Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2017; 51(1): 10-19

Stafilokok İzolatlarının Biyofilm Oluşturma �zelliklerinin Araştırılması*

Investigation of Biofilm Formation Properties of Staphylococcus Isolates

Duygu Nil�fer �CAL1, İştar DOLAP�I2, Zeynep Ceren KARAHAN2, Alper TEKELİ2

1 Ankara Dışkapı Yıldırım Beyazıt Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Tıbbi Mikrobiyoloji B�l�m�, Ankara.

1 Ministry of Health Diskapi Yildirim Beyazit Training and Research Hospital, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

2 Ankara �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara

2 Ankara University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

*11. Antimikrobik Kemoterapi G�nleri'nde (18-20 Nisan 2014, İstanbul) poster bildiri olarak sunulmuş ve ikincilik �d�l�ne layık g�r�lm�şt�r.

�Z

Biyofilm �retimi, stafilokların tıbbi cihazlara yapışmasını sağlayan �nemli bir vir�lans fakt�r�d�r. Biyofilmin temel bileşenini oluşturan madde olan polisakkarit yapıdan oluşan intersel�ler adezin (PİA), bakteriyel kromozom �zerinde bulunan ica operonu tarafından kodlanan bir enzim (N-asetilglikozamin transferaz) tarafından sentezlenen beta-1,6-N-asetilglukozamin polimerlerinden oluşmaktadır. ica operonu d�rt gen (A, B, C ve D) ve transpoze olabilen IS256'yı i�ermektedir. Bu �alışmada; farklı t�rlere ait invaziv ve invaziv olmayan stafilokok izolatlarının biyofilm oluşturma yetenekleri arasında fark olup olmadığının belirlenmesi ama�lanmıştır. Stafilokok izolatlarının (n= 166) biyofilm oluşturma �zelliği Kongo kırmızısı agar (KKA) besiyerinde fenotipik olarak değerlendirilmiş; icaA, icaD ve IS256 genlerinin varlığı polimeraz zincir reaksiyon (PCR) y�ntemi ile araştırılmıştır. Stafilokok izolatlarının %44.6 (74)'sı metisiline diren�li Staphylococcus aureus (MRSA), %15.1 (25)'i metisiline duyarlı S.aureus (MSSA), %37.3 (25)'� Staphylococcus hominis, %12 (20)'si Staphylococcus epidermidis, %15 (10)'i Staphylococcus haemolyticus, %13.4 (9)'� Staphylococcus capitis, %3 (2)'� Staphylococcus saprophyticus ve %1.5 (1)'i Staphylococcus warnerii olarak tiplendirilmiştir. MRSA izolatlarının 52'si kan, 22'si burun; MSSA izolatlarının ise t�m� burun k�lt�rlerinden izole edilmiştir. Koag�laz-negatif stafilokoklar (KNS) burun, santral ven�z kateter ucu, kateteri olan hastaların kan k�lt�rlerinden izole edilen invaziv olan ve invaziv olmayan izolatlardan oluşmuştur. �alışmamızda KNS ve S.aureus izolatlarının KKA besiyerinde biyofilm oluşturma oranları arasında anlamlı fark saptanırken (sırasıyla %40.3; %85.8, p< 0.001), PCR ile de S.aureus izolatlarının araştırılan her �� geni de taşıma oranları KNS'lere g�re ististiksel olarak anlamlı oranda y�ksek bulunmuştur (sırasıyla %78.8; %11.9, p< 0.001). Ayrıca invaziv izolatların invaziv olmayan izolatlara g�re hem KKA besiyeri y�nteminde biyofilm oluşturma, hem de araştırılan her �� geni birlikte taşıma oranlarının y�ksekliği istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p< 0.001). İnvaziv olan �rneklerin biyofilm oluşturma potansiyellerinin y�ksekliğinin tedavisi g�� enfeksiyonlara yol a�abileceği, taşıyıcılığın ve hastane enfeksiyonlarının �nlenmesi a�ısından da bu izolatların yayılımının �n�ne ge�ilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır. Ayrıca stafilokoklarda biyofilm oluşumunun g�sterilmesinde fenotipik ve genotipik testlerin birlikte kullanılmasının daha uygun olacağını �nermekteyiz.

Anahtar s�zc�kler: Biyofilm; Staphylococcus aureus; koag�laz-negatif stafilokok; Kongo kırmızısı agar; PCR.

