Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2019; 53(3): 274-284

Endokarditli Bir Olgudan Coxiella burnetii'nin T�rkiye'de İlk İzolasyonu;
Antijen �retimi ve Faz Değişimi �alışması

First Isolation of Coxiella burnetii in Turkey from a Patient with Endocarditis;
Antigen Production and Phase Change Study

Bekir �ELEBİ1, B�lent BAŞ2, Elif AG�LOĞLU BALİ3, Serap ŞİMŞEK YAVUZ3

1 Sağlık Bakanlığı, Halk Sağlığı Genel M�d�rl�ğ�, Zoonotik ve Vekt�rel Hastalıklar Dairesi Başkanlığı, Ankara.

1 Ministry of Health, General Directorate of Public Health, Zoonotic and Vector-borne Diseases Department, Ankara, Turkey.

2 Ankara �niversitesi Veteriner Fak�ltesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

2 Ankara University Faculty of Veterinary Medicine, Department of Microbiology, Ankara, Turkey.

3 İstanbul �niversitesi İstanbul Tıp Fak�ltesi, Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul.

3 Istanbul University Istanbul Faculty of Medicine, Department of Infectious Diseases and Clinical Microbiology, Istanbul, Turkey.

Makale Atıfı: �elebi B, Baş B, Ag�loğlu Bali E, Şimşek Yavuz S. Endokarditli bir olgudan Coxiella burnetii'nin T�rkiye'de ilk izolasyonu; antijen �retimi ve faz değişimi �alışması. Mikrobiyol Bul 2019;53(3):274-284.

�Z

Coxiella burnetii, zoonotik bir enfeksiyon olan Q ateşinin etiyolojik etkenidir. Gram-negatif, pleomorfik, kokobasil şeklinde, konak h�crenin fagolizozomlarında �reme yeteneğine sahip olan bir bakteridir. Morfolojik olarak, k���k h�creli varyantı ve b�y�k h�creli varyantı olmak �zere iki h�cre tipine sahiptir. C.burnetii h�cre duvarındaki LPS yapısına g�re serolojik olarak faz I ve faz II varyantı olarak da ikiye ayrılmaktadır. Faz I, enfekte hayvanlarda ve insanlarda bulunan doğal fazdır ve olduk�a vir�landır. Faz II ise vir�lan değildir ve sadece h�cre k�lt�rlerinde veya embriyonlu tavuk yumurtası k�lt�rlerinde seri pasajlardan sonra laboratuvarlarda elde edilebilir. Akut Q ateşi, insanların %50'sinde asemptomatik seyrederken, semptomatik seyrettiği kişilerde en sık grip benzeri klinik tablo, atipik pn�moni ve hepatit ile kendini g�stermektedir. Olguların k���k bir kısmında hastalık kronikleşebilir, kronik Q ateşinde en sık g�r�len klinik tablo endokardittir. Bu �alışmada, C.burnetii faz I varyantından, faz değişimi �alışması yapılarak C.burnetii faz II varyantı elde edilmesi ama�lanmıştır. �alışmamızda, endokardit tanısı alan bir hastanın kalp kapak�ığı dokusundan, h�cre k�lt�r� y�ntemi ile C.burnetii izolasyonu yapılmıştır. İzole edilen suştan indirekt floresan antikor testi (IFAT) i�in C.burnetii faz I antijeni hazırlanmıştır. C.burnetii izolasyonu ve tanımlanması i�in takip eden işlemler uygulanmıştır. Kalp kapak�ığı dokusu homojenize edilmiş ve doku ekstraksiyon kiti ile DNA ekstraksiyonu yapılmıştır. Doku DNA'sında ger�ek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-PCR) y�ntemi ile C.burnetii PCR pozitif bulunmuştur. C.burnetii PCR pozitif doku �rneği, Vero h�cre k�lt�r�ne shell vial santrif�gasyon y�ntemi ile inok�le edilmiştir. Bir hafta ink�basyondan sonra kaldırılan Vero h�creleri IFAT lamlarına fikse edilmiş ve C.burnetii faz I IgG pozitif serum kullanılarak IFAT �alışılmıştır. Mikroskobik alanda, Vero h�crelerinde �remiş ve h�crelerin etrafını sarmış elma yeşili renkte bakteriler g�zlenmiştir. Enfekte h�creler dondurma ve ��zme işlemi ile par�alanarak bakteri s�spansiyonu elde edilmiştir. Bakteri s�spansiyonundan elde edilen DNA tekrar C.burnetii Rt-PCR �alışılarak PCR sonucu pozitif belirlenmiş ve klinik �rneğe g�re daha erken siklusda pozitiflik tespit edilerek �reme doğrulanmıştır. İzolatımızdan elde edilen DNA ile 27F ve 1492R primerleri kullanılarak Coxiella 16S ribozomal RNA b�lgesi PCR uygulanmış ve PCR �r�n�n DNA dizi analizi yapılarak elde edilen n�kleotit dizileri GenBank'ta referans n�kleotit dizileri ile karşılaştırılmıştır. İzolatımızın 16S ribozomal RNA n�kleotit dizilişi, erişim numarası NR104916 olan Coxiella burnetii suşu ATCC VR-615 ile %99 benzer bulunmuştur. Kalp kapak�ığından izole ettiğimiz C.burnetii izolatımız 16S ribozomal RNA dizi analizi ile de doğrulanmıştır. Suştan seri h�cre k�lt�r� pasajları yapılarak C.burnetii faz I varyantından C.burnetii faz II varyantı elde edilmeye �alışılmıştır. Her pasajdan sonra C.burnetii faz I ve faz II IgG pozitif serumlar ile IFAT uygulanarak faz değişimi g�zlenmeye �alışılmıştır. Seri olarak yapılan 17 h�cre k�lt�r� pasajı sonunda faz değişimi g�zlenmemiştir. Elde edilen bakteri s�spansiyonlarından C.burnetii faz I IFAT antijeni hazırlanmıştır. Bu �alışmada, �lkemizde ilk defa endokarditli bir hastanın kalp kapak�ığından h�cre k�lt�r� y�ntemiyle C.burnetii izolasyonu ve izolatın molek�ler, serolojik y�ntemlerle tanımlanması sunulmuştur.

