Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2018; 52(1): 23-34

Hepatit B Vir�s� (HBV) Genotip D ile Enfekte Hasta Gruplarında
HBV preS1, preS2 ve S Gen B�lgelerinin Analizi*

Analysis of Hepatitis B Virus (HBV) preS1, preS2 and S Gene Regions from Patient Groups
Infected with HBV Genotype D

Eylem KARATAŞ1,2, Selda ERENSOY1, Ulus Salih AKARCA3, R��han SERT�Z1

1 Ege �niversitesi Tıp Fak�ltesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir, T�rkiye.

1 Ege University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Izmir, Turkey.

2 Manisa Merkezefendi Devlet Hastanesi, Manisa.

2 Manisa Merkezefendi State Hospital, Manisa, Turkey.

3 Ege �niversitesi Tıp Fak�ltesi, İ� Hastalıkları Anabilim Dalı, Gastroenteroloji Bilim Dalı, İzmir.

3 Ege University Faculty of Medicine, Department of Physiology, Izmir, Turkey.

* Bu �alışma, Ege �niversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinat�rl�ğ� tarafından 2007TIP09 proje numarasıyla desteklenmiştir.

�Z

Hepatit B vir�s� (HBV)'n�n preS ve S gen b�lgelerinde oluşan mutasyonlar; imm�n ve tanısal ka�ak mutantlara neden olabilmektedir. Bu �alışmada, HBV ile enfekte olgu gruplarında preS1, preS2 ve S gen b�lgelerinde dizi analizi ile varyant ve mutasyonların araştırılması ve bu konudaki literat�re katkıda bulunulması ama�lanmıştır. Ege �niversitesi Tıp Fak�ltesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Molek�ler Viroloji laboratuvarına HBV testleri i�in g�nderilmiş ve arşivlenmiş 56 plazma �rneğinden elde edilen HBV DNA PCR �r�nlerinin preS ve S n�kleik asit dizi analizi; zincir sonlandırma reaksiyonu ile ger�ekleştirilmiştir. İncelenen plazma �rnekleri:� A- Alışılmış HBV serolojik profiline sahip (22 �rnek), B- Alışılmış dışı HBV serolojik profile sahip kronik HBV enfeksiyonu (26 �rnek), C- Karaciğer transplantasyonu sonrası re-enfeksiyon (5 �rnek), D- Serokonversiyon d�nemindeki akut HBV enfeksiyonu (3 �rnek) olan d�rt hasta grubundan elde edilmiştir. �alışma grubundaki iki aşı ka�ak �rneğin biri tanısal ka�ak mutant; diğeri ise� anti-HBc pozitif �rnekten izole edilen tanısal ka�ak mutant� �rneğinden oluşmuştur. Elde edilen amino asit (aa) dizileri GenBank'tan alınan referans dizilerle karşılaştırılmıştır. Hepsi genotip D olarak� saptanan �rneklerin ikisi ayw1, altısı ayw3, ikisi karışık, kalan 46 �rnek ayw2 HBsAg alt tipleri olarak tanımlanmıştır. PreS1 33. ve S 162. aa arasında değerlendirmeye alınan 304 kodonun 105 (%34.5)'inde aa değişikliği saptanmıştır. Bu dizilere GenBank FJ001941-FJ001996 numaraları kullanılarak ulaşılabilmektedir. Elli altı �rnekten 48 (%85.7)'inde en az bir aa değişikliği tespit edilmiştir. PreS1'de A33T, A39T, P41K, D44del, D50N, T51P, D54N, L65P/M, F67L, W77T, A81S, Q82E, I84T, L85I/M, Q86H/T, L88S, A90T/V, N91K/del, A95P, S96A, T97I/A, N98K, Q100K, S101T, S109T, P110S, N114D/E, PreS2'de M1V, Q2R, S5H, F8S, H9Q, Q13L, D14N, R16K, R18K, G19S/D, F22L/S,� S28T, G30E, N33T, V39A, P41H/L, I42T/L, I45T, F46Y, S47L, R48K, I49T, D51V/G, P52L, A53V, L54R/G, N55K; S gen b�lgesinde E2D, I4F, F8L, G10A, V14A, F20S, L22del, R24K, P29L, Q30K, N40S, F41del, G44E, T45L, T46P, V47A, L49R, Q54R, P56L, S64F, P70A, M75I,� C76Y, R79H, I81T, F83C, L88P, L94S, Y100F, Q101H/R, M103L, L104F, L109I/M, I110L, G112S/R, S113N/P, S114A/del, T115I, T116N, T118A/K, P120A/T, T123A, "a" determinantında T126I, Q129H/R, T131N, M133T, Y134N, S136Y, S143L/M/T, D144E, G145A/R aa varyantları saptanmıştır. �� gen b�lgesinde de delesyonlar tespit edilmiştir. En y�ksek aa değişikliği izole anti-HBc pozitifliği olan (24 kodonda) �rnekte, ardından karaciğer transplantasyonu sonrası re-enfeksiyon olan� hasta grubunda (8-13 kodonda) saptanmıştır. PreS2/S promotor CCAAT kutusunda da nokta mutasyon� tespit edilmiştir. Elli altı �rneğin %41.1'inde maj�r hidrofilik b�lgede (MHR), %23.2'sinde "a" determinantında aa değişikliği� saptanmıştır. MHR'de en y�ksek aa değişikliği olan �rnekler alışılmış dışı HBV serolojik profili olan (B grubu; %61.5) ve karaciğer transplantasyonu sonrası re-enfeksiyon olan hasta grubunda (C grubunun hepsi) g�zlenmiştir. Tanısal ve imm�n (anti-HBs pozitif) ka�ak �rneklerde MHR ve "a" determinantında bildirilmiş mutasyonlar saptanmıştır. Sonu� olarak, �alışılan pop�lasyonda preS/S mutasyonları bulunmakta ve tanısal veya imm�n ka�ak olarak d�ş�n�len �rneklerde MHR ve "a" determinant b�lgelerinde aa değişiklik oranı y�ksek seviyede tespit edilmiştir. Bu �alışma, HBsAg testlerinin kullanımında mutant saptama �zelliklerinin değerlendirilmesinin �nemli olduğu g�stermektedir.