ABSTRACT

Biofilm production is an important virulence factor which allows staphylococci to adhere to medical devices. The principal component of biofilm is a "polysaccharide intercellular adhesin (PIA)" which is composed of a beta-1,6-N-acetylglucosamine polymer synthesized by an enzyme (N-acetylglucosamine transferase) encoded by the ica operon found on the bacterial chromosome. This operon is composed of four genes (A, B, C, and D), and a transposable element IS256. In this study, we aimed to determine the biofilm production characteristics of invasive/non-invasive staphylococcus isolates and different staphylococcus species. Biofilm production of 166 staphylococci was phenotypically investigated on Congo Red Agar (CRA); the presence of icaA, icaD and IS256 genes were investigated by polymerase chain reaction (PCR). 74 of the isolates (44.6%) were identified as methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), 25 (15.1%) as methicillin sensitive S.aureus (MSSA), 25 (37.3%) as Staphylococcus hominis, 20 (12%) as S.epidermidis, ten (15%) as Staphylococcus haemolyticus, nine (13.4%) as Staphylococcus capitis, two (3%) Staphylococcus saprophyticus and one (1.5%) �as Staphylococcus warnerii. Of the MRSA strains, 52 were isolated from blood and 22 from nose; all MSSA strains were isolated from nose cultures. Coagulase-negative staphylococci (CoNS) strains were composed of invasive and non-invasive strains isolated from nose, catheter tip and blood cultures from patients with catheter. Production with CRA method was found to be statistically significant in invasive isolates (p< 0.001). It is concluded that; as the biofilm formation capacity of invasive isolates can cause refractory infections and the importance of carriage and hospital infections of these bacteria, it is important to prevent the spread of these isolates. A combination of phenotypic and genotypic tests is recommended for the investigation of biofilm formation in staphylococci. 40.3% of the CoNS isolates, and 85.8% of S.aureus isolates produced biofilm on CRA (p< 0.001) and with PCR method the ratio of carrying three genes was found to be statistically important in S.aureus when compared with CoNS. Carriage of three genes and biofilm formation capacity of invasive isolates can cause refractory infections and the importance of carriage and hospital infections of these bacteria, it is important to prevent the spread of these isolates. A combination of phenotypic and genotypic tests is recommended for the investigation of biofilm formation in staphylococci.

Keywords: Biofilm; Staphylococcus aureus; coagulase-negative staphylococci; Congo red agar; PCR.

Geliş Tarihi (Received): 01.09.2016 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 12.01.2017

GİRİŞ

Staphylococcus aureus ve Staphylococcus epidermidis'i de i�eren koag�laz-negatif stafilokoklar (KNS) sağlıklı kişilerin deri ve burun mukozasında bulunabilen ve ciddi invaziv enfeksiyonlara yol a�abilen t�rlerdir. G�n�m�zde �zellikle kateter ve benzeri kalıcı cihaz kullanımıyla ilişkili nozokomiyal enfeksiyonlarda etken olarak sıklıkla karşımıza �ıkmakta ve konağın bağışık yanıtına da bağlı olarak, lokal ya da sistemik enfeksiyonlara neden olabilmektedir 1-4. Zaman zaman �l�mc�l seyredebilen bu enfeksiyonların oluşumunda rol oynayan mikroorganizma vir�lans fakt�rleri arasında biyofilm oluşumu ilk sıralarda yer almaktadır 4-8.

Stafilokoklarda biyofilm oluşumu; bakterinin polimer y�zeye tutunmasını takiben "polisakkarit intersel�ler adezin (PİA)" adı verilen bir h�cre dışı polisakkarit �retimini ve bu oluşumun i�erisinde h�cre �oğalması aşamalarını i�ermektedir. PİA �retimi ica operon b�lgesinde bulunan icaA, icaD, icaB ve icaC genlerinin kontrol�ndedir. Beta-1,6 bağlı lineer glikozaminoglikan yapıda olan PİA, in vitro olarak UDP-N-asetilglikozaminden "N-asetilglikozamin transferaz" enzimiyle sentezlenir. Bu enzim operonun icaA b�lgesinde kodlanmaktadır. Ancak tek başına icaA ekspresyonunun enzimatik aktivitesinin d�ş�k olduğu ve PİA �retimi i�in �zellikle icaA ve icaD gen b�lgelerinin ko-ekspresyonlarının gerekli olduğu g�sterilmiştir1,4,9,10. Stafilokok biyofilmlerin PİA dışında DNA ve protein de i�erdiğini g�steren �nceki �alışmalara dayanarak, PİA dışı yapısal elemanların stafilokok h�cre �l�m�ne bağlı olduğu ve bu aşamada pek �ok başka genin de yer aldığı bilinmektedir. Ancak vahşi tip suşlara kıyasla icaA taşımayan mutantların in vivo olarak patojenitesindeki azalmanın g�sterilmesiyle, biyofilme bağlı patogenezde PİA'nın katkısının b�y�k olduğu d�ş�n�lmektedir4. ica operon b�lgesinin faz varyasyonuna gitmesine ve biyofilm oluşturan izolatların biyofilm oluşturmayan izolatlara d�nmesine (ya da tam tersi) yol a�an aktif hareketli bir genetik eleman olan IS256 b�lgesi de, ica genlerinin ekspresyonunu kontrol eden b�lge olarak tanımlanmaktadır10.�

Biyofilm oluşturan bakteri enfeksiyonlarında, antibiyotiklerin mikroorganizmaya ulaşamaması ve bu yapı i�erisinde bakterilerin bağışık yanıttan da etkilenmemesi nedeniyle tedavinin g�� olduğu bilinmektedir11. İmplant cihazlara bağlı gelişen enfeksiyonlarda metisilin diren�li S.aureus (MRSA)'ların duyarlı olanlara g�re daha fazla izole edildiğini11 ya da ica operonunun toplum kaynaklı S.epidermidis'lerde bulunmadığını g�steren �alışmalardan12 yola �ıkarak �alışmamızda farklı t�rlere ait stafilokoklarda biyofilm oluşturma �zellikleri araştırılarak, invaziv olan/olmayan izolatların ve farklı stafilokok t�rlerinin biyofilm oluşturma yetenekleri arasında fark olup olmadığının belirlenmesi ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

�rneklerin Toplanması ve Tiplendirilmesi

�alışmada Ankara �niversitesi Tıp Fak�ltesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı k�lt�r koleksiyonunda bulunan, 2002-2014 yılları arasında izole edilen S.aureus izolatlarından randomize olarak se�ilen 74 (%44.6) MRSA, 25 (%15.1) metisiline duyarlı S.aureus (MSSA) ve 2012-2014 yılları arasında izole edilen 67 (%40.4) KNS [48 (%72) metisilin diren�li, 19 (%28) metisilin duyarlı] olmak �zere toplam 166 izolat değerlendirildi. MRSA'ların 52'si (%31.3) kan dolaşım enfeksiyonu (KDE) etkeni olarak, geri kalan 22'si (%13.3) ve t�m MSSA'lar burundan izole edildi. KNS'ler perifer kanda �remenin olup olmamasına g�re kateter kolonizasyonu (n= 24, %14.5) ve kateter ilişkili kan dolaşım enfeksiyonu (KİKDE) etkeni (n= 20, %12) olanlar ve hastane �alışanlarının burunlarından elde edilen izolatlar (n= 23, %13.9) olarak ayrıldı.

İzolatların tiplendirilmesi konvansiyonel y�ntemler ve Phoenix (Becton Dickinson, ABD) otomatize sistemi ile yapıldı. KİKDE ile KDE etkenleri (n= 72, %43.4) invaziv, kateter kolonizasyonu ve burundan izole edilen KNS'ler (n= 94, %56.6) invaziv olmayan� izolatlar olarak tanımlandı (Tablo I).�


Tablo I

DNA Ekstraksiyonu

Bakterilerin koyun kanlı agar besiyerinde bir gecelik k�lt�r�n� takiben koloniler 3U lizostafin (Applichem, Almanya) i�eren 100 μl lizis sol�syonu (20 mM Tris HCl, 140 mM NaCl, 5 mM EDTA) i�erisine toplandı, 37�C'de 4 saat bekletildikten sonra �retici firmanın �nerileri doğrultusunda DNA izolasyon kiti (Fermentas, Lituanya) kullanılarak DNA'ları ekstrakte edildi. Elde edilen DNA'lar -20�C'de saklandı.

Biyofilm �zelliklerinin Belirlenmesi

Kongo Kırmızısı Agar (KKA) ile fenotipik tespit: Kongo kırmızısı agar (KKA) besiyeri; beyin kalp inf�zyon buyyonu (37 g/L), s�kroz (50 g/L), agar (10 g/L) ve Kongo kırmızısı boyası (0.8 g/L) ile hazırlandı. Besiyerine konulacak Kongo kırmızısı boyası, yoğunlaştırılmış sıvı sol�syon şeklinde ayrı olarak hazırlanarak 121�C'de 15 dakika steril edildi. Otoklavdan �ıkan besiyeri 55�C'ye kadar soğuduktan sonra Kongo kırmızısı boyası sol�syonu eklendi. Hazırlanan besiyeri ertesi g�n taze olarak kullanıldı13.