Anahtar kelimeler: Coxiella burnetii; endokardit; h�cre k�lt�r�.

ABSTRACT

Coxiella burnetii is the causative agent of Q fever, a zoonotic infection. The bacteria is a gram-negative, pleomorphic, coccobacilli and capable to survive and proliferate within the host cell's phagolysosome. There are two morphological cell types of C.burnetii including small and large cell variants. C.burnetii is divided into phase I and phase II serologically variants according to LPS structure in the cell wall. Phase I is the natural phase found in infected animals or humans and is highly infectious. Phase II is not very infectious and could be obtained only in laboratories after serial passages in cell cultures or embryonated egg cultures. Q fever can be asymptomatic (in 50% of the cases), acute or chronic. Major presentations of acute Q fever are flu-like illness, pneumonia, and hepatitis, whereas the chronic form presents mainly as infective endocarditis. The aim of this study was to obtain C.burnetii phase II variant from C.burnetii phase I variant by a phase change study. In this study, C.burnetii was isolated by cell culture method from the heart valve tissue of a Q fever endocarditis case. C.burnetii phase I antigen for the indirect fluorescent antibody test (IFAT) was prepared from the isolated strain. For the isolation and identification of C.burnetii, heart valve tissue of the patient was homogenized and DNA was extracted by tissue extraction kit. C.burnetii DNA in the valve tissue was determined by real-time PCR (Rt-PCR). This C.burnetii DNA positive specimen was inoculated into Vero cells by shell vial centrifugation method. The scraped Vero cells were fixed on the slides after one week of incubation and IFAT was performed using C.burnetii phase I IgG positive sera, bacteria that were grown in and surrounding the Vero cells stained apple green were determined microscopically. Infected cells were disrupted by freeze and thaw method to obtain bacterial suspension. The DNA obtained from the bacterial suspension was again found to be positive for C.burnetii by Rt-PCR. Isolation sample was found to be positive in PCR at an earlier cycle compared to heart tissue sample, thus the bacterial growth was also confirmed with PCR. 16S ribosomal RNA gene of our isolate was amplified by PCR using 27F and 1492 primers and then sequenced. The DNA sequences were compared with reference DNA sequences of GeneBank; and the nucleotide sequence of the 16S ribosomal RNA gene of our isolate was found to be 99% similar to C.burnetii strain ATCC VR-615 an accession number NR104916. Serial cell culture passages of the isolated strain were performed to obtain C.burnetii phase II variant from C.burnetii phase I variant. After each passage, presence of phase change was investigated by IFAT using C.burnetii phase I and phase II IgG positive sera. At the end of 17 cell culture passages, phase change could not be observed. C.burnetii phase I IFAT antigen was prepared from the obtained bacterial suspension. In this study, we presented the isolation and identification of C.burnetii by cell culture, molecular and serological methods from the heart valve of a patient with endocarditis for the first time in our country.

Keywords: Coxiella burnetii; endocarditis; cell culture.

Geliş Tarihi (Received): 25.02.2019 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 24.05.2019

GİRİŞ

Coxiella burnetii, Legionellales takımında, Coxiellaceae ailesinde, gram-negatif, pleomorfik, kokobasil şeklinde, konak h�crenin fagolizozomlarında �reme yeteneğine sahip bir bakteridir. K���k h�creli varyantı ve b�y�k h�creli varyantı olmak �zere morfolojik olarak iki h�cre tipine sahiptir1. C.burnetii'nin k���k h�cre varyantı, h�cre dışında uzun s�re canlı kalmasını sağlayan, �evresel koşullara dayanıklı bir yapıya d�n�şm�ş halidir. K���k h�cre varyantı, enfekte h�cre fagozomunda �reme fazında b�y�k h�cre varyantına d�n�ş�r ve �evresel şartlara dayanıklı değildir. C.burnetii k���k h�cre varyantı, �evresel etkilere karşı dayanıklı olması, k���k yapısı (0.2-0.4 �m genişlik, 0.4-1.0 �m uzunluk) ile kolay aerosolize olması ve hava yolu ile kolay taşınması nedeniyle solunum yoluyla bulaşta �nemlidir2,3. C.burnetii'nin vir�lans fakt�rleri, konak h�cre i�inde �reyebilmeleri ve h�cre duvarındaki lipopolisakkarit (LPS) yapısıdır. C.burnetii h�cre duvarındaki LPS yapısına g�re serolojik olarak faz I ve faz II varyantı olarak da ikiye ayrılmaktadır. C.burnetii faz I, konak�ıları i�in vir�lanken C.burnetii faz II avir�landır. Faz I vir�lan form h�cre k�lt�r�ne ve embriyonlu tavuk yumurtasına seri pasajlarda, bakteri genomundaki delesyona bağlı, LPS yapısında kayıplar sonucunda avir�lan C.burnetii faz II varyantına d�n�şmektedir4,5. C.burnetii faz II varyantında LPS yapısındaki değişim, etkeni komplemana karşı duyarlı hale getirirken, C.burnetii faz I komplemanın membran atak kompleksine diren�li durumda kalmaktadır. Ayrıca faz I varyantındaki LPS, C.burnetii'nin y�zey protein epitoplarına antikorların bağlanmasını engellemektedir6.