Anahtar s�zc�kler: Hepatit B vir�s�; HBV; mutasyon; varyant; PreS1; PreS2, S geni.

ABSTRACT

Mutations in� preS and S gene regions of hepatitis B virus genome may cause immune escape and diagnostic escape HBV mutants. The aim of this study was to� determine preS1, preS2 and S gene regions of HBV from HBV infected patient groups by sequence analysis and contribute to the relevant� literature. Nucleic acid sequence analysis of preS and S genes of HBV PCR products from 56 archived plasma samples sent to Ege University Faculty of Medicine Medical Microbiology Department Molecular Virology laboratory, for HBV tests� were determined by chain termination reaction. Amino acid (aa) sequences were compared with the reference sequences obtained from GenBank. Plasma samples belonged to four groups of patients: A- Chronic HBV infected patients with typical HBV serological profiles (22 samples), B- HBV infected patients with atypical HBV serological profiles (26 samples), C- HBV re-infected patients after liver transplantation (5 samples), D- Seroconversion phase following acute HBV infection (3 samples). One of two vaccine escape mutant samples was also diagnostic escape mutant; the other diagnostic escape mutant was isolated from anti-HBc positive sample. All of the sequences were determined as genotype D. HBsAg subtypes were determined as; two ayw1, six ayw3, two mix, 46 ayw2. Among the 304 codons analysed between preS 33rd and S 162nd amino acids; aa variants were� determinedin 105 codons (34.5%). Sequences can be found in GenBank with accession numbers FJ001941-FJ001996. At least one aa variation was detected in 48 of 56 samples (85.7%). The amino acid variants were as follows; PreS1: A33T, A39T, P41K, D44del, D50N, T51P, D54N, L65P/M, F67L, W77T, A81S, Q82E, I84T, L85I/M, Q86H/T, L88S, A90T/V, N91K/del, A95P, S96A, T97I/A, N98K, Q100K, S101T, S109T, P110S, N114D/E, PreS2: M1V, Q2R, S5H, F8S, H9Q, Q13L, D14N, R16K, R18K, G19S/D, F22L/S,� S28T, G30E, N33T, V39A, P41H/L, I42T/L, I45T, F46Y, S47L, R48K, I49T, D51V/G, P52L, A53V, L54R/G, N55K; S gene: E2D, I4F, F8L, G10A, V14A, F20S, L22del, R24K, P29L, Q30K, N40S, F41del, G44E, T45L, T46P, V47A, L49R, Q54R, P56L, S64F, P70A, M75I,� C76Y, R79H, I81T, F83C, L88P, L94S, Y100F, Q101H/R, M103L, L104F, L109I/M, I110L, G112S/R, S113N/P,� S114A/del, T115I, T116N, T118A/K, P120A/T, T123A, in "a" determinant; T126I, Q129H/R, T131N, M133T, Y134N, S136Y, S143L/M/T, D144E, G145A/R. Deletions were also found in all three preS/S gene regions. The highest number of aa variations were� detectedin the isolated anti-HBc positive sample (in 24 codons), followed by liver transplant group (8-13 codons). Point mutation was detected in the preS2/S promoter CCAAT box. Major hydrophilic region (MHR) variants were� determined in 41.1% of 56 samples. The highest number of MHR variants belonged to atypical HBV serological profile group (group B; 61.5%) and liver transplantation group with HBV re-infection (all� C group). Among the diagnostic escape and immune escape mutant (anti-HBs positive) samples, reported MHR and "a" determinant mutations were detected. In conclusion, the study population carries HBV preS/S variants;� MHR and "a" determinant variant rates are high� among diagnostic or immune escape mutants. It is important to evaluate the mutant detection performance of HBsAg tests.

Keywords: Hepatitis B virus; HBV; mutation; variant; PreS1; PreS2; S gene.