Her plak besiyerine en az bir pozitif, bir negatif kontrol ekimi yapıldı, pozitif kontrol olarak S.aureus ATCC 25923 ve S.epidermidis ATCC 35984; negatif kontrol olarak S.aureus ATCC 29213 suşları kullanıldı. KKA besiyerine ekim i�in kullanılan birinci y�ntemde tek koloni ekimi yapılırken, ikinci y�ntemde se�ilen koloniler 5 ml fizyolojik tuzlu su i�inde s�spanse edildikten sonra 20 μl'si damlatma y�ntemi ile plak �zerine aktarıldı. 37�C'de 24 saatlik ink�basyon sonrasında plaklar değerlendirilerek, oda sıcaklığında 24 saat daha bekletilmiş ve 48. saatte yeniden değerlendirilme yapıldı. Değerlendirme iki ayrı araştırmacı tarafından, birbirinden bağımsız olarak yapılmıştır. Kuru kristal kıvamında koyu kırmızı-siyah renkli koloni oluşturanlar "slime-pozitif"; a�ık pembe-kırmızı ya da bordo renkte koloni oluşturanlar "slime-negatif" olarak yorumlandı. Slime fakt�r� oluşturmayan izolatların nadiren g�sterdiği boğa g�z� g�r�n�m� olarak tarif edilen, ortalarında siyahlaşma g�steren pembe renkli koloniler negatif olarak kabul edildi13.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile biyofilm genlerinin g�sterilmesi: icaA, icaD ve IS256 genlerinin varlığını g�sterebilmek i�in literat�rde daha �nce tanımlandı, primer dizileri ile PCR y�ntemi kullanıldı, reaksiyon koşulları Vasudevan ve Montanero'nun y�ntemi modifiye edilerek uygulandı14,15.

İstatistiksel Analiz

Verilerin analizi Ki-kare ve Fisher's exact testleri kullanılarak yapıldı. İki y�ntemin sınıflanmış değerleri arasındaki uyumu araştırırken Kappa uyum katsayısı ve anlamlılığı hesaplandı. p< 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

BULGULAR

Araştırmaya alınan toplam 166 izolatın 99'u S.aureus, 67'si KNS'dir. KNS'lerin 25 (%37.3)'i Staphylococcus hominis, 20 (%29.9)'si S.epidermidis, 10 (%15)'u Staphylococcus haemolyticus, 9 (%13.4)'u Staphylococcus capitis, 2 (%3)'si Staphylococcus saprophyticus ve 1 (%1.5)'i Staphylococcus warnerii olarak tanımlanmıştır (Tablo I).

KKA y�nteminin 24. ve 48. saat değerlendirme sonu�ları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadığından 24. saat sonu�ları esas alınmıştır. KKA besiyerlerine ekimde tek koloni d�ş�rme ve damlatma y�ntemleri karşılaştırıldığında, izolatların %97.6'sında (162/164) iki y�ntem ile aynı sonu� alınmıştır. Bir S.haemolyticus ve bir S.hominis izolatında tek koloni ekiminde tek d�şen kolonilerin renk dağılımı birbirinden farklı g�r�lm�ş, ancak damlatma y�nteminde pozitif bulunduklarından "slime-pozitif" kabul edilmişlerdir. İki y�ntem arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmamakla birlikte, tek koloni ekiminde kolonilerin zaman zaman farklı renkte r�fleler vermesi nedeniyle damlatma y�nteminin değerlendirilmesi daha kolay olmuştur (Şekil 1).


Şekil 1

KNS'lerin %40.3'�n�n (27/67) slime oluşturmasına karşın, S.aureus-'larda bu oran %85.8 (85/99) bulunmuştur (p< 0.001). KKA'da pozitiflik oranları MRSA'larda %95.9, MSSA'larda %56 olarak saptanırken (p< 0.001), aynı oran metisiline diren�li KNS (MR-KNS)'lerde %39.6 (19/48); metisiline duyarlı KNS (MS-KNS)'lerde ise %42.1 (8/19) bulunmuştur (p> 0.05) (Tablo II). KNS izolatları i�inde S.epidermidis izolatlarının KKA'da biyofilm oluşturma oranlarının (%60), diğer KNS izolatlarına g�re (%31.9) daha y�ksek olduğu g�sterilmiştir (p< 0.001).


