also observed that pathogenic S.Telaviv (A22) strain induces apoptosis more effectively than non-pathogenic S.Enteriditis (A17) and S.Typhimurium ATCC 14028 strains. Apoptosis percentage induced by pathogenic S.Telaviv (A22) strain was approximately 15% while 5% for both non-pathogenic S.Enteriditis (A17) and S.Typhimurium ATCC 14028 strains. Similarly, average OD405 values of caspase-3 activity was shown as 0.01 for both non-pathogenic S.Enteriditis (A17) and S.Typhimurium ATCC 14028 strains whereas average OD405 value of caspase-3 activity for pathogenic S.Telaviv (A22) strain was very close to 0.02 and it doubled the value for negative control. Our data are important in terms of the indication of food-borne pathogenic S.Telaviv (A22) strain that enhanced caspase-3 activity and induced apoptosis, and S.Enteriditis (A17) strain that showed selective cytotoxicity on DU145 (human prostate cancer cells).

Keywords: Salmonella; antitumor effect; bacterial therapy; apoptosis; cytotoxicity.

Geliş Tarihi (Received): 10.02.2016 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 24.05.2016

GİRİŞ

Kanser, anormal h�crelerin hızla ortaya �ıkması, sınırlarının dışına yayılması ve yakınlarındaki dokuları istila etmesidir. 14.1 milyon yeni kanser olgusunun bildirildiği 2012 yılında, 8.2 milyon kişi kanser sebebiyle hayatını kaybetmiş ve 32.6 milyon kişi kanser ile m�cadele vermektedir1.� Radyoterapi, kemoterapi ve operasyon gibi geleneksel tedavi y�ntemleri, modern teknikler ve teknolojiler ile hızlı bir bi�imde ilerliyor olsa da, t�m�r h�crelerinin ila�lara diren� kazanması ve metastaza eğilimli hale gelmesi; mikrometastazların tanımlanması ve engellenmesindeki yetersizlik; tedavilerin �oğunun terap�tik indeksinin sınırlı olması, t�m�rleri tam olarak hedefleyememesi ve yetersiz doku penetrasyonu, kanser tedavilerinde başarıyı kısıtlayıcı fakt�rlerdir ve bir�ok kanser tedavisi sağlıklı dokulara da zarar vermektedir2,3.

Kanser tedavisi i�in ideal bir ila�, kanser h�crelerine se�ici olarak sitotoksisite g�stermeli, kanser h�crelerine kendiliğinden y�nlenebilmeli, dış sinyaller tarafından y�nlendirilebilmeli, kanser mikro�evresini algılayabilmeli ve dışarıdan saptanması kolay olmalıdır4,5. Canlı bakteriler, zayıflatılmış bakteriler, genetiği değiştirilmiş bakteriler ve onların �r�nleri olan toksin, protein ve ila� t�revlerinin kanserli h�crelerin �oğalmasını engellemek, kanseri tedavi etmek ya da metastazları �nlemek i�in kullanılmasına "bakteriyel kanser tedavisi" adı verilir6. Salmonella Typhimurium�un t�m�rl� bir fareye sistemik olarak enjeksiyonu ile yapılan bir araştırmada, bakterilerin t�m�r dokusunda diğer sağlıklı organ ve dokulara g�re 10.000 kat daha fazla bulunduğu g�sterilmiştir7. Bu araştırmanın sonucuna g�re bakteriler, kanser h�crelerine se�ici bir bi�imde ulaşabilmekte ve kendilerinden y�nlenebilmektedirler7. Ayrıca bakteriler, kendilerinde bulunan kemotaktik resept�rler sayesinde t�m�r mikro�evresindeki değişimleri sezebilirler ve genetik olarak değiştirilmelerine imkan sağladıkları i�in dış sinyallere duyarlı ve/veya yanıt verebilir hale getirilebilirler8. Bu �zellikleriyle bakteriler, ideal bir kanser tedavi ilacı gibi davranabilirler.