Geliş Tarihi (Received): 15.08.2017 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 29.10.2017

GİRİŞ

D�nyada hepatit, siroz ve hepatosell�ler karsinomun en �nemli etkeni hepatit B vir�s� (HBV) zarflı, kısmen �ift sarmallı DNA'sı olan prototipik bir Hepadnaviridae �yesidir. Genotiplere g�re değişmekle birlikte, ortalama 3200 baz uzunluğunda olan HBV DNA'sında birbirleriyle �rt�şen a�ık okuma �er�eveleri sayesinde d�rt gen b�lgesi bulunur: S geni (S), �ekirdek (kor) geni (C), polimeraz geni (P) ve X geni (X). S geninden �� farklı başlama kodonundan okuma başlatılarak �� protein kodlanır; bu gen b�lgeleri sırasıyla preS1 + preS2 + S, preS2 + S ve S'dir. Bu gen b�lgelerinden sırasıyla b�y�k (L), orta (M) ve k���k S proteinleri sentezlenir1. HBV replikasyonu sırasında diğer DNA vir�slerinden farklı olarak n�kleus i�erisinde ara bir RNA transkripti (pre-genomik RNA) sentezlenir. Viral reverstranskriptaz (RT) aktivitesi ile bu RNA'dan negatif DNA sarmalı sentezlenir. Reverstranskriptaz enziminin d�zeltici aktivite g�steren 5' ekzon�kleazı (proofreading) olmadığından, replikasyon sırasında varyant ve t�r�ms� (quasispecies) oluşumuna sebep olan hatalı baz eşleşmeleri meydana gelmektedir. İmm�n yanıt, aşılama, HBIG kullanımı ve antiviral tedavi gibi se�ici baskı durumlarında t�r�ms� havuzundaki mutantlar baskın hale gelebilir1,2.

HBsAg seroprevalansı a�ısından orta endemik olan toplumumuzda 1998 yılından itibaren HBV aşısı kitlesel aşı programına alınmıştır. Yenidoğanda aşılama ve gerektiğinde HBIG uygulanmaktadır. İmm�n mod�lat�r tedaviler, karaciğer transplantasyonunun yaygınlaşması ve antiviral tedaviler vir�s pop�lasyonunda değişikliklere neden olabilir. HBV enfeksiyonunun y�netiminde; laboratuvar tanı ve imm�noprofilaksi stratejileri a�ısından toplumdaki HBV mutasyonlarına ait veri oluşturulması �nemlidir.

HBsAg mutantları ile ilgili 2004 yılında hazırlanan ortak bildiri raporunda; HBsAg mutantlarının prevalansının bilinenden daha fazla olduğu �ne s�r�lerek, olabildiği kadar �ok izolatta S gen b�lgesinin dizi analizinin yapılması �nerilmiştir3. Bu raporda; izole anti-HBc� varlığı, HBsAg ve anti-HBs'nin birlikte pozitifliği, ciddi imm�nsupresyonu olan anti-HBs pozitif aşısız hastalar (reaktivasyon a�ısından), uyumsuz HBsAg testleri saptanan olgularda HBV-DNA araştırılması ve S gen b�lgesinin dizi analizinin yapılması gerektiği belirtilmiştir. Bu �neriler g�n�m�zde de ge�erliliğini korumaktadır.

PreS ve S gen b�lgesinde oluşan mutasyonlar; aşı ve HBIG ka�ak mutantlarına (imm�n ka�ak) ve ticari HBsAg kitleri ile yalancı negatif sonu�lara (tanısal ka�ak mutantlar) neden olabilmektedir. Ka�ak mutantlar aşılanmış bireylerde de enfeksiyonlara yol a�abilir ve duyarlı bireyleri horizontal olarak enfekte edebilir4. Bu mutasyonların pop�lasyondaki durumunun ve etkilerinin� g�sterilebilmesi i�in farklı b�lgelerden ve olgu gruplarından HBV-DNA izolatlarında varyant ve mutantların tanımlanmasına y�nelik veri tabanının genişletilmesi �nem arz etmektedir. Bu �alışmada, HBV ile enfekte olgu gruplarında preS1, preS2 ve S gen b�lgelerinin dizi analizi ile varyant ve mutasyonların araştırılması ve literat�re katkıda bulunulması ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

Bu �alışma i�in Ege �niversitesi Tıp Fak�ltesi Araştırma Etik Kurul Başkanlığı tarafından onay alındı (02.05.2006-06-4.1/1). Plazma �rnekleri �alışmaya se�ilen hastalardan bilgilendirilmiş g�n�ll� onam alındı ve aşılanma durumları soruldu.

Hasta �rnekleri

Ege �niversitesi Tıp Fak�ltesi (E�TF) Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Viroloji Laboratuvarına HBV serolojik testleri ve viral y�k i�in g�nderilmiş ve� stoklanmış �rneklerden n�kleik asit dizi analizi i�in yeterli HBV DNA d�zeyi bulunan plazma �rnekleri �alışmaya alındı. Se�ilen �rneklerin ait olduğu 56 hastanın 25 (%44.6)'inin kadın, 31 (%55.4)'inin erkek olduğu saptandı. Hasta grubunun yaş ortalaması 40.4 (7-77) olarak tespit edildi. Hemodiyaliz hastası olan iki olgunun aşılı olduğu belirlendi. Olgular serolojik ve klinik bulgularına g�re (biyokimyasal ve histoloji sonu�larıyla) d�rt grupta incelendi: A- Alışılmış HBV serolojik profiline sahip kronik HBV enfeksiyonu, B-Alışılmış dışı HBV serolojik profiline sahip kronik HBV enfeksiyonu, C- Karaciğer transplantasyonu (Kc Tx) sonrası re-enfeksiyon, D- Serokonversiyon d�nemindeki akut HBV enfeksiyonu. Plazma �rnekleri, DNaz ve RNaz i�ermeyen koşullarda -80�C'de saklandı.