Tablo II

İnvaziv olan izolatların %84.7'si (61/72), invaziv olmayan izolatların %55.3'� (52/94) slime-pozitif bulunmuştur (p< 0.001) (Tablo III).


Tablo III

Bir S.aureus izolatında tek başına icaA gen varlığı izlenirken, S.aureus izolatlarında tek başına icaD ya da IS256 geni taşıyan izolata rastlanmamıştır. Buna karşılık S.aureus izolatlarının %78.8 (78/99)'inin her �� geni birlikte taşıdığı, bir izolatta hi�bir genin bulunmadığı saptanmıştır (Tablo II).

�� genin birlikte pozitifliğinin g�r�lme sıklığı MRSA'larda %90.5 (67/74), MSSA'larda %44 (11/25) olarak saptanmıştır (p< 0.001) (Tablo II).�

KNS izolatlarının %15'inin sadece icaA, %8.9'unun sadece icaD, %31.3'�n�n ise sadece IS256 genlerini taşıdığı saptanmış, her �� geni birlikte taşıyan izolatların oranı %11.9 olarak bulunmuştur. Araştırılan genlerin hi�birini taşımayan 7 (%10.4) izolat g�sterilmiştir.

�� genin birlikte pozitifliğinin g�r�lme sıklığı MR-KNS'lerde %16.7 (8/48) bulunurken, MS-KNS'lerde �� genin birlikte pozitifliğine rastlanmamıştır (0/19) ve bu dağılım istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p= 0.094) (Tablo II).�

�� geni birlikte taşıyan S.aureus (%78.8; 78/99) ve KNS izolatlarının (%11.9; 8/67) oranları karşılaştırıldığında, S.aureus'lardaki oranın y�ksekliği istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p< 0.001) (Tablo II).�

KDE etkeni ve burundan izole edilen stafilokoklarda icaA pozitiflik sıklığı (p< 0.001), KDE ve KİKDE etkenleri ile burundan izole edilenlerde icaD pozitiflik sıklığı (p< 0.001) ve kateter kolonizasyonu, KDE ile KİKDE etkenlerinde IS256 pozitiflik sıklığı (p< 0.001) anlamlı olarak y�ksek bulunmuştur.

İnvaziv izolatların hepsi araştırılan genlerden en az birini taşırken, invaziv olmayan izolatların %8.5'inde hi�bir gene rastlanmamıştır. İnvaziv izolatlarda �� geni birlikte taşıma oranı %75 (54/72) iken invaziv olmayan izolatlarda bu oran %34 (32/94) olarak bulunmuştur (p< 0.001) (Tablo III).

TARTIŞMA

�zellikle implante tıbbi cihazlara bağlı gelişen enfeksiyonlarda etken olarak izole edilen stafilokokların ana vir�lans fakt�r�n�n polimerik y�zeylerde biyofilm oluşturarak aderanslarını sağlamak ve kolonizasyon yapmak olduğu g�sterilmiştir. Mikroorganizma bu sayede konak bağışık yanıtı ve antimikrobiyallerden korunmaktadır. Bu nedenle biyofilmler, kateterize hastalarda tedavisi zor kronik enfeksiyonlara yol a�arak �nemli bir problem oluşturmakta, hastanede yatış s�resi ve tedavi masraflarını arttırmaktadır14,16,17.

Biyofilm oluşumunun saptanmasında, konfokal lazer tarama mikroskobu ile g�r�nt�leme de d�hil olmak �zere pek �ok farklı y�ntem geliştirilmiştir. Bunlar i�erisinde t�p aderans testi18 ve KKA y�ntemleri13 en sık kullanılan kalitatif; doku k�lt�r plak metodu8 ise kantitatif y�ntemdir. Biyofilmi oluşturan genlerin saptanması da bu y�ntemleri tamamlamaktadır19. KKA y�ntemi, kolay uygulanmasıyla �n plana �ıkmakla birlikte, molek�ler y�ntemlere kıyasla daha az oranda kesin sonu�lar vermektedir19,20. KKA besiyerinin i�erisindeki s�kroz, glukan �retimini saptarken, Kongo kırmızısı da bakterinin oluşturduğu ekzopolisakkaritleri boyamakta ve siyah renkli koloniler biyofilm oluşturan izolatlar olarak yorumlanmaktadır13. Ancak kolonilerde renk ge�işi her zaman �ok net olmamakta ve y�ntem kantitatif değil, kromojenik değerlendirmeye dayandığı i�in kalitatif ve subjektif olarak kabul edilmektedir21. Bu nedenle KKA �zerine ekim yaparken tek koloni ekimi ve damlatma gibi farklı y�ntemler denenmiş, tek koloni ekiminde aynı izolatın birden fazla renkte koloniler oluşturabilmesine karşılık, damlatmada tek renkte g�r�n�m izlenmesinden dolayı değerlendirimin daha kolay olduğu sonucuna varılmıştır21. �alışmamızda her iki ekim y�ntemi de kullanılmış, aralarındaki fark istatistiksel olarak anlamlı olmamakla birlikte, damlatma y�nteminde karar vermek daha kolay olmuştur.