C.burnetii, zoonotik bir enfeksiyon olan Q ateşinin etkenidir. Q ateşi ilk defa 1936'da Avustralya'da mezbahane �alışanlarında tanımlanmıştır. Akut Q ateşi, insanların %50'sinde asemptomatik seyrederken, semptomatik seyrettiği kişilerde en sık grip benzeri klinik tablo, atipik pn�moni ve hepatit ile kendini g�stermektedir. Olguların k���k bir kısmında hastalık kronikleşebilir, kronik Q ateşinin en sık klinik g�r�n�m� endokardit olarak bildirilmiştir. Akut olgularda ink�basyon d�nemi etkenin alınan dozuna bağlı olarak birka� g�n ile birka� hafta arasında değişirken, kronik olgular aylar sonra g�zlenebilmektedir1.

C.burnetii, koyun, ke�i, sığır gibi hayvanların idrar, dışkı, s�t, doğum atıkları (plesanta, amniyotik sıvı) ve abort atıkları ile �evreye yayılmaktadır. Bakteri kurumaya dayanıklı olduğu i�in hayvan barınaklarındaki g�bre ve toza karışarak aylarca canlı kalabilmektedir. C.burnetii, kontamine toz ve aerosollerin solunum yolu ile alınması ile insanlara bulaşmakta ve enfeksiyon oluşmasına neden olmaktadır. Ayrıca keneler de C.burnetii'nin vekt�r� konumundadır. Keneler kan emmeleri sırasında veya dışkıları ile etkeni bulaştırır ve yayarlar7,8.

Q ateşinin tanısında seroloji, molek�ler ve k�lt�rel y�ntemler kullanılmaktadır. Serolojide altın standart test olarak indirekt floresan antikor testi (IFAT) uygulanmaktadır. Kompleman fiksasyon ve "Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" testleri de tanıda kullanılmaktadır. Molek�ler testlerden polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile klinik �rneklerde C.burnetii DNA'sı belirlenebilmektedir. H�cre k�lt�rlerine veya embriyonlu tavuk yumurtalarına ekimler yapılarak etken �retilmektedir. C.burnetii'nin �retilmesi i�in sıvı ve katı k�lt�r ortamı sağlayan ACCM besiyerinde geliştirilmiştir9.

Bu �alışmada, �lkemizde ilk defa endokarditli bir hastanın kalp kapak�ığı dokusundan h�cre k�lt�r� y�ntemiyle C.burnetii izolasyonu, molek�ler, serolojik y�ntemlerle izolatın tanımlanması, elde edilen izolattan faz I IFAT antijeni hazırlanması ve faz değişimi �alışması sunulması ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

Kardiyopulmoner egzersiz dispnesi ve subfebril ateş nedeniyle 35 yaşındaki erkek hasta enfeksiyon hastalıkları kliniğine başvurmuştur. Yapılan muayene ve tetkiklerde bik�spit aort kapak, hafif-orta aort stenozu ve hafif-orta reg�rjitasyonu g�zlenmiştir. Transtorasik ve trans�zofageal ekokardiyografide (TTE) aort k�spisi �zerinde bir vejetasyon belirlenmiştir. Y�ksek doz di�retik ve nitrogliserin tedavisine karşın hastada kalp yetmezliği gelişmesi sonucunda acil olarak aort kapak replasmanı ameliyatı yapılmıştır10. Klinik olarak enfektif endokardit d�ş�n�len ve serolojik olarak C.burnetii faz I IgG 1/32.768 titrede pozitif bulunarak kronik Q ateşi endokarditi tanısı konulan hastanın, kalp kapak replasmanı ameliyatı sırasında �ıkarılmış olan kalp kapak�ığı dokusu laboratuvarımıza g�nderildi. Kalp kapak�ığı dokusu aşağıda a�ıklanan işlemler sonunda h�cre k�lt�r� yapılmak �zere işleme alındı.

Doku Homojenizasyonu, DNA Ekstraksiyonu ve Ger�ek Zamanlı PCR

Bir par�a kalp kapak�ığı dokusu, beyin kalp inf�zyon buyyonu i�ine alınarak Magnalyser homojenizasyon cihazında (Roche, Rotkreuz. İsvi�re) homojenize edildi. Homojenizasyondan 100 �l alınarak doku ekstraksiyon kiti (Qiagen, Hilden, Almanya) kullanılarak DNA ekstraksiyonu yapıldı.

C.burnetii ompA gen b�lgesini belirlemede Jaton ve arkadaşlarının11 2013 yılında bildirdiği COX primerleri, probu ve protokol� kullanılarak Rt--PCR �alışıldı. PCR, LightCycler probe master miks (Roche, Mainnheim Almanya) kullanılarak, LightCycler96 (Roche, Mainnheim Almanya) Rt- PCR cihazında uygulandı.