�alışma Kapsamında Kullanılan Testler

�alışmaya alınan �rneklerin HBsAg d�zeyleri ARCHITECT (Abbott Diagnostics, Almanya) ile, HBeAg, anti-HBe, anti-HBcIgM, anti-HBc total ve anti-HBs d�zeyleri Murex (Abbott Diagnostics, Almanya) ile �alışıldı. N�kleik asit dizi analizi i�in n�kleik asit izolasyonu High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Applied Science, Almanya) kullanılarak yapıldı. Toplam 56 hastanın plazma �rneğinden izole edilen HBV DNA �rneklerinin preS ve S gen b�lgeleri HBPr1, HBPr135, HBPr2, HBPr94 primerleri kullanılarak iki t�rl� (nested) PCR ile �oğaltıldı5. Dizi analizi, HBPr2, HBPr94, P7 S, P7 AS, CHBV-3 S, CHBV-3 AS5-7 primerleri ve ABI PRISM BigDye Terminator Kit v3.1 (Applied Biosystems, ABD) kullanılarak ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, ABD) cihazında �ift y�nl� analiz şeklinde ger�ekleştirildi.

PreS ve S gen b�lgelerindeki değişiklikleri belirlemek i�in GenBank'tan (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) alınan 13 adet genotip D dizisi referans olarak kullanıldı. Bu diziler DNAStar (DNAStar INC, ABD) programında MegAlign mod�l�nde Clustal W y�ntemiyle hizalandı ve ortak bir referans dizi oluşturuldu. Elde edilen diziler DNAStar (DNAStar INC, ABD) programında SeqMan mod�l�nde referans dizi ile karşılaştırılarak temizlendi. Temizlenen diziler referanslar ile birlikte MegAlign mod�l�nde Clustal W y�ntemiyle hizalandı ve amino asit (aa) dizilerine �evrildi.

PreS ve S gen b�lgesine ait 848 baz uzunluğundaki n�kleotid dizisi, GenBank'tan alınan 13 dizi (HBV genotip A-H) ve ortak referans diziyle ile beraber Clustal W y�ntemiyle hizalandı, Neighbourjoining (NJ) ve JukesCantor metodu kullanılarak filogenetik ağa� oluşturuldu. 122, 127, 134, 159 ve 160. pozisyonlardaki amino asitler değerlendirilerek HBsAg alt tip tayini yapıldı4.

BULGULAR

Bu �alışmada yer alan �rneklerin hepsi genotip D olarak bulunmuştur. Elli altı �rneğin ikisi ayw1, altısı ayw3, ikisi karışık, kalan 46 �rnek ise ayw2 HBsAg alt tipleri olarak saptanmıştır. PreS ve S gen b�lgelerinin aa dizisine �evrilip hizalanması sonucunda, preS1 33. ve S 162. aa arası (304 kodon) değerlendirmeye alındığında; 105 (%34.5)'inde değişiklik olduğu tespit edilmiştir. Bu dizilere GenBank FJ001941-FJ001996 numaralarından ulaşılabilmektedir. Elli altı �rneğin 48 (%85.7)'inde referans diziye g�re en az bir aa değişikliği bulunmuştur. Gruplardaki �rnek sayıları uygun dağılmadığı i�in mutasyon oranları karşılaştırılmamıştır.

Amino asit değişikliği olan �rnek sayıları ve gruplarda �rnek başına d�şen aa değişiklik sayıları Tablo I'de g�sterilmiştir. En y�ksek amino asit değişikliğine� saptanan izole anti-HBc �rneğinin dizi analizinde preS1 gen b�lgesinde d�rt (I84T, L85I, A95P, T97I), preS2 gen b�lgesinde beş (Q2R, S5H, H9Q, R16K, V39A) ve S gen b�lgesinde 15� (G10A, R24K, T46P, V47A, L94S, Q101H, L104F, L109I, T115I, T116N, P120A,T123A, S136Y, S143M, G145A) olmak �zere toplam 24 b�lgede değişiklik saptanmıştır.