Stafilokokkal biyofilm oluşumu �ok sayıda d�zenleyici proteine bağlı olmakla birlikte, esas olarak ica lokusunda bulunan icaADBC genlerinin �r�n� olan ve h�crelerin birbirine yapışmasına aracılık eden PİA ekspresyonuyla d�zenlenmektedir. Hayvan modellerinde PİA-negatif mutantların, PİA-pozitif olanlara g�re kateter ilişkili enfeksiyonlara belirgin oranda daha az yol a�tığı g�sterilmiştir22.

Biyofilm oluşturan S.epidermidis izolatlarının faz varyasyonuna gidebildiği ve biyofilm oluşturan bir koloninin pasajından sonra PİA �retiminin kaybına bağlı biyofilm negatif koloniler izlenebildiği ortaya konulmuştur10. Ziebuhr ve arkadaşlarının10 �alışmasında IS256'nın ica gen k�mesinin farklı yerlerine girip �ıkmasına bağlı olarak faz varyasyonu olabileceği g�sterilmiş, KKA y�ntemi; siyah kolonilerin �zerinde pembe �ıkıntılar şeklinde izlenen faz varyasyonunu da g�sterdiğinden uygun bir y�ntem olarak tanımlanmıştır10. �alışmamızda KKA besiyerine damlatma ve tek koloni ekimi y�ntemlerinde izlenen farklılıkların ve tek koloni y�ntemini değerlendirmede yaşanan zorlukların faz varyasyonlarına bağlı olabileceği d�ş�n�lm�şt�r.

Biyofilmin, fenotipik ekspresyonunun in vitro koşullardan etkilenmesi nedeniyle, genotipik olarak pozitif, fenotipik olarak negatif izolatların tespit edilmesi i�in farklı y�ntemlerin birlikte kullanılmasını �neren bir�ok araştırmacı bulunmaktadır1,14,17. �alışmamızda KKA y�ntemi ile elde edilen biyofilm pozitifliği, molek�ler y�ntemler ile de desteklenmiş, izolatların birbirleriyle karşılaştırılmasında her iki y�ntem ayrı ayrı değerlendirilmiştir. KNS ve S.aureus izolatlarının KKA'da biyofilm oluşturma oranları arasında anlamlı fark saptanırken (sırasıyla %40.3; %85.8, p< 0.001), PCR ile S.aureus izolatlarının araştırılan her �� geni taşıma oranları KNS'lere g�re istatistiksel olarak anlamlı oranda y�ksek bulunmuştur (sırasıyla %78.8; %11.9, p< 0.001). Bu durum S.aureus'un vir�lans �zellikleri ile a�ıklanabileceği gibi �alışmamızda S.aureus izolatlarında tekli gen pozitifliklerinin KNS'lere g�re daha az olduğu g�r�lm�ş, bu da KNS'lerde biyofilm oluşumunda bu genlerin dışında diğer fakt�rler ve bu �alışmada araştırılmayan diğer genlerin varlığının etkisini d�ş�nd�rm�şt�r.

Stafilokokların biyofilm oluşturma kapasiteleri antimikrobiyal ila� direncinde artış ile ilişkilendirilmektedir23. �alışmamızda kullanılan izolatlar metisilin diren�lerine g�re değerlendirildiğinde S.aureus'larda metisilin diren�li olan izolatların hem KKA y�ntemiyle biyofilm oluşturma, hem de PCR ile icaA, icaD ve IS256 genlerini birlikte taşıma oranlarının metisilin duyarlı olanlara g�re fazla olması istatistiksel olarak da anlamlı saptanmıştır (p< 0.001). Her �� geni taşımasına rağmen, �� izolatta (bir MRSA ve iki MSSA) fenotipik olarak biyofilm �retimi g�zlenmemesi, fenotipik y�ntemin sınırlılığına ya da bu izolatlarda ekspresyonun olmamasına bağlanmıştır. Buna karşılık, KNS izolatlarında metisilin direnci ile biyofilm oluşumu arasında bir ilişki kurulamamıştır (p= 0.094).