H�cre K�lt�r�

Gouriet ve arkadaşlarının12 �nerdiği h�cre k�lt�r� protokol� aşağıda tarif edildiği gibi uygulanarak PCR pozitif kalp kapak�ığı dokusu �rneği h�cre k�lt�r�ne alındı. Vero (ATTC CCL-81) h�creleri antibiyotikli (penisilin, streptomisin) Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ve %5 fetal sığır serum (FBS) i�eren viallere pasajlandı ve monolayer h�cre oluşturmaları sağlandı. Monolayer h�cre oluşturulan viallere C.burnetii PCR pozitif kalp kapak�ığı dokusu homojenizatından 100 �l inok�le edildi. İnok�lumdaki bakterileri monolayer oluşturmuş h�crelere yaklaştırmak i�in h�cre vialleri 1 saat 700x g'de santrif�j edildi. Bir g�n 36oC'de %5 CO2'li et�vde ink�basyona bırakıldı. Birinci g�nde k�lt�r vasatı %5 FBS i�eren antibiyotiksiz DMEM ile değiştirildi ve bir hafta ink�basyona bırakıldı. İnk�basyondan sonra enfekte h�creler kazınarak toplandı ve iyice s�spanse edildi. Enfekte h�cre s�spansiyonundan 10 �l alınarak IFAT lamlarına kaplandı, kurutulduktan sonra asetonla fikse edildi ve C.burnetii faz I imm�nglobulin G (IgG) pozitif serum (Vircell, Granada, İspanya) kullanılarak IFAT ile h�crelerde �reme olup olmadığı kontrol edildi. H�cre s�spansiyonundan DNA ekstraksiyonu yapıldı Rt-PCR �alışıldı.

16S Ribozomal RNA PCR ve DNA Dizi Analizi

İzolatımızdan elde edilen DNA'dan, 27F ve 1492R primerleri kullanılarak Coxiella 16S ribozomal RNA b�lgesi PCR'ı �alışıldı13. DNA dizi analizi i�in PCR amplifikasyon �r�nlerini saflaştırma işlemi, "ExoSAP-IT� PCR Product Cleanup Reagent (ThermoFisher Scientific, ABD)" ticari kiti ile firma �nerilerine uygun şekilde ger�ekleştirildi. ABI 3730XL Sanger dizileme cihazı (Applied Biosystems, Foster City, CA) ve BigDye Terminator v3.1 Cycle Dizileme (Applied Biosystems, Foster City, CA) kiti kullanılarak �ift y�nl� n�kleotit dizisi elde edildi. DNA dizi analizi verileri Basic Local Alignment Search Tool (Blast version 2.0) programı kullanılarak GenBank verileri ile karşılaştırıldı.

Filogenetik Analiz ve Ağa� Oluşturulması

Filogenetik analiz ve ağa� oluşturulması amacıyla "Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5 (MEGA5)" programı kullanıldı. Filogenetik ağa� oluşturmak i�in maximum likelihood y�ntemi, istatistiksel filogeni g�venirliliğini ortaya koymak i�in Bootstrap metod, Kimura 2 parameter model uygulandı.

Coxiella burnetii IFAT Antijeni Hazırlanması ve Faz Değişimi �alışması

IFAT antijeni hazırlamada Dupont ve arkadaşlarının14 1994'te bildirdiği y�ntem bazı modifikasyonlar yapılarak uygulandı. �reme g�zlenen enfekte h�cre s�spansiyonundan 100 �l, tekrar Vero h�cre k�lt�r�ne inok�le edilerek bakteri �oğaltıldı. Enfekte h�crelerin vasatı ayrıldıktan sonra �zerine PBS eklenerek h�cre kazıyıcı ile kaldırıldı ve bir t�pe alındı. Enfekte h�creler, dondurma-��zd�rme ve ultrasonik banyoda sonikasyonla par�alanarak C.burnetii bakteri s�spansiyonu elde edildi. Bakteri s�spansiyonunda h�cre kalıntılarını uzaklaştırmak i�in s�spansiyon 1500 rpm'de 5 dakika santrif�j edildi ve bakteri i�eren s�pernatant ayrıldı. Bakteri i�eren s�pernatant �zerine formaldehit (%0.4) eklendi ve bir g�n oda sıcaklığında bekletilerek inaktive edildi. C.burnetii bakteri s�spansiyonu, dil�syonları yapılırken y�ksek devirde vortekslendi ve bakterilerin otoagl�tinasyonunu engellemek i�in %1 yumurta sarısı eklendi. Her dil�syondan lam godelerine 2 �l bakteri s�spansiyonu bırakıldı, lamlar oda sıcaklığında kurutuldu ve ardından asetonla bakteriler lamlara fikse edilerek antijen kaplı lamlar elde edildi. IFAT, hazırlanan antijen kaplı lamlar ile Dupont ve arkadaşlarının14 �nerileri doğrultusunda �alışıldı. IFAT'da, mikroskobik alana tek tek d�şm�ş, homojen bakteri yoğunluğu g�steren dil�syon C.burnetii faz I antijen olarak kullanıldı.

C.burnetii faz I antijenik varyantın C.burnetii faz II antijenik varyanta d�n�ş�m�n� g�zlemek i�in izolat seri h�cre k�lt�r� pasajlarına alındı4. Her pasajdan sonra bakteri s�spansiyonundan seri dil�syonlar yapılarak IFAT lamlarına kaplama yapıldı. Her pasajdan sonra elde edilen antijen C.burnetii faz I ve faz II IgG pozitif serumlar (Vircell, Granada, İspanya) kullanılarak IFAT �alışılarak antijenik faz değişimi g�zlenmeye �alışıldı.