Tablo I

PreS1 gen b�lgesinde incelenen (preS1 33-119.) kodonlarda en sık (beş �rnekten fazla) L85I/M, A90T/V, N114D/E aa değişikliklerine rastlanılmış; bunların yanında, A33T, A39T, P41K, D44del, D50N, T51P, D54N, L65P/M, F67L, W77T, A81S, Q82E, I84T, Q86H/T, L88S, N91K/del, A95P, S96A, T97I/A, N98K, Q100K, S101T, S109T, P110S aa değişiklikleri saptanmıştır. Ayrıca, HBsAg ve anti-HBs birlikte pozitif (B.2) bir �rnekte 62-72. ve 105-119., HBeAg pozitif kronik aktif hepatit grubunda (A.2) bir �rnekte 69-79. ve 83-88. ve HBsAg pozitif, anti-HBc negatif (B.4) bir �rnekte 102-119. amino asitler arasında delesyon� tespit edilmiştir. PreS2 gen b�lgesinde incelenen (preS2 1-55.) kodonlarda en sık rastlanan M1V, R18K, F22L/S, V39A, P41H/L, P52L aa değişiklikleri yanında, Q2R, S5H, F8S, H9Q, Q13L, D14N, R16K, G19S/D, S28T, G30E, N33T, I42T/L, I45T, F46Y, S47L, R48K, I49T, D51V/G, A53V, L54R/G, N55K aa değişiklikleri saptanmıştır. PreS2'de ayrıca, HBsAg ve anti-HBs birlikte pozitif (B.2) bir �rnekte 1-2., HBsAg pozitif, anti-HBc negatif (B.4) bir �rnekte 1-15. ve HBV re-enfeksiyonu olan grupta (C) bir �rnekte 14-22. amino asitler arasında delesyon saptanmıştır.

S gen b�lgesinin HBs1 kısmında E2D, I4F, F8L, G10A, V14A, F20S, L22del, R24K, P29L, Q30K, N40S, F41del, G44E, T45L, T46P, V47A, L49R, Q54R, P56L, S64F, P70A, M75I,� C76Y, R79H, I81T, F83C, L88P, L94S, Y100F, Q101H/R,� M103L, L104F, L109I/M, I110L, G112S/R, S113N/P, S114A/del, T115I, T116N, T118A/K, P120A/T, T123A, "a" determinantında T126I, Q129H/R, T131N, M133T, Y134N, S136Y, S143L/M/T, D144E, G145A/R aa değişiklikleri saptanmıştır. T h�cre epitopunda N40S, V47A ve L49R� mutasyonları� g�zlenmiştir. Bunların dışında HBsAg pozitif, anti-HBc negatif (B.4) bir �rnekte 106-111. ve 116-117. amino asitleri arasında delesyon saptanmıştır.

Major hidrofilik b�lge (MHR) ve "a" determinantında aa değişikliği bulunan olgu sayıları ve oranları Tablo II'de g�sterilmiştir.


Tablo II

�alışma grubundaki �rneklerde S geni MHR b�lgesi aa değişikliklerinin gruplardaki dağılımı Tablo III'te g�sterilmiştir.


Tablo III

TARTIŞMA

HBV preS1, preS2 ve S gen b�lgelerindeki aa değişikliklerinin araştırılması ama�lanan bu �alışmada incelenen �rneklerin hepsi T�rkiye'de yapılan diğer �alışmalarda� olduğu gibi genotip D olarak saptanmış ve benzer şekilde baskın olarak HBsAg alt tipi ayw2 tespit edilmiş ve diğer alt tiplerin de T�rkiye'de g�zlenen alt tiplerle uyumlu olduğu belirlenmiştir8-10.

�alışma pop�lasyonunda �rneklerin %85.7'sinde en az bir aa değişikliği bulunmuştur. En fazla amino asit değişikliği (24 kodonda) izole anti-HBc pozitifliği (tanısal ka�ak mutant) olan �rnekte g�r�lm�şt�r. �alışmamızda B.1� (salt anti-HBc olumlu) ve B.5 no'lu (HBsAg negatif, anti-HBc ve anti-HBs pozitif) �rneklerde HBV DNA varlığı bulunmasına karşın, HBsAg testleri s�rekli olarak negatif olarak saptandığı i�in bu �rnekler tanısal ka�ak mutant olarak değerlendirilmiştir. En y�ksek mutasyon y�k�ne sahip izole anti-HBc olan �rnekte saptanan aa değişiklikleri, �nceki �alışmalarda gizli ve kronik B hepatitli hastalar ile ka�ak mutantlar dahil olmak �zere farklı hasta gruplarından izole edilmiştir1,11-18. S gen b�lgesinde 10'u MHR i�inde bulunan aa değişikliklerinin ��� "a" determinantında yer almaktadır. Bu �rnekte preS2/S promotor ekspresyonunu artıran CCAAT kutusunda da nokta mutasyon� tespit edilmiştir19.

Sistemlerin mutant yakalama d�zeylerini değerlendiren �alışmalarda� bir�ok testin farklı sonu� verdiği bildirilmiştir3,11,20. �alışmamızda rutin değerlendirmede �nce HBsAg negatif, farklı test ile tekrar edildiğinde ise pozitif bulunan ya da zayıf pozitif bulunan �rnekleri i�eren B3 grubundaki d�rt �rnekte S gen b�lgesinde ��� MHR'de olmak �zere beş aa değişikliğine rastlanmıştır. I110L değişikliğine gizli ve HBsAg ve anti-HBs beraber pozitifliği olan hastalarda rastlanmıştır13,14. Sayıner ve arkadaşları10 tarafından yapılan �alışmada T118A, kronik HBV hastalarında MHR'de en sık rastlanan değişiklik olarak bulunmuş ve Hint ve İspanyol toplumunda da sık g�r�lmesinden dolayı bu sonu� mutasyondan daha �ok varyant olarak değerlendirilmiştir. 120. kodondaki mutasyonların tanıda probleme yol a�tıkları bilinmektedir. P120T mutasyonuna aşı ve HBIG ka�ak mutant olarak ve gizli ve kronik HBV enfeksiyonlu hastalarda rastlanmıştır13,14,21.�����

İmm�n ka�ak olarak en sık bildirilen mutasyonlar I/T126A, Q129H, M133L, T143M ve G145R'dir1,16,22. Bu �alışmada bir B2 grubundan (HBsAg ve anti-HBs pozitif), bir de B5 (HBsAg negatif) olan aşılanmış iki hemodiyaliz hastasında aşı ka�ak mutantı olma olasılığı saptanmıştır. Aynı zamanda, tanısal ka�ak olan B5 �rneğinde (HBsAg negatif, anti-HBc ve anti-HBs pozitif) preS2 gen b�lgesinde iki ve S gen b�lgesinde altı olmak �zere toplam sekiz aa değişikliği saptanmıştır. MHR i�inde yer alan d�rt değişikliğin birinin "a" determinantında olduğu tespit edilmiştir. Q101R, M103L, G112R gizli ve kronik HBV enfeksiyonlu hastalardan bildirilmiştir13,16,20. D144E'nin imm�n ka�ak mutantı olduğu ve tanıda problemlere neden olduğu bildirilmiştir14,16. B2 grubundan aşılı hemodiyaliz hastasının �rneğinde preS1 ve preS2 b�lgelerinde değişikliğe rastlanmazken, aşı ka�ak mutantı olarak bildirilmiş olan Q129R mutasyonu saptanmıştır14.

�alışma grubumuzda HBsAg ve anti-HBs birlikte pozitif bulunan �rneklerin (B.2 grubu) elde edildiği hastalardan sadece birinin (hemodiyaliz hastası) HBV aşısı ve hepsinin anti-HBc pozitif olduğu g�zlenmiştir. Bu gruptaki �rneklerde yapılan dizi analizlerinde preS1 b�lgesinde altı, preS2 b�lgesinde on, S b�lgesinde 13 olmak �zere toplam 29 aa değişikliğine rastlanmıştır. Sekizi MHR'de olan değişikliklerin beşi "a" determinantında g�zlenmiştir. Q54R HBsAg ve anti-HBs birlikte pozitif olan �rneklerden23, L109M HIV ile enfekte gizli HBV enfeksiyonlu kan don�r�nde24, S114A imm�noprofilaksiye rağmen perinatal enfeksiyonlu bir �ocukta25, T131N ve M133T anti-HBs pozitif (aşılı veya doğal yolla) hastalarda23, Y134N ise gizli HBV enfeksiyonlu hastalarda bildirilmiştir1. Q129H ve Q129R aşı ka�ak mutantı olarak bilinmektedir14,15,22. PreS1 ve preS2 gen b�lgeleri, viral genomun en fazla değişkenlik g�r�len b�lgelerindendir ve bu nedenle nokta mutasyonları, delesyonlar ve insersiyonlar kronik hepatit B'li hastalarda sık olarak g�r�lmektedir1. Bu varyantlar i�inde M proteini defektif olanlar en sık� g�r�len gruptur1. PreS1'in 3' ve preS2'in 5' ucuna k�melenmiş olarak bulunan b�y�k �er�eve delesyonları �zellikle hepatopatogenez ile ilişkilendirilmiştir. �alışmamızda �� �rnekte preS2/S promotor b�lgesine denk gelen delesyon saptanmış; ve �rneklerde HBsAg saptamada herhangi bir sorun� yaşanmamıştır. C grubundaki (karaciğer transplantasyonu sonrası reenfeksiyon g�steren) �rneklerin t�m�nde preS2/S promoter b�lgesinde, bir �rnekte CCAAT kutusunda mutasyon saptanmıştır. PreS2/S promotor b�lgesindeki CCAAT kutusu SHBs/LHBs oranının y�ksek d�zeyde korunmasını sağlamaktadır. �zellikle CCAAT kutusundaki mutasyonların LHBs'in endoplazmik retikulum i�inde birikmesine ve ilerleyici kronik karaciğer hastalığına neden olduğu d�ş�n�lmektedir1,19. �� �rnekte ikisi preS2 başlama kodonuna denk gelen preS2 b�lgesinde delesyon saptanmıştır. �alışmamızda preS2 gen b�lgesinde en sık� olarak saptadığımızP41H �lkemizde ve yurtdışı �alışmalarda da� tespit edilmişve bu sonu� varyant olarak değerlendirilmiştir9,26.