KNS'ler i�erisinde S.epidermidis izolatlarının KKA besiyerinde biyofilm oluşturma oranları (%60) diğer KNS'lere g�re (%31.9) istatistiksel olarak anlamlı oranda y�ksek bulunmuştur (p< 0.001). Biyofilm oluşturan S.epidermidis izolatlarının, oluşturmayanlara g�re daha vir�lan olduğunu g�steren �alışmalar bulunmaktadır10. Gad ve arkadaşları, �riner kateteri olan hastaların kateter segmentlerinden izole edilen ve biyofilm oluşumu g�steren b�t�n izolatların icaA ve icaD pozitif olduğunu, buna karşılık idrarlarından izole edilen ve biyofilm oluşturmayan izolatlarda her iki genin de negatif olduğunu bulmuştur16. Bu sonu�lar damar i�i kateterlerden izole edilen ve biyofilm oluşturan t�m S.aureus ve S.epidermidis izolatlarında icaA ve icaD genlerini pozitif olarak bulan Arciola ve arkadaşlarının1 �alışmasıyla da uyumludur. Bu �alışmalarda ica genlerinin biyofilm oluşumundaki rollerine ve stafilokok enfeksiyonlarında vir�lans belirteci olarak değerlendirilebileceğine dikkat �ekilmiştir. Bir başka �alışmada da IS256'nın invaziv �rneklerde daha sık bulunduğu ve invaziv izolatları kommensal olanlardan ayırt edici bir belirte� olabileceği vurgulanmıştır24. �alışmamızda, bu bulguları destekleyecek şekilde, kan ve burun izolatlarında icaA pozitifliği (p< 0.001); KİKDE etkenleri ile kan ve burun izolatlarında icaD pozitifliği (p< 0.001); anlamlı oranda y�ksek bulunmuştur. Bu sonu�lar invaziv etkenlerde ica genlerinin rol�ne dikkat �ekmenin yanı sıra burunda da stafilokokların biyofilm oluşturabilme kapasitelerinin olduğunu g�stermiştir. Stafilokokların burunda kolonizasyonları ve taşıyıcılıkları halinde bulaşa neden olabileceklerinin akılda tutulması gerekmektedir.

�alışmamızda invaziv izolatların invaziv olmayanlara g�re hem KKA y�nteminde biyofilm oluşturma hem de araştırılan her �� geni de birlikte taşıma oranları istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p< 0.001). İnvaziv �rneklerin biyofilm oluşturma potansiyellerinin y�ksekliğinin tedavisi g�� enfeksiyonlara yol a�abileceği, taşıyıcılığın ve hastane enfeksiyonlarının �nlenmesi a�ısından da bu izolatların yayılımının �n�ne ge�ilmesi gerektiği ve biyofilm geliştirme potansiyelleri a�ısından taranmalarının �nemli olduğu sonucuna varılmıştır.