William B. Coley tarafından 1890 yılında fark edilen ve daha sonra Coley'nin toksini adını alan patojenik bakteri enfeksiyonu sonucu t�m�rlerde g�r�len k���lme, bakteriyel kanser tedavisinin temelini oluşturmaktadır9. Yapılan �alışmalarda, bazı Salmonella t�rlerinin ve genetik olarak modifiye edilmiş Salmonella spp. suşlarının, t�m�r gelişimini gerilettiği, metastazı �nlediği ve deney hayvanlarının yaşam s�relerini artırdığı bildirilmektedir10,11,12,13. Bu kapsamda, sunulan �alışmanın amacı, Salmonella Enteritidis (A17), Salmonella Telaviv (A22) ve Salmonella Typhimurium ATCC 14028 suşlarının, �eşitli h�cre k�lt�rleri �zerindeki sitotoksik ve apoptotik etkilerinin araştırılmasıdır.

GERE� ve Y�NTEM

H�cre K�lt�rleri

�alışmamızda, ATCC'den temin edilen ve Trakya �niversitesi (T�) Teknoloji Araştırma ve Geliştirme Uygulama ve Araştırma Merkezi K�lt�r Koleksiyonunda saklanan HeLa (insan servikal kanseri) ve DU145 (insan prostat kanseri) h�cre dizileri ile İstanbul Kültür Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümünden (Do�. Dr. Elif Damla Arısan'ın izniyle) temin edilen, ATCC'ye ait MEF (fare embriyonik fibroblast) h�cre dizileri kullanıldı. T�m h�cre k�lt�rleri, T25 flasklarda, %10 fetal dana serumu (FCS), L-glutamin ve fenol kırmızısı i�eren DMEM-F12 besiyerinde, 37�C'de %5 CO2'li et�vde �oğaltıldı ve idame ettirildi.

Bakteri Suşları

Bakteri suşu olarak, T� Molek�ler Mikrobiyoloji Laboratuvarı K�lt�r Koleksiyonunda saklanan ve daha �nceki �alışmamızda14, Edirne ilinde satışa sunulan tavuk karkaslarından izole edilerek serotiplendirilen apatojenik Salmonella Enteriditis (A17) ve patojenik Salmonella Telaviv (A22) suşları ile standart Salmonella Typhimurium ATCC 14028 suşu kullanıldı. T�m suşlar, LB (Luria-Bertani) besiyerine ekilerek 37�C'de 12 saat ink�basyondan sonra kullanıldı.

H�cre K�lt�rlerinin Bakteriler ile Kok�ltivasyonu

H�cre k�lt�rleri, uygun yoğunluğa ulaştıklarında vasatları d�k�ld�, 10 ml fosfatlı tampon (1xPBS) ile yıkandı ve 3 ml tripsin-EDTA (%0.25 w/v) sol�syonu ile y�zeyden kaldırıldı. H�cre s�spansiyonu 5 dakika 500g'de santrif�j edilerek tripsin uzaklaştırıldı ve 103 h�cre/ml i�erecek şekilde DMEM-F12 besiyeri ile seyreltildi. H�creler, 96 �ukurlu mikroplaklara 200 μl/�ukur (5000 h�cre) olacak şekilde eklendi ve 2 saat 37�C'de %5 CO2 i�eren et�vde ink�be edilerek y�zeye yapışmaları sağlandı. Daha sonra h�crelerin �zerine, MOI [Multiplicity of infection; Enfeksiyon �arpanı (bakteri sayısı:h�cre sayısı)]� 1000:1, 100:1, 10:1, 1:1, 0.1:1 olacak şekilde bakteriler eklendi. Bakteriler ile birlikte 37�C'de %5 CO2'li et�vde 4 saat ink�basyondan sonra, h�crelerin �zerindeki besiyeri uzaklaştırıldı, 200 μl 1xPBS ile 3 kere yıkandı ve �zerlerine %1 penisilin-streptomisin (PS) i�eren DMEM-F12 besiyeri eklendi. 12 saat boyunca ink�be edilen h�creler, MTT sitotoksisite testi ile değerlendirildi. MTT sitotoksisite, apoptoz ve kaspaz-3 aktivite belirlenme analizlerinde MOI 100:1 oranı kullanılarak, kok�lt�r s�resi 4 saat olarak uygulandı.