Bu �alışmada klinik �rneğin h�cre k�lt�r�ne inok�lasyonundan başlayan, h�cre k�lt�r� pasajları ve elde edilen antijenin inaktivasyon aşamasına kadar işlemler biyog�venlik d�zeyi 3 (BSL3) laboratuvarında ger�ekleştirildi.

BULGULAR

Kronik Q ateşi endokarditi tanısı konulan hastanın, kalp kapak replasmanı ameliyatı sırasında �ıkarılmış olan ve homojenize edilen kalp kapak�ığından elde edilen DNA, Rt-PCR'de C.burnetii y�n�nden pozitif bulunmuştur. Homojenize dokunun Vero h�cre k�lt�r�ne inok�lasyondan 7 g�n sonra mekanik olarak kaldırılan h�creler IFAT lamlarına kaplandıktan sonra C.burnetii faz I IgG pozitif serum kullanılan IFAT'ta, yoğun bakteri ile enfekte Vero h�creleri g�zlenmiştir (Resim 1).


Resim 1

Enfekte h�crelerden elde edilen DNA ile tekrar Rt-PCR �alışıldığında, kalp doku �rneğine g�re 12 siklus �nce pozitiflik belirlenmiştir. PCR ct değerine g�re, k�lt�r materyalindeki DNA miktarının artışıyla da �reme doğrulanmıştır (Şekil 1).


Şekil 1

İkinci pasaj yapılarak bir hafta sonra elde edilen enfekte h�cre s�spansiyonu -80�C' de dondurulup ��zd�rme ve sonikasyon yapılarak enfekte Vero h�creleri par�alanmış ve bakteri s�spansiyonu elde edilmiştir. Bu s�spansiyon seyreltilerek C.burnetii IFAT antijeni hazırlanmıştır. C.burnetii faz I ve faz II IgG pozitif serumla yapılan �alışmada C.burnetii faz I IgG pozitif, faz II IgG negatif olarak belirlenmiştir (Resim 2). İzolatın C.burnetii faz I antijenik varyant karakterinde olduğu g�zlenmiştir.


Resim 2

Bakteri s�spansiyonundan elde edilen DNA ile 16S ribozomal RNA b�lgesi PCR'ı �alışılmıştır. 27F ve 1492R primerlerinin kullanıldığı PCR'de elde edilen amplifikasyon �r�nlerinin �ift y�nl� DNA dizi analizinde 1320 baz �ifti (bp) b�y�kl�ğ�nde n�kleotit dizisi elde edilmiştir. Elde edilen n�kleotit dizisinin GenBank verileri ile karşılaştırıldığında erişim numarası NR104916 olan Coxiella burnetii ATCC VR-615 suşu ile %99 benzer bulunmuş ve iki n�kleotit farklılığı (566. baz pozisyonunda G-T ve 914. baz pozisyonunda C-T) g�zlenmiştir.

Filogenetik analizde, izolatlarımızın 16S ribozomal RNA b�lgesi dizisi ve Genbank kayıtlı tanımlanmış izolata ait dizi analizi verileri de kullanılarak, Mega5 programında maximum likelihood y�ntemi ile oluşturulan filogenetik ağa�ta, filogeni g�venilirlik değerini g�steren bootstraps değeri %100 bulunmuştur (Şekil 2). İzolatımızın, filogenetik analize g�re de C.burnetii olduğu ortaya konulmuştur.


Şekil 2

C.burnetii faz I izolatı, faz II varyantına d�n�şt�rmek i�in seri h�cre k�lt�r� pasajları yapılmış ve her pasaj sonrasında hazırlanan antijen ile C.burnetii faz I ve faz II IgG pozitif serumla IFAT �alışılmıştır. Seri pasajlar 17. pasaja kadar devam ettirilmiş her pasaj sonunda C.burnetii faz I IgG reaksiyon pozitif, faz II IgG reaksiyon negatif belirlenmiştir. İzolatımızda 17 pasaj sonunda faz II değişimi g�zlenmemiştir.

TARTIŞMA

�lkemizde Q ateşine y�nelik ilk �alışma Sabahattin Payzın ve Sait Bilal Golem tarafından 1948 yılında yapılmıştır15. Bu �alışmada �lkemizdeki akut Q ateşi olguları incelenmiş ve hasta kan ve serumlarının deney hayvanına inok�lasyonu ile C.burnetii izolasyonu bildirilmiştir. Sonraki yıllarda, insanlarda ve hayvanlarda bir�ok seroepidemiyolojik �alışma yapılmış C.burnetii'nin �lkemizde yaygın olduğu ortaya konulmuştur1. Son yıllarda molek�ler �alışmaların laboratuvar kullanımına daha �ok girmesi ile hayvanlarda ve insanlarda C.burnetii PCR pozitifliği g�r�lmektedir16-19. Payzın ve arkadaşlarının izolasyon �alışmalarından15 sonraki 70 yıllık s�re� i�erisinde C.burnetii'nin insanlardan izolasyonuna y�nelik bir �alışmaya rastlanamamıştır. Bu �alışmada �lkemizde ilk defa enfektif endokardit tanısı konan bir hastanın kalp kapak�ığından h�cre k�lt�r� y�ntemi ile C.burnetii izolasyonu yapılmıştır. İzolat 16S ribozomal RNA b�lgesinin DNA dizi analizi ve C.burnetii faz I ve faz II IgG pozitif serum kullanarak IFAT ile tanımlanmıştır.