KAYNAKLAR

  1. Arciola CR, Baldassarri L, Montanaro L. Presence of icaA and icaD genes and slime production in collection of staphylococcal strains from catheter-associated infections. J Clin Microbiol 2001; 39(6): 2151-6.
  2. G�tz F. Staphylococcus and biofilms. Mol Microbiol 2002; 43(6): 1367-78.
  3. Ishak MA, Gr�schel DH, Mandell GL, Wenzel RP. Association of slime with pathogenicity of coagulase-negative staphylococci causing nosocomial septicemia. J Clin Microbiol 1985; 22(6): 1025-9.
  4. Asai K, Yamada K, Yagi T, Baba H, Kawamura I, Ohta M. Effect of incubation atmosphere on the production and composition of staphylococcal biofilms J Infect Chemother 2015; 21(1): 55-61.
  5. Cramton SE, Gerke C. The intercellular adhesion (ica) locus is present in Staphylococcus aureus and is required for biofilm formation. Infect Immun 1999; 67(10): 5427-33.
  6. Fredheim EG, Klingenberg C, Rohde H, et al. Biofilm formation by Staphylococcus haemolyticus. J Clin Microbiol 2009; 47(4): 1172-80.
  7. De Allori MC, Jure MA, Romero C, de Castillo ME. Antimicrobial resistance and production of biofilms in clinical isolates of coagulase-negative Staphylococcus strains. Biol Pharm Bull 2006; 29(8): 1592-6.
  8. Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, et al. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices. J Clin Microbiol 1985; 22(6): 996-1006.
  9. Arciola CR, Collomati S, Donati E, Montanoro L. A rapid PCR method for the detection of slime-producing strains of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus in periprosthesis infections. Diagn Mol Pathol 2001; 10(2): 130-7.
  10. Ziebuhr W, Krimmer V, Rachid S, L�ssner I, G�tz F, Hacker J. A novel mechanism of phase variation of virulance in Staphylococcus epidermidis: evidence for control of the polysaccharide intercellular adhesin synthesis by alternating insertion and excision of the insertion sequence element IS256. Mol Microbiol 1999; 32(2): 345-56.
  11. Cha JO, Yoo JI, Yoo JS, et al. Investigation of biofilm formation and its association with the molecular and clinical characteristics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Osong Public Health Res Perspect 2013; 4(5): 225-32.
  12. Harris LG, Murray S, Pascoe B, et al. Biofilm morphotypes and population structure among Staphylococcus epidermidis from commensal and clinical samples. PLoS One 2016; 11(3): e0151240
  13. Freeman DJ, Falkiner FR, Keane CT. New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. J Clin Pathol 1989; 42(8): 872-4.
  14. Vasudevan P, Nair MK, Annamalai T, Venkitanarayanan KS. Phenotypic and genotypic characterization of bovine mastitis isolates of Staphylococcus aureus for biofilm formation. Vet Microbiol 2003; 92(1-2): 179-85.
  15. Montanaro L, Campoccia D, Pirini V. Antibiotic multiresistance strictly associated with IS256 and ica genes in Staphylococcus epidermidis strains from implant orthopedic infections. J Biomed Mater Res A 2007; 83(3): 813-8.
  16. Gad GF, El-Feky MA, El- Rehewy MS, Hassan MA, Abolella H, El-Baky RM. Detection of icaA, icaD genes and biofilm production by Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis isolated from urinary tract catheterized patients. J Infect Dec Ctries 2009; 3(5): 342-51.
  17. Fox LK, Zadoks RN, Gaskins CT. Biofilm production by Staphylococcus aureus associated with intramammary infection. Vet Microbiol 2005; 107(3-4): 295-9.
  18. Christensen GD, Bisno AL, Simpsom WA, Beachey EH. Adherence of slime producing strains of Staphylococcus epidermidis to smooth surfaces. Infect Immun 1982; 37(1): 318-26.
  19. Oliveira A, Cunha Mde L. Comparison of methods for the detection of biofilm production in coagulase-negative staphylococci. BMC Res Notes 2010; 14(3): 260.
  20. Fitzpatrick F, Humphreys H, O'Gara P. Evidence for icaADBC-independent biofilm development mechanism in methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical isolates. J Clin Microbiol 2005; 43(4): 1973-6.
  21. Kaiser TD, Pereira EM, Dos santos KR, Maciel EL, Schuenck RP, Nunes AP. Modification of the Congo red agar method to detect biofilm production by Staphylococcus epidermidis. Diagn Microbiol Infect Dis 2013; 75(3): 235-9.
  22. Rupp ME, Ulphani JS, Fey PD, Mack D. Characterization of Staphylococcus epidermidis polysaccharide intercellular adhesin/hemagglutinin in the pathogenesis of intravascular catheter-associated infection in a rat model. Infect Immun 1999; 67(5): 2656-9.
  23. De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha Mde L. Antimicrobial resistance profile of planktonic and biofilm cells of Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococci. Int J Mol Sci 2016;1;17(9) pii: E1423.
  24. Gu J, Li H, Li M, et al. Bacterial insertion sequence IS256 as a potential molecular marker to discriminate invasive strains from commensal strains of Staphylococcus epidermidis. J Hosp Infect 2005; 61(4): 342-8.

İletişim (Correspondence):

Uzm. Dr. Duygu Nil�fer �cal,

Ankara Dışkapı Yıldırım Beyazıt Eğitim ve Araştırma Hastanesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji B�l�m�,

Şehit �mer Halisdemir Caddesi

06110 Dışkapı, Ankara, T�rkiye

Tel (Phone): +90 312 596 2671,

E-posta (E-mail): drduygunil@hotmail.com

Yazdır