MTT Sitotoksisite Testi

Sitotoksisitenin saptanmasında, kolorimetrik MTT (3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) indirgenme testi uygulandı. Bu ama�la, MOI 100:1 olan bakteriler ile 96'lı mikroplaklarda 4 saat kok�lt�r� yapılan h�creler kullanıldı.

MTT testi sırasında, bakteriler ile kok�lt�ve edilmemiş h�creler i�eren (MOI= 0) negatif kontrol ve h�cre i�ermeyen boş �rnekler de teste dahil edildi. MTT ��zeltisi 1 mg/ml MTT i�erecek şekilde PBS i�erisinde hazırlandı ve 0.2 μm filtreden s�z�lerek steril edildi. 96'lık plaklarda ink�be edilmiş h�crelerin besiyeri uzaklaştırılıp h�creler PBS ile yıkandıktan sonra� 50 μl MTT ��zeltisi ve 200 μl FCS ve fenol kırmızısı i�ermeyen DMEM eklendi ve nazik�e �alkalandı. H�creler 4 saat boyunca 37�C'de %5 CO2 i�eren karanlık ortamda ink�be edildikten sonra MTT ��zeltisi uzaklaştırılıp kalan kristaller 200 μl DMSO ve 25 μl Sorenson glisin tamponu (glisin 0.1 M, NaCl 0.1 M, 0.1 NaOH ile pH: 10.5) ile ��z�ld�; 5 dakika oda sıcaklığında nazik�e �alkalanan plaklar, spektrofotometrede (Multiskan� GO, Thermo Scientific, ABD) 630 nm referans dalga boyuna karşı 570 nm dalga boyunda okundu15.

H�cre Canlılığı ve Apoptoza Giren H�cre Y�zdelerinin Belirlenmesi

Bu ama�la "Tali� Apoptosis Kit - Annexin V Alexa Fluor� 488" kiti (Invitrogen, Molecular Probes, Life Technologies, ABD) kullanıldı ve deneyler kit prosed�r�ne uygun olarak ger�ekleştirildi. Mikroplaklarda bulunan h�creler 20 μl tripsin-EDTA ile deney ortamından kaldırılıp PBS ile yıkandı ve 105-107 h�cre/ml olacak şekilde seyreltildi. Konsantre (5x) Annexin bağlama tamponu (ABB) deiyonize su ile seyreltilerek 1x ABB hazırlandı ve 100 μl ABB i�erisine yaklaşık 5x105 ile 5x106 h�cre eklendi. H�creler karanlıkta oda ısında 20 dakika boyunca 5 μl "Annexin V Alexa Fluor 488" ile ink�be edildi ve daha sonra 800g'de 2 dakika santrif�j edilerek 100 μl ABB i�erisinde s�spanse edildi. H�crelerin �zerine 1 μl PI (propidium iodide) eklenerek oda sıcaklığı ve karanlıkta 5 dakika ink�be edildi; 25 μl �rnek Tali� h�cresel analiz lamlarına y�klendi ve Tali� g�r�nt� tabanlı sitometrede h�cre sağlığı apoptoz olarak �l��l�p raporlandı.

Kaspaz-3 Aktivitesinin Belirlenmesi

Kaspaz-3 aktivitesi, kolorimetrik proteaz ApoTarget� Kit (Invitrogen, BioSource International, ABD) ile kit prosed�r�ne g�re �l��ld�. Bakteriler ile kok�lt�r� yapılan h�creler tripsin ile kaldırıldı ve 50 μl h�cre lizis tamponunda 3-5x106 h�cre olacak şekilde s�spanse edildi. Buzda 10 dakika bekletilen h�creler 10.000g'de 1 dakika santrif�j edildikten sonra s�pernatan yeni bir t�pe alınarak buz i�erisinde muhafaza edildi. Her 100 μl h�cre lizis tamponu, 100 μg protein lizatı i�erecek şekilde seyreltildi ve her bir h�cre lizatının �zerine 50 μl reaksiyon tamponu [10 μM DTT (dithiothreitol) i�eren] ve 5 μl DEVD-pNA (kaspaz-3 substratı) eklenerek 37�C'de 3 saat ink�be edildi. Her bir �rnek spektrofotometrede (Multiskan� FC, Thermo Scientific, ABD) 405 nm dalga boyunda k�r hesabı yapılarak �l��ld� ve veriler raporlandı.