Shell vial h�cre k�lt�r y�ntemi, ge� ve g�� �retilen h�cre i�i bakterilerin izolasyonunda kullanılan bir y�ntemdir12. �lkemizde bu y�ntem kullanılarak C.burnetii izolasyonuna y�nelik bir bildirime rastlanamamıştır. Enfektif endokardit etkenlerinden ge� ve g�� �retilebilen bakteriler olan C.burnetii ve Bartonella spp. otomatize kan k�lt�r� sistemlerinde �retilememektedir. Kan k�lt�r� negatif enfektif endokardit olgularında etken olabildiği bilinen C.burnetii'nin, bu hastalarda esas olarak serolojik y�ntemlerle (Coxiella faz I IgG) araştırılması �nerilmekle birlikte, shell vial h�cre k�lt�r� y�ntemi de �zellikle referans laboratuvarlarda bu bakterinin �retilmesi i�in kullanılabilecek bir y�ntemdir.

İnsanlarda akut Q ateşinde en sık rastlanan klinik tablolar grip benzeri hastalık, atipik pn�moni ve hepatittir. Olguların bir kısmı asemptomatik seyrederken, %90'ında sınırlı d�zeyde ateş, baş ağrısı (%51), kas ağrısı (%37), eklem ağrısı (%27) ve �ks�r�k (%34) g�zlenmektedir20. En sık g�r�len bulgular ateş, pulmoner belirtiler ve y�ksek karaciğer enzim seviyesidir. Atipik pn�moni en �ok g�r�len klinik tablodur. Dermatolojik lezyonlar genelde d�ş�n�lenden daha yaygındır, ge�ici d�k�nt�ler, mak�lopap�ler lezyonlar ve daha nadiren eritema nodozum g�zlenmektedir8. Akut Q ateşi olgularının %2'si kronik forma d�n�ş�r, kronik Q ateşinin en yaygın g�r�len klinik formu enfektif endokardittir21. Kronik Q ateşi klinik tablosu primer enfeksiyondan aylar sonra ortaya �ıkabilmektedir. Kronik Q ateşi riski taşıyan kişiler genellikle kalp kapak�ığı patolojisi veya vask�ler greftleri olan, imm�n sistemi baskılanmış hastalar ile hamile kadınlar olarak bildirilmektedir3. Kan k�lt�r� negatif endokarditli 348 olgunun %48'inin C.burnetii ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Bu hastaların %91'inde kalp kapak�ığı problemi, %32'sinde imm�n sistem baskılanması bilgisi elde edilmiştir22. �lkemizde C.burnetii'nin neden olduğu kronik endokardit olgusu ilk defa Şimşek-Yavuz ve arkadaşları19 tarafından 2016 yılında bildirilmiştir. Laboratuvarımızda, son beş yılda serolojik ve molek�ler y�ntemlerle, C.burnetii'nin neden olduğu, bu olgu dahil d�rt endokardit olgusu belirlenmiştir (yayınlanmamış veri). K�lt�r negatif enfektif endokardit olgularında C.burnetii'nin etiyolojik etken olabileceği dikkate alınmalı ve serolojik, molek�ler ve k�lt�r y�ntemleri kullanılarak kronik Q ateşi tanısı saf dışı bırakılmalıdır.

�lkemizde Q ateşi tanısında serolojik y�ntemler en �ok kullanılan tanı y�ntemidir1. Serolojide IFAT altın standart olarak kabul edilmektedir. Q ateşinin serolojik tanısında C.burnetii'nin iki antijenik yapısına karşı oluşan antikorların varlığına bakılmaktadır. C.burnetii faz I antikorlarının oluşmasından sorumlu antijenik yapı LPS-O antijeni iken C.burnetii faz II antikorlarının oluşmasında ise h�cre duvarı yapısındaki proteinlerdir. H�cre duvarı protein yapıları daha iyi antijenik karekterde olduğu i�in daha erken humoral yanıt oluşturmakta, buna karşın LPS yapılarına y�nelik humoral yanıt daha ge� oluşmaktadır3. Akut Q ateşi tanısında C.burnetii faz II IgM ve IgG antikorlarına, kronik Q ateşi tanısında C.burnetii faz I ve faz II IgG antikor varlığına bakılmaktadır. Faz I IgG antikor titresinin 1/800 titrede veya �zeri olması kronik enfeksiyon g�stergesi olarak değerlendirilirken yeni revizyon ile bu titrenin 1/1600 titre veya �zeri olması �nerilmektedir. Bununla birlikte faz I IgG titresinin faz II IgG titresi kadar veya �zerinde olması beklenmektedir23,24. Bu �alışmada, Q ateşinin serolojik tanısında altın standart test olan IFAT'ta kullanılmak �zere antijen hazırlanmıştır. Elde edilen izolat faz I antijenik �zelliğe sahip olduğu i�in bu izolattan hazırlanan antijen kronik Q ateşi tanısında kullanılabilir. �lkemizde Q ateşi tanısında kullanılan kit ve bu kitlerin antijeni yurt dışından temin edilmektedir. Elde edilen izolat ve antijen sayesinde, Q ateşinin tanısında kullanılacak kitlerin hazırlanması ve geliştirilmesi i�in �alışacak araştırmacılar i�in yerel bir kaynak oluşturulduğu d�ş�n�lmektedir.