HBV y�zey proteinleri hem B hem de T h�cre epitoplarını i�ermektedir. CD4+ yardımcı T ve B h�crelerin birbirini etkilemesi nedeniyle T h�cre epitopları teorik olarak anti-HBs profilini etkileyebilmektedir22. S gen b�lgesinin 28-51. aa'leri arasında T h�cre epitopu yer almaktadır. �alışmamızda T h�cre epitopunda; N40S mutasyonu iki inaktif HBV taşıyıcısına ait �rnekte, L49R A, B ve C grubundan birer olguda g�r�lm�şt�r. İzole anti-HBc� pozitifhastanın �rneğinde V47A mutasyonu saptanmıştır. Akut hepatitte "a" determinantında mutasyon� nadir olarak g�r�lmektedir27. �alışmamızda da serokonversiyon d�nemindeki HBV DNA pozitif �� hastanın olduğu D grubunda S gen b�lgesinde bir �rnekte sadece Q30K mutasyonu tespit edilmiştir.��

MHR ve "a" determinantındaki değişiklikler daha �ok aşı veya tanısal ka�ak mutantlarıyla ilişkilidir. �alışmamızda da MHR b�lgesinde aa değişikliği saptanan �rnek sıklığı en y�ksek olarak; alışılmış dışı HBV serolojik profili olanlar (B grubu) ve karaciğer transplantasyonu sonrası re-enfeksiyon olan hastaların �rneklerinde (C grubu) tespit edilmiştir (Tablo II). Yirmi farklı �lkeden elde edilen �ok geniş �rnek grubunun HBsAg MHR b�lgesinin y�ksek� duyarlılığa sahip ultradeep dizileme mutasyon analizi kullanılarak incelendiği �alışmada �rneklerin %72.8'inde 345 farklı aa mutasyonu g�sterilmiş ve 62 yeni mutasyon bildirilmiştir. Geniş bir literat�r taramasının da yapıldığı �alışmada, MHR mutasyonu taşıyan HBV enfeksiyonlu hasta� sayısınınortalama %26.4 olduğu, belirlenmiş ve ayrıca bu �alışmada T�rkiye'de� yapılan �alışmalardan elde edilen�� farklı� sıklık (%46.0, %27.2 ve %8.3) da belirtilmiştir16. Bizim �alışmamızda t�m hastalarda saptanan� %41.1 MHR g�r�lme sıklığı ortalamadan y�ksek (Tablo II) olarak g�zlenmiştir. MHR g�r�lme sıklığı �zellikle atipik serolojik profilin g�zlendiği grupta daha da y�ksek (%61.5) olarak saptanmıştır. Bu durum �alışma grubumuzda imm�n ve tanısal ka�ak mutantların bulunması ile a�ıklanabilir.

HBV re-enfeksiyonunu �nlemek i�in KC transplantasyonu sonrasında alıcı hastalara yaygın olarak HBIG tedavisi verilmektedir. Uzun ve tekrarlanan HBIG tedavisi sonrasında S gen mutasyonlarının ortaya �ıkması beklenmektedir. Protzer-Knolle ve arkadaşları28 144 ve 145. kodondaki mutasyonların; baskın olduğunu,� kronik enfeksiyonlar yaptığını ve k�t� klinik tablolar ve re-enfeksiyonla ilişkili olduğunu bildirmiştir. �alışmamızda C grubundaki (karaciğer transplantasyonu sonrası re-enfeksiyon g�r�len hastalar) �rneklerden yapılan dizi analizlerinde S gen b�lgesinde �oğu �nceden� g�zlenmiş 17 (I4F, F8L, F20S, L49R, Q54R, C76Y, Y100F, Q101R, I110L, S113N, T118K, T118A, P120T, T126I, Q129H, S143T, G145R) amino asit değişiklikleri saptanmıştır.

Sonu� olarak, �alışılan pop�lasyonda preS/S mutasyonları bulunmaktadır; tanısal veya imm�n ka�ak olarak d�ş�n�len �rneklerde HBV genomu S b�lgesinde; MHR ve "a" determinant b�lgelerinde aa değişiklik� d�zeyi �ok fazla g�r�lmektedir. HBsAg testlerinin kullanımında mutant saptama �zellikleri değerlendirilmelidir. Mutasyonların viral replikasyon ve konak h�cre �zerine etkisinin belirlenebilmesi i�in viral b�lge-mutagenez, transfeksiyon ve fenotipik �alışmalara gereksinim olduğu g�r�lmektedir.