İstatistiksel Analiz

�alışma verilerinin istatistiksel değerlendirmesi i�in "Prism 6 for Mac OS X version 6.0h (Trial)" programı kullanıldı ve deneylerden elde edilen tekerr�rl� sonu�lara iki y�nl� ANOVA testi = 0.05 olarak uygulandı.�

BULGULAR

�alışmamızda, MTT sitotoksite testi sonucunda belirlenen h�cre canlılık y�zdeleri, her bir Salmonella suşu i�in Şekil 1'de sunulmuştur. Şekilde g�sterilen canlılık y�zdelerine g�re, h�cre k�lt�rlerinde canlılığı en �ok etkileyen MOI oranının 1000:1 olduğu ve 100:1'den 0.1:1'e doğru gidildik�e h�cre canlılığının arttığı g�zlemlenmiştir. S.Telaviv (A22) suşu, 1000:1 MOI oranında t�m h�cre k�lt�rlerinde de canlılığı yaklaşık %60'a d�ş�rerek, �alışmada kullanılan bakteriler arasında h�cre ayrımı yapmadan en y�ksek sitotoksik etkiyi g�stermiştir (Şekil 1c). S.Typhimurium ATCC 14028 ve S.Enteriditis (A17) suşları, MEF h�crelerinin canlılık y�zdesini en az etkileyen suşlar olurken, S.Typhimurium ATCC 14028 suşu DU145 ve HeLa h�cre k�lt�rleri �zerinde benzer sitotoksik etkiler g�stermiştir (Şekil 1b ve 1c). S.Enteriditis (A17) suşunun sitotoksik etkisi ise, sırasıyla en fazla HeLa ve DU 145 h�creleri �zerinde olmuştur (Şekil 1c).


Şekil 1

MEF, DU145 ve HeLa h�cre k�lt�rlerinin Salmonella suşları ile 100:1 MOI oranında 4 saat kok�lt�r� sonucu, MTT sitotoksisite testinde saptanan h�cre canlılığı y�zdeleri Şekil 2'de s�tun grafiği halinde g�sterilmiştir. Herhangi bir bakteri ile kok�lt�ve edilmeyen kontrol gruplarının canlılık y�zdesi %100 olarak kabul edilerek yapılan grafiğe g�re; S.Telaviv (A22) suşu her �� h�cre k�lt�r�nde de benzer sitotoksik etki g�sterirken, S.Typhimurium ATCC 14028 suşu en az MEF h�cre canlılığını (%91), S.Enteriditis (A17) suşu ise en az DU145 h�cre canlılığını (%84.2) etkilemiştir (Şekil 2).


Şekil 2

Salmonella suşları ile 100:1 MOI oranında 4 saat kok�lt�vasyon sonucu, MEF, DU145 ve HeLa h�cre k�lt�rlerinde apoptoza giren h�cre y�zdeleri Şekil 3'te g�r�lmektedir. Salmonella suşları ile kok�lt�ve edilmeyen kontrol gruplarında apoptozdaki h�cre y�zdesi %5 oranında kalırken, en fazla apoptotik etkiyi S.Telaviv (A22) suşu g�stermiştir. S.Typhimurium ATCC 14028 ve S.Enteriditis (A17) suşları sırasıyla MEF h�crelerinde %10, DU145 h�crelerinde %3 apoptotik etkiye sebep olurken, HeLa h�creleri �zerinde S.Typhimurium ATCC 14028 suşu %3, S.Enteriditis (A17) suşu %6 apoptotik etkiye sebep olmuştur (Şekil 3).


Şekil 3

Salmonella suşlarının h�cre k�lt�rlerindeki apoptoza etkisinin kaspaz-3 aktivitesi ile değerlendirilmesi amacıyla yapılan deneyde, OD405�de okunan değerler Şekil 4'de verilmiştir. Buna g�re, h�cre k�lt�rlerinde kaspaz-3 aktivitesinde en �ok artışa sebep olan suş S.Telaviv (A22)'dir. Kontrol grupları i�in h�cre tipi ayırt etmeksizin kaspaz-3 aktivitesinin OD405 değeri yaklaşık 0.01 değerinde kalırken, MEF h�crelerinde bu değer S.Typhimurium ATCC 14028 ve S.Enteriditis (A17) i�in 0.02'ye yaklaşmıştır.