C.burnetii faz I varyantı seri h�cre k�lt�r� ve embriyolu tavuk yumurtasına pasajlar sonucunda bakteri genomundaki delesyona bağlı h�cre duvarındaki LPS-O spesifik zincirinde bulunan virenoz ve dihidrohidroksistreptoz şeker molek�llerini kaybeder ve faz II avir�lan forma d�n�ş�r5. C.burnetii faz II avir�lan varyant, faz I antijenlerini barındırmadığı i�in, akut olgularda ilk oluşan faz II antikorlarını belirlemede antijen olarak kullanılması a�ısından �nemlidir. Kronik endokardit olgusundan izole ettiğimiz vir�lan C.burnetii faz I suşunu seri h�cre k�lt�r� pasajları ile C.burnetii faz II yapısına d�n�şt�r�p faz II antijeni elde edebilmek i�in izolatımızı seri 17 h�cre k�lt�r� pasajı yapılmıştır fakat faz II antijenik varyanta d�n�ş�m� serolojik olarak g�zlenememiştir. Ftacek ve arkadaşları embriyolu tavuk yumurtasına pasajla bu d�n�ş�m�n g�zlenmesi i�in 90 pasaj gerektiğini bildirmektedir25. Hotto ve arkadaşları26 h�cre k�lt�r� pasajları ile bazı suşların 15 pasajla faz değişimini g�sterdiğini, bazı suşların ise seri pasajlar sonrasında bu değişimi g�stermediğini g�zlemişlerdir. Bundan sonraki �alışmalarda yerel suş, embriyolu tavuk yumurtasına veya h�cre k�lt�rlerine daha fazla pasajlar yapılarak C.burnetii faz II varyantına d�n�şt�r�l�p, faz II antijeni elde edilmesi �lkemiz i�in gerekli olan antijen �retimi i�in faydalı olacaktır.

C.burnetii �evresel koşullara dayanıklıdır ve uzun s�re toz, g�bre gibi hayvansal atıklar i�erisinde canlılığını s�rd�rebilmektedir7. Morfolojik olarak k���k bir bakteri olması nedeni ile kolay aerosolize olarak insanları enfekte edebilir ve laboratuvar kaynaklı enfeksiyonlara da neden olabilmektedir. İnsanlar i�in enfektif doz 1-10 bakteri olarak bildirilmektedir27,28. Bakteri ayrıca biyoter�r ajanı olarak da değerlendirilmektedir1. C.burnetii bu �zelliklerinden dolayı halk sağlığı a�ısında risk oluşturmaktadır. Laboratuvar tanısında k�lt�r işlemleri BSL3 laboratuvarlarda yapılmalıdır. �lkemizde, Payzın ve arkadaşlarının ilk izolasyon �alışmalarının sonrasında laboratuvar kaynaklı Q ateşi olguları da bildirilmiştir29. Ayrıca bir�ok �lkede laboratuvar kaynaklı Q ateşi olgularının bildirimi yapılmıştır30. C.burnetii izolasyonu ve canlı bakterinin kullanıldığı �alışmalarda araştırmacılar laboratuvar kaynaklı enfeksiyon riskini g�z �n�nde bulundurmalı ve risk değerlendirmesi yaparak riski minimize etmelidir.

Payzın ve arkadaşlarının izolasyon �alışmasında31 İstanbul, Ankara, İzmir ve Aksaray izolatları elde edilmiş ve bu izolatlar daha sonraki serolojik �alışmalarda antijen olarak kullanılmıştır. Bu izolatlar, muhtemelen saklama koşullarının yeterli olmaması nedeniyle g�n�m�ze kadar ulusal k�lt�r koleksiyonlarında saklanıp korunamamıştır. Bu izolatlardan biri Amerika Birleşik Devletleri'nde bir k�lt�r koleksiyonunda bulunmaktadır. Bu �alışmada h�cre k�lt�r�nde �retilen, serolojik ve molek�ler y�ntemle tanımlanan C.burnetii faz I izolatı araştırmacıların kullanımına sunulmak �zere Halk Sağlığı Genel M�d�rl�ğ� Ulusal K�lt�r Koleksiyonuna teslim edilmiştir.�

�IKAR �ATIŞMASI

Yazarlar bu makale ile ilgili herhangi bir �ıkar �atışması bildirmemişlerdir.