KAYNAKLAR

  1. Pollicino T, Cacciola I, Saffioti F, Raimondo G. Hepatitis B virus preS/S gene variants: Pathobiology and clinical implications. J Hepatol 2014; 61(2): 408-17.
  2. Coleman PF. Detecting hepatitis B surface antigen mutants. Emerg Infect Dis 2006; 12(2): 198-203.
  3. Gerlich WH. Diagnostic problems caused by HBsAg mutants - A consensus report of an expert meeting. Intervirology 2004; 47(6): 310-3.
  4. Echevarr�a JM, Avell�n A. Hepatitis B virus genetic diversity. J Med Virol 2006; 78 (Suppl 1): S36-42.
  5. Stuyver L, De Gendt S, Van Geyt C, et al. A new genotype of hepatitis B virus: complete genome and phylogenetic relatedness. J Gen Virol 2000; 81(Pt 1): 67-74.
  6. Lindh M, Andersson AS, Gusdal A. Genotypes, nt 1858 variants, and geographic origin of hepatitis B virus-large-scale analysis using a new genotyping method. J Infect Dis 1997; 175(6): 1285-93.
  7. Yang H, Westland CE, Delaney WE, et al. Resistance surveillance in chronic hepatitis B patients treated with adefovir dipivoxil for up to 60 weeks. Hepatology 2002; 36(2): 464-73.
  8. Sert�z RY, Erensoy S, Pas S, �zacar T, Niesters HGM. Restriction fragment length� polymorphism analysis and direct sequencing for determination of HBV genotypes in a Turkish population. New Microbiol 2008; 31(2): 189-94.
  9. Bozdayı G, T�rkyılmaz AR, İdilman R, et al. Complete genome sequence and phylogenetic analysis of hepatitis B virus isolated from Turkish patients with chronic HBV infection. J Med Virol 2005; 76(4): 476-81.
  10. Sayıner AA, �zcan A, Şeng�n�l A. Naturally occurring MHR variants in Turkish patients infected with hepatitis B virus. J Med Virol 2008; 80(3): 405-10.
  11. Scheiblauer H, Soboll H, Nick S. Evaluation of 17 CE-marked HBsAg assays with respect to clinical sensitivity, analytical sensitivity, and hepatitis B virus mutant detection. J Med Virol 2006; 78(Suppl 1): S66-70.
  12. Raza A, Mehmood K, Begum F, et al. Immunological profiling of hepatitis B virus surface gene in Pakistan. Novus International J Biotechnology Bioscience 2012; 1(2): 1-10.
  13. Zaaijer HL, Torres P,Onta��nA, et al. Multiple surface antigen mutations in five blood donors with occult hepatitis B virus infection. J Med Virol 2008; 80(8): 1344-9.
  14. Coppola N, Onorato L, Minichini C, et al. Clinical significance of hepatitis B surface antigen mutants. World J Hepatol 2015;7(27): 2729-39.
  15. de Almeida RW, do Amaral Mello FC, Vasconcelos Menegoy I, et al. Detection and molecular characterisation of a diagnosis escape variant associated with occult hepatitis B virus in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 2017; 112(7): 485-91.
  16. Gencay M, Hu�bner K, Gohl P, et al. Ultra-deep sequencing reveals high prevalence and broad structural diversity of hepatitis B surface antigen mutations in a global population. PLoS One 2017; 12(5): e0172101.
  17. Sayan M, Şent�rk �, Akhan S, H�lag� S, �ekmen MB. Monitoring of hepatitis B virus surface antigen escape mutations and concomitantly nucleos(t)ide analogues resistance mutations in Turkish patients with chronic hepatitis B infection. Int J Infect Dis 2010; 14(Suppl 3): e136-41.
  18. Sayan M, �avdar C, Doğan C. Naturally occurring polymerase and surface genes variants of hepatitis B virus in Turkish hemodialysis patients with chronic hepatitis B. Jpn J Infect Dis 2012; 65(6): 495-501.
  19. Bock CT, Kubicka S, Manns MP, Trautwein C. Two control elements in the hepatitis B virus S-promoter are important for full promoter activity mediated by CCAAT-binding factor. Hepatology 1999; 29(4): 1236-47.
  20. Gerlich WH, Glebe D, Sch�ttler CG. Deficiencies in the standardization and sensitivity of diagnostic tests for hepatitis B virus. J Viral Hepat 2007; 14 (Suppl 1): 16-21.
  21. Carman WF. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus. J Viral Hepat 1997; 4(Suppl 1): 11-20.
  22. Cooreman MP, Leroux-Roels G, Paulij WP. Vaccine and hepatitis B immune globulin-induced escape mutations of hepatitis B virus surface antigen. J Biomed Sci 2001; 8(3): 237-47.
  23. Cha YJ. Detection of hepatitis B virus surface antigen mutants. Korean J Lab Med 2005; 25(6): 442-7.
  24. Liu Y, Zeng P, Wang J, et al. Hepatitis B virus infection in a cohort of HIV infected blood donors and AIDS patients in Sichuan, China. J Transl Med 2014; 12(1): 164.
  25. Kitab B, El Feydi A E, Afifi R, et al. Hepatitis B genotypes/subgenotypes and MHR variants among Moroccan chronic carriers. J Infect 2011; 63(1): 66-75.
  26. Pollicino T, Raffa G, Costantino L, et al. Molecular and functional analysis of occult hepatitis B virus isolates from patients with hepatocellular carcinoma. Hepatology 2007; 45(2): 277-85.
  27. Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus: clinical and diagnostic impact. J Clin Virol 2005; 32(2): 102-12.
  28. Protzer-Knolle U, Naumann U, Bartenschlager R, et al. Hepatitis B virus with antigenically altered hepatitis B surface antigen is selected by high dose hepatitis B immune globulin after liver transplantation. Hepatology 1998; 27(1): 254-63.

İletişim (Correspondence):

Prof. Dr. Selda Erensoy,

Ege �niversitesi Tıp Fak�ltesi

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

Bornova, İzmir, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 232 390 2981,

E-posta (E-mail): selda.erensoy@ege.edu.tr

Yazdır