Şekil 4

TARTIŞMA

Bakterilerin kanser tedavisinde kullanımının araştırılması ile ilgili �alışmalar, gelişen molek�ler mikrobiyolojik y�ntemlere paralel olarak son yıllarda artış g�stermektedir. Bakteriler, doğrudan anti-kanser etkenleri olarak kullanılmalarının yanı sıra, ila�ları istenilen b�lgeye taşıyan ajanlar olarak da g�rev yaparlar. Salmonella t�rleri ve �zellikle de S.Typhimurium, kanser tedavisinde sıklıkla araştırılan ve klinik �alışmalarda yerini almış bakteriler olarak karşımıza �ıkmaktadır16,17,18. Bu noktadan hareketle, sunulan bu �alışmada, Edirne ilinde satışa sunulan tavuk karkaslarından izole edilen S.Enteritidis (A17) ve S.Telaviv (A22) suşları ile S.Typhimurium ATCC 14028 suşunun, fare embriyonik fibroblast (MEF), insan servikal kanseri (HeLa) ve insan prostat kanseri (DU145) h�cre k�lt�rleri �zerindeki sitotoksik ve apoptotik etkilerinin değerlendirilmesi ve kanser tedavisi �alışmalarındaki kullanım potansiyellerinin araştırılması ama�lanmıştır. �alışmamızda, bakterilerin farklı MOI oranları ile kok�lt�ve edilen h�cre k�lt�rlerindeki h�cre canlılık y�zdeleri MTT sitotoksisite testi ile değerlendirilmiş; S.Typhimurium ATCC 14028 ve S.Telaviv (A22) suşlarının h�creler �zerindeki se�ici etkisi istatistiksel olarak anlamsız bulunurken (sırasıyla, p= 0.5706 ve p= 0.8661), S.Enteriditis (A17) suşu i�in anlamlı (p< 0.0001) bulunmuştur (Şekil 1). MTT sitotoksisite testi, S.Enteriditis (A17) suşunun h�cre k�lt�rleri �zerinde se�ici bir etkiye sahip olduğunu g�stermiş; bu suş, MEF ve DU145 h�crelerinin canlılık y�zdelerini, 1000:1, 100:1 ve 10:1 MOI oranlarına g�re ortalama %80'lere d�ş�r�rken, HeLa h�cre canlılık y�zdeleri aynı koşullarda %60'ın altında kalmıştır. Ancak, 1000:1 MOI oranının y�ksek ve bakteri-h�cre ink�basyon s�resinin 2 saat ile sınırlı olmasından dolayı, h�creler �zerindeki apoptotik etkinin daha iyi araştırılması amacıyla, MTT sitotoksisite testi 100:1 MOI oranı ve 4 saat ink�basyon s�resiyle ger�ekleştirilmiş, b�ylece bakterilerin h�cre k�lt�rleri �zerindeki sitotoksik ve apoptotik etkileri bu oran ve s�relerde araştırılmaya devam edilmiştir. Sonu�ta, Salmonella suşlarının h�creler ile ilişkisi ve bakteriler arasındaki etkinin varyasyonu, istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p< 0.0001). İki y�nl� ANOVA testi ile yapılan istatistiksel değerlendirmede, �alışmada kullanılan Salmonella suşlarının, h�cre k�lt�r� canlılığına se�ici bir şekilde etki ettiği belirlenmiştir. Nitekim, daha �nce C.elegans modelinde yaptığımız sağkalım analizi �alışmasına g�re de, S.Typhimurium ATCC 14028, S.Enteriditis (A17) ve S.Telaviv (A22) suşları i�in TD50 değerlerinin sırasıyla 4.1, 6.8 ve 4.8 olduğu g�sterilmiştir14.