KAYNAKLAR

  1. Kılı� S, �elebi B. T�rkiye'de C.burnetii'nin epidemiyolojisi. Turk Hij Den Biyol Derg 2008;65(3):1-31.
  2. McCaul TF, Williams JC. Developmental cycle of Coxiella burnetii: structure and morphogenesis of vegetative and sporogenic differentiations. J Bacteriol 1981;147(3):1063-76.
  3. Toman R, Heinzen RA, Samuel JE, Mege JL (Eds.) Coxiella burnetii: Recent Advances and New Perspectives in Research of the Q Fever Bacterium. 2012 1st ed Springer Dordrecht Heidelberg New York London.
  4. Toman R, Skult�ty L. Structural study on a lipopolysaccharide from Coxiella burnetii strain Nine Mile in avirulent phase II. Carbohydr Res 1996;22(283):175-85.
  5. Toman R, Skultety L, Ihnatko R. Coxiella burnetii glycomics and proteomics tools for linking structure to function. Ann N Y Acad Sci 2009;1166:67-78.
  6. Hackstadt T. Steric hindrance of antibody binding to surface proteins of Coxiella burnetii by phase I lipopolysaccharide. Infect Immun 1988;56(4):802-7.
  7. Tissot-Dupont H, Amadei MA, Nezri M, Raoult D. Wind in November, Q fever in December. Emerg Infect Dis 2004;10(7):1264-9.
  8. Raoult D, Marrie T, Mege J. Natural history and pathophysiology of Q fever. Lancet Infect Dis 2005;5(4):219-26.
  9. Eldin C, M�lenotte C, Mediannikov O, Ghigo E, Million M, Edouard S, et al. From Q fever to Coxiella burnetii infection: a paradigm change. Clin Microbiol Rev 2017:30(1):115-90.
  10. Sons�z MR, Bali EA, Aydoğan M, Mercanoglu F, Yavuz SŞ. Q ateşi endokarditi: Her zaman subakut veya kronik seyirli midir? Turk Kardiyol Dern Ars doi: 10.5543/tkda.2019.59153.
  11. Jaton K, Peter O, Raoult D, Tissot J-D, Greub G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect 2013:1:6-12.
  12. Gouriet F, Fenollar F, Patrice JY, Drancourt M, Raoult D. Use of shell-vial cell culture assay for isolation of bacteria from clinical specimens: 13 years of experience. J Clin Microbiol 2005;43(10):4993-5002.
  13. Miller CS, Handley KM, Wrighton KC, Frischkorn KR, Thomas BC, Banfield AF. Short-read assembly of full-length 16S amplicons reveals bacterial diversity in subsurface sediments. PLoS One 2013;8(2):e56018.
  14. Dupont HT, Thirion X, Raoult D. Q fever serology cut off determination for microimmunofluorescence. Clin Diagn Lab Immunol 1994;1(2):189-96.
  15. Payzın S, Golem SB. T�rkiye'de Q humması. T�rk İji Tec Biyol Der 1948;8(1):94-113.
  16. Kırkan S, Kaya O, Tekbıyık S, Parın U. Detection of Coxiella burnetii in Cattle by PCR. Turk J Vet Anim Sci 2008;32(3):215-20.
  17. K���kkalem �F, Cengiz S, Altun SK, Yıldırım M. Erzurum İlinde sığır abortlarında Coxiella burnetii'nin polimeraz zincir eeaksiyonu ile belirlenmesi. Ataturk Universitesi Vet Bil Derg 2013;8(3):224-8.
  18. G�naydın E, M�ştak HK, Sareyy�poğlu B, Ata Z. PCR detection of Coxiella burnetii in fetal abomasal contents of ruminants. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2015:21(1):69-73.
  19. Yavuz SS, �zbek E, Başaran S, �elebi B, Yılmaz E, Başaran M, et al. The first case of chronic Q fever endocarditis and aortitis from Turkey: A 5-year infection before diagnosis with drain in sternum. Anatol J Cardiol 2016;16(10):814-6.
  20. Tissot-Dupont H, Raoult D. Q fever. Infect Dis Clin North Am 2008;22(3):505-14.
  21. Angelakis E, Raoult D. Q fever. Vet Microbiol 2010;140(3-4):297-309.
  22. Houpikian P, Raoult D. Blood culture-negative endocarditis in a reference center: etiologic diagnosis of 348 cases. Medicine 2005;84(3):162-73.
  23. Fournier PE, Casalta JP, Habib G, Messana T, Raoult D. Modification of the diagnostic criteria proposed by the Duke Endocarditis Service to permit improved diagnosis of Q fever endocarditis. Am J Med 1996;100(6):629-33.
  24. Frankel D, Richet H, Renvois� A, Raoult D. Q fever in France, 1985-2009. Emerg Infect Dis 2011;17(3):350-6.
  25. Ft�cek P, Skult�ty L, Toman R. Phase variation of Coxiella burnetii strain Priscilla: influence of this phenomenon on biochemical features of its lipopolysaccharide. J Endotoxin Res 2000;6(5):369-76.
  26. Hotta A, Kawamura M, To H, Andoh M, Yamaguchi T, Fukushi H, et al. Phase variation analysis of Coxiella burnetii during serial passage in cell culture by use of monoclonal antibodies. Infect Immun 2002;70(8):4747-9.
  27. Jones RM, Nicas M, Hubbard AE, Reingold E. The infectious dose of Coxiella burnetii (Q Fever). Appl Biosaf 2006;11(1):32-4.
  28. Brooke RJ, Kretzschmar ME, Mutters NT, Teunis PF. Human dose response relation for airborne exposure to Coxiella burnetii. BMC Infect Dis 2013:21(13):488.
  29. Onul B, Uysalefe D. Q hummasının deri testleri vasıtasıyla teşhisi. T�rk İji Tec Biyol Der 1952:12(3);185-91.
  30. Johnson JE, Kadull PJ. Laboratory-acquired Q fever. A report of fifty cases. Am J Med 1966;41(3):391-403.
  31. Payzın S. T�rkiyede Q humması Epidemiyolojisi. T�rk İji Tec Biyol Der 1949;9(2);101-10.

İletişim (Correspondence):

Do�. Dr. Bekir �elebi,

Sağlık Bakanlığı, Halk Sağlığı Genel M�d�rl�ğ�,

Zoonotik ve Vekt�rel Hastalıklar Daire Başkanlığı,

Adnan Saygun Caddesi No: 55,

06100, Sıhhiye, Ankara, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 312 565 6382,

E-posta (E-mail): vetbekir@yahoo.com

Yazdır