Kanser tedavisinde kullanılmak amacıyla denenen bir�ok bakteri t�r�n�n apoptozu engellediği biliniyor olsa da, Srikanth ve arkadaşlarının19 �alışmasında S.Typhimurium'un apoptotik enzimleri aktive ettiğini g�stermiştir. �alışmamızda, Salmonella suşları ile kok�lt�vasyon sonucu MEF, DU145 ve HeLa h�crelerinden apoptoza giren h�cre y�zdeleri ve kaspaz-3 kolorimetrik �l��mleri, S.Telaviv (A22) suşunun diğer iki Salmonella suşuna g�re kanser h�crelerinde daha y�ksek apoptotik etkiye sahip olduğunu g�stermiştir. Daha �nce yapılan bir �alışmada, S.Typhimurium'a ait efekt�r bir proteinin, kaspaz-3 aktivitesini y�kselterek apoptozu aktive ettiği bildirilmiştir20. S.Typhimurium'un hipoksik durumlarda tetiklenebilen sentez mekanizmalarını i�ermesinin yanı sıra, bakteriyel bir efekt�r protein tarafından ger�ekleştirilen kaspaz-3 aktivasyonu etkisine sahip olması, bakteriyel terapide farklı bir yaklaşım olarak kullanılabilir21,22.

Patojenik olmayan S.Enteriditis (A17) ve patojenik olan S.Telaviv (A22) ile S.Typhimurium ATCC 14028 suşlarının MTT sitotoksisite testine g�re h�cre canlılığı �zerindeki etkileri karşılaştırıldığında, S.Enteriditis (A17) ve S.Typhimurium ATCC 14028 suşlarının t�m h�cre k�lt�rlerinde h�cre canlılığını ortalama %70 civarına d�ş�r�rken, S.Telaviv (A22) suşunun %80 civarına d�ş�rd�ğ� g�zlemlenmiştir. Ancak, Tali� apoptoz kiti ile belirlenen apoptoza giren h�cre y�zdesinde, patojenik olan S.Telaviv (A22) suşu apoptozu b�t�n h�cre k�lt�rlerinin ortalamasında %15 tetiklerken, patojen olmayan S.Enteriditis (A17) ve S.Typhimurium ATCC 14028 suşlarının apoptozu %5 civarında tetiklediği g�r�lm�şt�r. Ayrıca kaspaz-3 aktivitesinde de benzer sonu�lar saptanmıştır. Bu sonu�lar, patojen olmayan S.Enteriditis (A17) ve S.Typhimurium ATCC 14028 suşlarının, h�creleri daha ziyade apoptoz dışında yollarla �ld�rd�ğ�n�, patojen olan S.Telaviv (A22) suşunun ise h�cre canlılığını daha y�ksek bir apoptoz y�zdesi ile azalttığını d�ş�nd�rmektedir.

Coley'in toksini ile başlayan bakteriyel kanser tedavisi �alışmaları, g�n�m�zde klinik araştırmalar safhasına gelmiştir23. Bu konu kendi i�erisinde lokalizasyon, toksisite ve bağışıklık ile ilgili sorunlar barındırıyor olsa da, tedavinin ama� ve kapsamı doğrultusunda genetik olarak değiştirilmiş Salmonella suşlarının iyi bir bakteriyel kanser tedavi adayı oldukları g�r�lmektedir. Sonu� olarak, gıdalardan izole edilen Salmonella suşlarının kanser tedavisinde kullanılabilme potansiyellerini araştırmak amacıyla ger�ekleştirilen bu �alışma, S.Telaviv (A22) suşunun kaspaz-3 aktivitesini artırdığını ve apoptozu tetiklediğini g�stermesi ve ayrıca S.Enteriditis (A17) suşunun DU145 (insan prostat kanseri) h�creleri �zerinde se�ici sitotoksisitesi olduğunun belirlenmesi a�ısından �nem taşımaktadır.

KAYNAKLAR

  1. Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer 2015; 136(5): E359-86.
  2. Morrissey D, O'Sullivan GC, Tangney M. Tumour targeting with systemically administered bacteria. Curr Gene Ther 2010; 10(1):3-14.
  3. Brown JM, Giaccia AJ. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer Res 1998; 58(7): 1408-16.
  4. Forbes NS. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat Rev Cancer 2010; 10(11): 785-94.
  5. Afsar I. Bakteriler ve kanser sağaltımı. İnfeksiyon Derg 2007; 21(2): 101-4.
  6. Bernardes N, Chakrabarty AM, Fialho AM. Engineering of bacterial strains and their products for cancer therapy. Appl Microbiol Biotechnol 2013; 97(12): 5189-99.
  7. Forbes NS, Munn LL, Fukumura D, Jain RK. Sparse initial entrapment of systemically injected Salmonella Typhimurium leads to heterogeneous accumulation within tumors. Cancer Res 2003; 63(17): 5188-93.
  8. Nguyen VH, Kim HS, Ha JM, Hong Y, Choy HE, Min JJ. Genetically engineered Salmonella Typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Res 2010; 70(1): 18-23.
  9. Chakrabarty AM. Microorganisms and cancer: quest for a therapy. J Bacteriol 2003; 185(9):2683-6.
  10. Wei MQ, Mengesha A, Good D, Anne J. Bacterial targeted tumour therapy-dawn of a new era. Cancer Lett 2008; 259(1): 16-27.
  11. Lee CH, Wu CL, Shiau AL. Systemic administration of attenuated Salmonella choleraesuis carrying thrombospondin-1 gene leads to tumor-specific transgene expression, delayed tumor growth and prolonged survival in the murine melanoma model. Cancer Gene Ther 2005; 12(2): 175-84.
  12. Zhao M, Yang M, Ma H, et al. Targeted therapy with a Salmonella Typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Res 2006; 66(15): 7647-52.
  13. Mengesha A, Dubois L, Lambin P, et al. Development of a flexible and potent hypoxia-inducible promoter for tumor-targeted gene expression in attenuated Salmonella. Cancer Biol Ther 2006; 5(9): 1120-8.
  14. Aksoy D, Sen E. Investigation of pathogenic phenotypes and virulence determinants of food-borne Salmonella enterica strains in Caenorhabditis elegans animal model. Mikrobiyol Bul 2015; 49(4): 513-24.
  15. Ahmadian S, Barar J, Saei AA, Fakhree MA, Omidi Y. Cellular toxicity of nanogenomedicine in MCF-7 cell line: MTT assay. J Vis Exp 2009; (26). pii:1191.
  16. Nemunaitis J, Cunningham C, Senzer N, et al. Pilot trial of genetically modified, attenuated Salmonella expressing the E.coli cytosine deaminase gene in refractory cancer patients. Cancer Gene Ther 2003; 10(10): 737-44.
  17. Heimann DM, Rosenberg SA. Continuous intravenous administration of live genetically modified Salmonella Typhimurium in patients with metastatic melanoma. J Immunother 2003; (26): 179-80.
  18. Toso JF, Gill VJ, Hwu P, et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella Typhimurium to patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol 2002; 20(1): 142-52.
  19. Srikanth CV, Wall DM, Maldonado-Contreras A, et al. Salmonella pathogenesis and processing of secreted effectors by caspase-3. Science 2010; 330(6002): 390-3.
  20. Wall DM, Nadeau WJ, Pazos MA, Shi HN, Galyov EE, McCormick BA. Identification of the Salmonella enterica serotype typhimurium SipA domain responsible for inducing neutrophil recruitment across the intestinal epithelium. Cell Microbiol 2007; 9(9): 2299-313.
  21. Wall DM, Srikanth CV, McCormick BA. Targeting tumors with Salmonella Typhimurium- potential for therapy. Oncotarget 2010; 1(8): 721-8.
  22. Aydin S, Geckil H, Caylak E, Kilic N. Mikroorganizmaların kanser tedavisinde kullanımı. Fırat Tıp Derg 2004; 9(2): 30-4.
  23. Patyar S, Joshi R, Byrav DS, Prakash A, Medhi B, Das BK. Bacteria in cancer therapy: a novel experimental strategy. J Biomed Sci 2010; 17(1): 21.

İletişim (Correspondence):

Prof. Dr. Ece Şen,

Trakya �niversitesi Fen Fak�ltesi,

Biyoloji B�l�m�, Temel ve End�striyel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

Balkan Yerleşkesi, 22030, Edirne, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 284 236 3771,

E-posta (E-mail): ecesen@trakya.edu.tr

Yazdır